PMAxx qPCR定量檢測梨火疫活菌方法的建立

摘要

本研究將改良的疊氮溴化丙錠（PMAxx）與熒光實時定量PCR技術（qPCR）相結合，開發(fā)出一種精準高效、靈敏特異的PMAxxqPCR檢測方法，用于梨火疫病菌Erwinia amylovora活細胞的定量檢測。通過控制變量的單因素變化試驗對PMAxx預處理體系中的各項參數(shù)進行優(yōu)化，確立了PMAxx終濃度為15 μmol/L，黑暗孵育時間為15 min，曝光時間為8 min的PMAxx預處理體系，可有效抑制1. 0×108 cfu/mL梨火疫死菌的DNA擴增，對梨火疫活菌DNA的擴增無影響。本文開發(fā)的PMAxxqPCR檢測技術可于特定范圍內(nèi)有效地排除死菌干擾，適用于菌液濃度在103～108 cfu/mL范圍內(nèi)的活菌數(shù)精準定量。為進一步深入探究梨火疫病的流行規(guī)律提供新的技術支持，并有效防止在實際樣本的PCR檢測中出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。

關鍵詞

梨火疫病; PMAxxqPCR檢測技術; 活菌檢測

中圖分類號：

S 436.612.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024448

Development of a PMAxxqPCR method for quantitative detection of viable Erwinia amylovora

HAN Wenchao1， XU Jingsheng1， HUANG Hongkun2， LI Zhiming1， YANG Xiaoxin1， XU Jin1*， FENG Jie1*

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 2. Rural Energy and Environment

Agency， Ministry of Agricultural and Rural Affairs， Beijing 100125， China）

Abstract

In this study， an improved propidium monoazide dye （PMAxx） was combined with quantitative realtime PCR （qPCR） to establish a rapid， sensitive， and highly specific method （PMAxxqPCR） for the quantitative detection of viable Erwinia amylovora cells， the causative agent of fire blight. Key parameters of the PMAxx treatment system were optimized through singlevariable tests. The optimal conditions were determined as a final PMAxx concentration of 15 μmol/L， dark incubation for 15 min， and light exposure for 8 min. Under these conditions， amplification of inactivated cells at a concentration of 1.0×108 cfu/mL was effectively suppressed， while amplification of viable cells was not affected. The PMAxxqPCR assay demonstrated reliable quantification of viable E.amylovora cells within the range of 103 to 108 cfu/mL， effectively eliminating interference from dead cells. This method provides robust technical support for epidemiological studies of fire blight and offers a solution to the issue of 1 positives in routine PCR diagnostics due to the presence of dead bacterial cells.

Key words

fire blight; PMAxxqPCR; viable cell detection

梨火疫?。╢ire blight）是由解淀粉歐文氏菌Erwinia amylovora，俗稱梨火疫病菌引起的蘋果和梨等薔薇科植物上最具毀滅性的細菌病害［1］。梨火疫病傳播速度快、危害嚴重，且系統(tǒng)性侵染的特性可致罹病植株死亡，嚴重暴發(fā)時造成毀園［2］。梨火疫病1780年首次于美國紐約州的哈德遜河流域被發(fā)現(xiàn)，隨后蔓延至西海岸的華盛頓州;此后的數(shù)十年間，漸次擴散蔓延至英國、法國、比利時、荷蘭等歐洲國家。歐洲和地中海植物保護組織（European and Mediterranean Plant Protection Organization，EPPO）官方數(shù)據(jù)顯示，目前梨火疫病廣泛分布于歐洲、美洲、大洋洲、非洲和亞洲的40多個國家［3］。作為我國的局部入侵物種，梨火疫病2016年在新疆霍城縣首次被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在新疆、甘肅兩個省區(qū)的70多個市縣區(qū)被發(fā)現(xiàn)，危害香梨、蘋果、杏、山楂、榅桲和杜梨等薔薇科寄主植物，并造成了重大的經(jīng)濟損失，被我國分別列入重大外來檢疫性有害生物名錄和一類病蟲害名錄［4］。

