火龍果中仙人掌X病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立及應(yīng)用

摘要

仙人掌X病毒（cactus virus X，CVX）嚴(yán)重威脅世界火龍果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為實(shí)現(xiàn)對(duì)該病毒的定量檢測(cè)，本研究根據(jù)CVX外殼蛋白（CP）的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物CVXF/R，建立了引物濃度150 nmol/L，退火溫度62℃的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該引物擴(kuò)增效率為97.38%，R2為0.996 5，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)極限濃度為8×102拷貝/μL，其靈敏度是普通PCR的100倍。對(duì)火龍果不同組織中CVX的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，病毒在花絲中的含量最高，之后依次為花萼、花瓣、嫩枝、老枝和根。對(duì)采自貴州黔南州的40份火龍果樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出32份陽性樣品。上述結(jié)果表明，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性強(qiáng)、靈敏度高，為今后CVX的檢測(cè)提供了重要的技術(shù)補(bǔ)充。

關(guān)鍵詞

仙人掌X病毒; 火龍果; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; 檢測(cè)

中圖分類號(hào)：

S 436.67

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024443

Establishment and application of a realtime fluorescence quantitative PCR assay for the detection of cactus virus X in pitaya

BAI Ziqin*， LUO Hui*， XIE Pu， ZHENG Wei， LIU Tao

（Fruit Research Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550000， China）

Abstract

Cactus virus X （CVX） poses a significant threat to global pitaya （dragon fruit） production. To enable accurate quantification of CVX， this study developed a realtime fluorescence quantitative PCR （RTqPCR） assay using SYBR Green I. Specific primers （CVXF/R） targeting the conserved region of the CVX coat protein （CP） gene were designed. The optimized assay conditions included a primer concentration of 150 nmol/L and an annealing temperature 62℃. The amplification efficiency was 97.38%， with a correlation coefficient value （R2） of 0.996 5. The assay had a detection limit of 8×102 copies/μL， exhibiting a 100fold greater sensitivity than conventional PCR assay. CVX titers in various pitaya tissues were quantified， with the highest viral load detected in filaments， followed by calyx， petals， young stems， mature stems and roots. Among 40 pitaya samples collected from Qiannan prefecture， Guizhou province， 32 tested positive for CVX using this RTqPCR method. These results demonstrate that the developed RTqPCR assay offers high sensitivity and strong specificity， providing an effective tool for CVX detection and epidemiological studies.

Key words

cactus virus X; pitaya; realtime fluorescence quantitative PCR; detection

火龍果Selenicereus undatus又名霸王花，為多年生攀援肉質(zhì)灌木，屬于仙人掌科Cactaceae蛇鞭柱屬 Selenicereus?；瘕埞a(chǎn)于中南美洲，因其易栽培，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益，目前廣泛種植于我國(guó)福建、廣東、廣西、海南、臺(tái)灣和貴州［1］。由于火龍果主要通過扦插無性繁殖，易于病毒的積累和傳播，因此病毒病害成為阻礙我國(guó)火龍果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。

仙人掌X病毒（cactus virus X，CVX）是馬鈴薯X病毒屬Potexvirus中一種桿狀、大小為520 nm×13 nm的正義單鏈RNA病毒［2］。CVX最早于1958年在德國(guó)的單刺仙人掌Opuntia monacantha上被發(fā)現(xiàn)［3］，隨后中國(guó)、委內(nèi)瑞拉、韓國(guó)、美國(guó)、馬來西亞等也相繼有該病毒發(fā)生的報(bào)道［48］，其中，我國(guó)于1996年首次在臺(tái)灣省檢測(cè)出CVX，目前已在海南和貴州省等火龍果產(chǎn)區(qū)流行，對(duì)火龍果的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重影響［4， 910］。CVX寄主廣泛，可通過嫁接、扦插或摩擦的方式侵染仙人掌、蟹爪蘭、曇花和火龍果等仙人掌科中幾十個(gè)屬的植物，以及香蕉等經(jīng)濟(jì)作物［1112］。除典型的系統(tǒng)性斑駁黃化外，CVX在不同寄主上還能產(chǎn)生不規(guī)則的褪綠暈圈、紅棕色邊緣的斑點(diǎn)、淺表凹陷壞死等癥狀［8］。

鑒于CVX與馬鈴薯X病毒屬的其他病毒造成的癥狀容易產(chǎn)生混淆，且目前缺乏有效的防治藥劑，因此使用無病毒種質(zhì)是防控CVX最重要的手段，而建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)CVX的防控具有重要意義［11］。目前已基于多種技術(shù)建立了CVX的檢測(cè)方法，其中包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RTPCR）和逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（reverse transcription loopmediated isothermal amplification，RTLAMP）［9，13］。但是這些方法都無法對(duì)CVX進(jìn)行定量分析。為此，本研究建立了一種基于SYBR Green Ⅰ的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，以期為CVX的早期預(yù)防、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)和定量研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