活的不可培養(yǎng)狀態(tài)（viable but nonculturable，VBNC）是細菌為應對逆境脅迫普遍采取的一種生存策略。即該狀態(tài)下的菌體細胞以最低的代謝水平維持其自身活力，但喪失了可人工培養(yǎng)的特性［56］。采用傳統(tǒng)平板分離的鑒定方法，因該細菌的VBNC狀態(tài)會造成假陰性檢測結果;PCR［7］等基于傳統(tǒng)體外擴增技術的檢測方法，因無法區(qū)分活細胞與死細胞的DNA，可導致假陽性檢測結果?；诰w細胞膜完整性［811］、代謝活性［12］與基因轉錄表達的檢測技術常被用于區(qū)分細菌的活細胞與死細胞。Viability qPCR（vqPCR）是目前被廣泛使用的活菌定量PCR檢測方法。該方法的原理為溴化乙錠單疊氮化物（ethidium monoazide bromide，EMA）［1314］、疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）［911］及其升級替代產(chǎn)品PMAxx［15］等具有DNA高親和性的光反應材料，經(jīng)過強光處理后，可穿透死菌或受損菌的細胞膜并與其雙鏈DNA分子形成共價氮鍵，進而阻礙DNA分子進行聚合酶鏈式反應。但該類光敏材料無法進入具完整細胞膜結構的活菌細胞內(nèi)，因此不影響活細胞DNA的PCR擴增反應［16］。再結合平板計數(shù)法，便可以很好地檢測VBNC狀態(tài)的細胞。

2006年，Ordax等［17］首次報道了銅離子可誘導梨火疫病菌進入VBNC狀態(tài)，且隨著銅離子濃度的升高，進入該狀態(tài)時間縮短。但迄今為止尚不明確自然條件下進入VBNC狀態(tài)的梨火疫病菌群體在梨火疫病侵染循環(huán)與傳播擴散中的作用。因此，本研究以梨火疫病菌致病相關核心基因hrpN為檢測靶標，旨在建立精準高效、靈敏通用的梨火疫病菌活細胞PMAxxqPCR檢測方法，為深入探究梨火疫病的生態(tài)流行學規(guī)律、偵檢阻斷病害隨帶菌苗木進一步擴散蔓延提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗所有供試菌株（表1）均由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所作物細菌病害組分離、保存。

1.2 主要試劑和儀器

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，酵母粉0.5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL;梨火疫病菌半選擇培養(yǎng)基（CCT semiselective medium）：蔗糖100 g，山梨醇10 g，營養(yǎng)瓊脂23 g，結晶紫2 mL。

儀器：590 W白熾燈購自德國Osram公司;ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystem公司;SPECORD40紫外分光光度計購自德國Analytik Jena AG公司;INFORS Ecotron 振蕩培養(yǎng)箱購自瑞士INFORS 公司;Memmert IN55培養(yǎng)箱購自德國美爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)、DNA提取與菌懸液制備

無菌條件下以接種環(huán)蘸取-80℃保存的各供試菌株懸浮液，梨火疫病菌、亞洲梨火疫病菌菌株于CCT培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，其他菌株于NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。28℃培養(yǎng)48 h后，采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取各參試菌株基因組DNA。挑取梨火疫病菌Ea1菌株典型單菌落，轉接至CCT培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8～1.0，比濁法［18］配制濃度為1.0×108 cfu/mL的菌懸液備用。100℃水浴30 min，獲得熱滅活的死菌細胞懸浮液。

1.3.2 熒光定量PCR檢測體系

以梨火疫病菌的10個核心致病基因為候選檢測靶標，使用Primer Express軟件設計引物和探針。最終根據(jù)GenBank中梨火疫病菌的hrpN基因部分保守序列設計一對引物和探針（表2），擴增產(chǎn)物片段大小為165 bp。以12個梨火疫病菌菌株與7個非靶標細菌測試所設計的探針和引物的通用性和特異性（ABI 7500型熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystem公司）。其中，12個供試梨火疫病菌菌株分離于不同寄主和地區(qū)（表1），對照為和梨火疫病菌從同一生境里分離出來的成團泛菌、黏質沙雷氏菌、枯草芽胞桿菌以及亞洲梨火疫病菌、茄科雷爾氏菌、熒光假單胞菌和番茄細菌性潰瘍病菌。將梨火疫病菌Ea1菌株的基因組DNA和菌懸液初始濃度調至50 ng/μL和1×108 cfu/mL，10倍梯度系列稀釋至5 fg/μL和1×102 cfu/mL。分別以不同濃度的DNA和菌懸液為模板，進行qPCR反應，測試所設計的探針和引物的靈敏度。PCR反應體系為（20 μL）：Probe qPCR Mix（2×）10 μL， 10 μmmol/L上、下游引物各0.4 μL，探針0.8 μL，ROX DyeⅡ（50×） 0.2 μL，模板2 μL，超純水6.2 μL。反應條件為：95℃預變性30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s（收集熒光信號），共40個循環(huán)。擴增完成后，以菌液濃度和DNA濃度的對數(shù)值為橫坐標，CT值為縱坐標，建立標準曲線。

1.3.3 PMAxx預處理體系優(yōu)化

母液濃度為20 mmol/L的PMAxxTM（PMAxxTM Dye，美國Biotum公司）使用前加入超純水稀釋，制成1 mmol/L的PMAxx工作液，-20℃避光保存。

1.3.3.1 PMAxx最佳濃度篩選

在避光條件下，將PMAxx分別加至含有200 μL濃度為108 cfu/mL的活菌和死菌懸浮液的離心管中，使PMAxx終濃度分別為0、4、8、10、15、25 μmol/L，輕輕振蕩混勻，錫箔紙包好在黑暗中孵育15 min后，曝光冰浴8 min，將處理過的菌液用TIANamp Bacteria DNA Kit提取菌懸液中DNA作為熒光定量PCR的模板，按1.3.2的方法進行qPCR。

1.3.3.2 PMAxx曝光時間的優(yōu)化

將PMAxx分別加至含有200 μL濃度為108 cfu/mL的死菌和活菌懸浮液的離心管中，使PMAxx終濃度為15 μmol/L（經(jīng)過篩選的最適濃度），隨即將其置于黑暗孵育15 min，分別曝光冰浴0、4、8、10、15、25 min，然后按照1.3.2的方法進行qPCR。

1.3.4 死、活細胞混合體系的PMAxxqPCR檢測

為了驗證PMAxxqPCR的準確性，將熱滅活菌和活菌按照不同的比例混合，得到活菌占比分別為0、10%、20%、50%、80%、100%的活菌死菌混合液，分別進行PMAxxqPCR和普通熒光定量qPCR檢測。菌懸液按照1.3.3.1方法處理，PMAxx最終濃度為15 μmol/L，黑暗孵育15 min，光解8 min。

另將比濁法配制的1.0×108 cfu/mL菌懸液10倍梯度稀釋，分別得到1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104 cfu/mL的菌懸液，按照優(yōu)化的PMAxx預處理體系對不同濃度的菌懸液進行處理，然后使用TIANamp Bacteria DNA Kit分別提取其基因組DNA，作為熒光定量qPCR的模板繪制標準曲線。

1.3.5 PMAxxqPCR檢測體系應用

從新疆伊犁采集5份梨火疫病株的葉片和花簇樣本。樣本經(jīng)表面消毒后，切取小塊病健交界處組織，以剪刀剪碎，于1 mL無菌水中浸泡30 min，使病原體充分釋放到水中，形成菌液，12 000 r/min離心15 min，去掉上清液后，再加入500 μL的滅菌水懸浮沉淀，以此作為目標模板來進行qPCR和PMAxxqPCR反應，同時在CCT培養(yǎng)基上進行稀釋涂板，通過比較這2種檢測方法的結果來評估本研究建立的檢測方法對梨火疫樣本的適用性。

2 結果與分析

2.1 熒光定量PCR檢測體系的建立、靈敏性及特異性測定

分別以不同濃度梯度的DNA和菌懸液為模板，進行qPCR反應。結果顯示，模板濃度不小于50 fg/μL或1×103 cfu/mL時，所有反應的CT值均小于35。因此，以DNA為檢測模板時，50 fg/μL為熒光定量PCR檢測的下限濃度;以菌懸浮液為模板時檢測下限為1×103 cfu/mL。以梨火疫病菌基因組DNA濃度的對數(shù)值為橫坐標，相應的CT值為縱坐標，構建得到的回歸方程為Y=-3.289 9X+34.951，R2=0.999，表明DNA濃度與CT值之間存在極佳的線性關系（圖1a）。以梨火疫病菌菌懸液濃度的對數(shù)值為橫坐標，相應的CT值為縱坐標，構建得到的回歸方程為Y=-3.307 4X+42.704，R2=0.999，表明菌懸液濃度與CT值之間存在極佳的線性關系（圖1b）。