分別感染CVX，蟹爪蘭X病毒（Zygocatus virus X，ZyVX），仙人指X病毒（Schlumbergera virus X，SchVX）和火龍果X病毒（pitaya virus X，PiVX）的火龍果植株和1年生實(shí)生健康火龍果植株由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所保存。所有樣品經(jīng)RTPCR檢測(cè)后確定攜帶目標(biāo)病毒;火龍果不同組織中CVX的含量測(cè)定試驗(yàn)所用樣品于2024年6月在貴州省羅甸縣采集;田間樣品檢測(cè)所用40份表現(xiàn)黃綠色斑駁及不規(guī)則褪綠斑點(diǎn)的樣品于2023年6月-9月采集于貴州省羅甸、望謨、冊(cè)亨、鎮(zhèn)寧等縣。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

使用EASYspin Plus多糖多酚/復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取1.1中所述樣品總RNA后，利用PrimeScriptRT reagent Kit（TaKaRa）將獲得的總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增、克隆與測(cè)序

根據(jù)CVX分離株（BK011045）外殼蛋白（CP）的保守序列，使用Primer Explorer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物：CVXF：5′CCAAACCTTGTCCTCCTCCC3′和CVXR：5′GAAGACCCGTTGTCAAAGCA3′。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為180 bp。用NCBI的PrimerBLAST 進(jìn)行引物的特異性驗(yàn)證。反應(yīng)體系為：2×Green Taq Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司） 10 μL， CVXF/R（10 μmol/L）各0.3 μL，ddH2O 8.4 μL，1 μL cDNA。擴(kuò)增程序：95℃ 3 min;95℃ 20 s，62℃ 15 s，72℃ 20 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收試劑盒（TaKaRa）純化后連接到pGEMT Easy Vector（Promega），并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞（上海唯地生物技術(shù)有限公司）。經(jīng)PCR鑒定后隨機(jī)挑選3個(gè)陽性菌落送北京擎科生物科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 檢測(cè)體系的優(yōu)化

以CVX陽性樣品總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)PCR儀qTOWER3G IVD（德國(guó)Analytik Jena公司）進(jìn)行擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系包括：cDNA模板1 μL、BlasTaqTM 2×qPCR Master Mix（上海唯地生物技術(shù)有限公司） 10 μL、10 μmol/L CVXF/R（分別設(shè)置100、150、200 nmol/L共3個(gè)引物濃度），超純水補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min;95℃變性15 s，退火15 s（分別設(shè)58℃、60℃、62℃、64℃和66℃共5個(gè)退火溫度），72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。以熔解曲線峰單一且CT值小為標(biāo)準(zhǔn)，篩選最佳引物濃度及最佳退火溫度。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建

選擇序列正確的陽性克隆樣品用于質(zhì)粒提取。利用NanoDrop One/OneC微量UVVis分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司）測(cè)定質(zhì)粒濃度，并將其按10倍梯度稀釋成8×102～8×109拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建并計(jì)算擴(kuò)增效率［14］。

1.2.5 檢測(cè)體系特異性和靈敏度檢測(cè)

以分別感染ZyVX、SchVX和PiVX的火龍果植株總RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA用于CVX實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的特異性檢測(cè)。以8個(gè)濃度梯度（8×102～8×109拷貝/μL）的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板用于普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度檢測(cè)。

1.2.6 火龍果中CVX的空間分布

共采集9株經(jīng)RTPCR檢測(cè)為CVX陽性的火龍果植株不同組織（嫩枝、老枝、根、花瓣、花萼和花絲），每3株植株各組織混為1個(gè)樣品，共3個(gè)樣品，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。按照1.2.1中的方法，提取不同組織的總RNA。鑒于actin基因在火龍果中的表達(dá)量較高且穩(wěn)定［15］，且擴(kuò)增效率與CVX引物的相近（前者為98%，后者為97.38%），因此以actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列為actinF： 5′GCGGCAGACCACCTACAACTC3′和actinR： 5′GCGGATTCATCGT

ATTCACCC3′［16］，依據(jù)2-ΔΔCT計(jì)算不同組織CVX的相對(duì)表達(dá)量。采用Tukey檢驗(yàn)結(jié)果差異顯著性。

1.2.7 田間樣品檢測(cè)

2023年在貴州省黔南州火龍果產(chǎn)區(qū)，采集了40份表現(xiàn)斑駁癥狀，疑似感染病毒的火龍果樣品，采用普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RTPCR擴(kuò)增與克隆鑒定

以提取的火龍果植株總RNA為模板，用引物CVXF/R進(jìn)行RTPCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，部分樣品及陽性對(duì)照均能擴(kuò)增出1條大小為180 bp的特異性條帶，健康樣品無特異性擴(kuò)增。序列經(jīng)BLAST比對(duì)，其與CVX分離物（BK011045）相應(yīng)序列的相似性為100%，由此確定擴(kuò)增片段正確。

2.2 CVX實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化

以感染CVX植株的總RNA為模板，優(yōu)化引物濃度和退火溫度。所用引物濃度均為150 nmol/L，退火溫度62℃時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度最高，CT值最小（圖1），且熔解曲線為單一峰。后續(xù)試驗(yàn)均使用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，以8×102～8×109拷貝/μL濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板時(shí)，所得CT值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系。線性方程為y=-3.386 3x+39.612 （y為CT值，x為質(zhì)粒濃度的對(duì)數(shù)值），R2=0.996 5，擴(kuò)增效率為97.38%（圖2）。

2.4 特異性檢測(cè)

分別檢測(cè)感染CVX、ZyVX、SchVX、PiVX的火龍果樣品。結(jié)果顯示，僅有感染CVX的樣品出現(xiàn)了正常的擴(kuò)增曲線，其他樣品均無明顯擴(kuò)增曲線，且熔解曲線無峰，結(jié)果表明該方法可用于特異性檢測(cè)CVX（圖3）。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和普通PCR靈敏度比較

以準(zhǔn)備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR和普通PCR的靈敏度。結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)CVX的檢測(cè)限為8×102 拷貝/μL，普通PCR的檢測(cè)限為8×104 拷貝/μL。表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CVX的靈敏度為普通PCR的100倍（圖4）。

2.6 不同組織火龍果CVX相對(duì)表達(dá)量

為明確CVX在火龍果中的空間分布，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)火龍果病株嫩枝、老枝、根、花瓣、花萼和花絲的CVX相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)結(jié)果顯示花絲中CVX的相對(duì)表達(dá)量（25.71）最高，其次依次為花萼（5.12）、花瓣（2.83）、嫩枝（1.00）、老枝（0.43）和根（0.39）（圖5）。由此可見，花是最佳檢測(cè)部位，其次可選擇嫩枝進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 田間樣品檢測(cè)

應(yīng)用本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)采自黔南州羅甸、望謨、冊(cè)亨、鎮(zhèn)寧等縣的40份黃綠色斑駁及不規(guī)則褪綠斑點(diǎn)的枝條進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有32份樣品檢測(cè)出了CVX（表1），樣品CVX平均檢出率為80%。

3 結(jié)論與討論

CVX是危害火龍果的主要病毒之一，近年來在我國(guó)海南、貴州等多個(gè)火龍果產(chǎn)區(qū)蔓延，引起植株莖干斑駁黃化，樹勢(shì)減弱，產(chǎn)量和品質(zhì)降低，嚴(yán)重威脅了火龍果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［1，910］。因此對(duì)田間CVX的發(fā)生情況進(jìn)行早期的定量檢測(cè)與監(jiān)控具有十分重要的意義，目前國(guó)內(nèi)外尚無CVX的定量檢測(cè)方法。本研究以在植物病毒中較為保守的CP基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物，通過優(yōu)化引物濃度和退火溫度建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高的CVX實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法在以質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)R2為 0.996 5，擴(kuò)增效率為97.38%，且CT 值與其拷貝數(shù)顯示出良好的線性關(guān)系，這表明該體系具有較好的檢測(cè)效率。

在對(duì)40份田間樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法與普通PCR的檢測(cè)結(jié)果具有一致性。但前者能準(zhǔn)確檢測(cè)植株中CVX的含量，且更適用于對(duì)低豐度病毒樣品的檢測(cè)。此外，運(yùn)用此方法對(duì)6月-9月采集的田間樣品檢測(cè)結(jié)果表明，該方法檢測(cè)的樣品采集不受高溫季節(jié)的限制，為CVX的早期監(jiān)測(cè)、預(yù)警以及有效防控提供了重要的技術(shù)支撐。本研究在貴州火龍果產(chǎn)區(qū)采集樣品過程中，發(fā)現(xiàn)田間枝條病毒病癥狀普遍顯現(xiàn)，主要類型有系統(tǒng)性斑駁黃化、不規(guī)則褪綠暈圈或斑點(diǎn)、扭曲變紅、淺表凹陷壞死等，結(jié)合本研究中CVX在顯癥枝條上的平均檢出率結(jié)果，可初步判斷貴州火龍果產(chǎn)區(qū)已經(jīng)受到CVX威脅，因此今后在發(fā)展火龍果產(chǎn)業(yè)時(shí)應(yīng)加大對(duì)苗木/繁殖材料的監(jiān)管力度。

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（責(zé)任編輯：田 喆）