以12個梨火疫病菌菌株和其他7種植物病原或環(huán)境菌株為測試對象，評價了所建立的qPCR檢測體系的通用性和特異性（表1）。結果表明：12個參試梨火疫病菌菌株樣品的CT值均在20以下，該體系可精準檢測到來源不同分離寄主的梨火疫病菌。所有對照菌株的CT值均大于35，判定為陰性檢測結果（圖2）。因此證明了該檢測體系具有高度的特異性和通用性?；谝陨辖Y果，我們證實熒光定量PCR技術能夠準確、靈敏地檢測梨火疫病菌的DNA和菌懸液樣品，并且后期研究中可以通過CT值來間接評估DNA濃度，為病害的早期診斷和監(jiān)測提供了有力的工具。

2.2 PMAxx預處理反應體系優(yōu)化

2.2.1 PMAxx最適濃度的篩選

用終濃度為0、4、8、10、15 μmol/L和25 μmol/L的PMAxx對108 cfu/mL的活細胞和死細胞進行懸浮處理，結果表明（圖3）：當PMAxx小于15 μmol/L時，隨著PMAxx濃度的增大，CT值也隨之增大，當PMAxx終濃度≥15 μmol/L，E.amylovora死細胞DNA的qPCR擴增CT值不再顯著升高（圖3），且當PMAxx終濃度為15 μmol/L時， E.amylovora活細胞幾乎不受影響。因此，當PMAxx終濃度為15 μmol/L時，既能完全抑制E.amylovora菌懸液死細胞DNA擴增，又對活細胞DNA擴增無顯著影響，表明PMAxx濃度為15 μmol/L時，可作為 PMAxxqPCR檢測區(qū)分E.amylovora純培養(yǎng)死、活細胞的最適濃度。

2.2.2 最佳曝光時間的篩選

在暗反應階段，本試驗將避光孵育的時間設定為15 min，以確保PMAxx能夠與死細胞中的DNA充分結合。通過設置不同的時間來篩選PMAxx預處理最佳的曝光時間，曝光時間優(yōu)化試驗表明（圖4），對熱滅活的梨火疫病菌死菌進行預處理時，當曝光時間小于8 min時，隨著曝光時間的延長，擴增的CT值顯著增加，這是因為在曝光過程中，隨著時間的延長，PMAxx與熱滅活菌死細胞DNA的交聯(lián)結合率升高，從而對死細胞DNA擴增的抑制作用增強，8 min后，隨著時間的延長，CT值不再顯著升高，說明曝光8 min可使得PMAxx與熱滅活菌死細胞的DNA最大程度地交聯(lián)，從而有效避免死細胞DNA的擴增，而隨著曝光時間的延長，活菌擴增的CT值無顯著變化，這是因為PMAxx不能進入到活細胞內(nèi)與DNA分子結合，而在曝光處理過程中被光解，并未對后續(xù)的熒光定量PCR產(chǎn)生影響。因此選擇8 min作為最佳的曝光時間。

2.3 PMAxxqPCR檢測不同比例的活菌

將不同比例的梨火疫活菌死菌混合，并分別以2 μL不同濃度的菌懸液樣本作為熒光定量qPCR的模板，繪制標準曲線。以梨火疫病原菌DNA濃度的對數(shù)值為橫坐標，CT值為縱坐標，建立回歸方程（圖5a），Y=-3.290X+41.53，R2=0. 999，且擴增效率良好。

將梨火疫病原菌不同濃度活細胞與死細胞等體積混合均勻，活細胞懸浮液百分比為100％、80％、50％、20％和10％，分別進行qPCR和PMAxxqPCR檢測。結果表明，直接進行qPCR時，無論活細胞比例如何變化，其CT值都呈現(xiàn)一個穩(wěn)定的趨勢，而經(jīng)PMAxx處理的死、活細胞體系，隨著活細胞比例下降，CT值呈現(xiàn)升高的趨勢，在18.75～28.10之間。且當活菌比例大于10％時，理論值與實測值之間呈良好的線性關系：Y=0.785 6X+1.556 7，R2=0.992（圖5b）。結果表明，PMAxxqPCR可以對菌懸液中的死、活細胞進行有效的區(qū)分，并對活細胞DNA選擇性地進行qPCR擴增;而直接qPCR檢測方法無法區(qū)分死、活細胞，導致檢測結果濃度高于實際活細胞濃度。

2.4 PMAxxqPCR檢測體系應用

預處理后的田間病株懸浮液樣品，分別采用qPCR與PMAxxqPCR技術對樣本進行了檢測，并同步實施了稀釋平板涂布法以進行微生物培養(yǎng)。結果顯示（表3），5份樣品qPCR檢測結果的CT值為19.79～34.75，而PMAxxqPCR所測的CT值則為 21.14～35.43，活菌數(shù)介于7.08×101～1.58×106 cfu/mL，PMAxxqPCR的檢測結果與平板涂布法的結果高度吻合（表3）。其中樣品1活菌數(shù)為2.24×102 cfu/mL，但平板分離未觀察到梨火疫病菌的菌落，以此推測該樣品已完全進入了VBNC狀態(tài)。因此該方法證實了PMAxxqPCR技術能夠特異性地識別并擴增活細胞內(nèi)的DNA，而平板分離法則可有效補充驗證了這一技術的有效性。

3 結論與討論

梨火疫病菌可侵染寄主植物的莖、葉、花、果實等幾乎所有器官，并形成系統(tǒng)侵染。梨火疫病的侵染循環(huán)緊密伴隨寄主植物的物候期。通常認為貫穿于寄主植物的整個休眠期，梨火疫病菌以休眠狀態(tài)在罹病植株的潰瘍斑中越冬［19］。早春季節(jié)隨著寄主的萌發(fā)，潰瘍斑中的病原菌隨之激活增殖成為重要初侵染源，并通過風雨與媒介昆蟲侵染花器，開啟新生長季的侵染循環(huán)［19］。相關研究表明，梨火疫病原菌可以在銅離子［16］、低溫［21］、次氯酸鈉［22］誘導下進入VBNC狀態(tài)，并可通過添加EDTA、檸檬酸、天冬氨酸以及回接寄主植物幼苗恢復進入VBNC狀態(tài)梨火疫病菌群體的可培養(yǎng)性［2324］。但迄今為止，梨火疫病菌是否能以VBNC狀態(tài)存活于僵果、土壤、隱癥寄主、非寄主植物以及蜂巢與蜂產(chǎn)品（蜂蜜、蜂蠟）中，以及VBNC狀態(tài)的梨火疫病菌群體在侵染循環(huán)發(fā)揮的作用均不明確。此外，噴灑抗生素、使用具殺菌活性的天然化合物及應用拮抗微生物是有效防控火疫病的重要策略［27］，但是這些脅迫因素某種程度上可誘導梨火疫病菌進入VBNC狀態(tài)［28］。

袁英哲等基于梨火疫病菌pEA29質粒設計了特異性引物EaP29F1/EaP29R1，建立了梨火疫病菌的PMAqPCR檢測方法［9］。但相關研究表明部分梨火疫病菌菌株中未攜帶pEA29質粒［18］，因此該方法缺乏通用性，且染料法qPCR也易造成假陽性的結果。Santander等［25］將PMA與Digtial PCR相結合，能有效區(qū)分梨火疫病菌的死、活細胞，但Digtial PCR系統(tǒng)成本昂貴且操作繁瑣，并不適用于大部分實驗室內(nèi)的定量檢測［26］。

本研究采用探針法，以管家基因為檢測靶標設計引物和探針。選取了10余個管家基因作為候選檢測靶標，最后在致病核心基因hrpN中篩選到一個具有高度通用性和特異性的新檢測靶標。同時選擇了較PMA具有更好區(qū)分死、活菌體細胞能力的PMAxx作為染料。研究結果顯示，PMAxx終濃度為15 μmol/L，是抑制108 cfu/mL濃度梨火疫死菌DNA擴增的最優(yōu)濃度，燈下曝光8 min為最優(yōu)曝光時間，以上結果與袁英哲等建立的梨火疫菌PMA預處理體系相比，減少了所使用的染料量和曝光時間，這可能與使用的染料不同有關。

綜上所述，本研究基于hrpN基因建立了精準高效、具高度特異性和通用性的梨火疫病菌PMAxxqPCR檢測方法。該方法能在特定濃度范圍內(nèi)（103～108 cfu/mL）準確測定活菌數(shù)目，為深入解析梨火疫病的生態(tài)流行學規(guī)律，準確評價殺菌劑防效以及帶菌苗木檢測提供了技術支撐。

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（責任編輯：田 喆）