長鏈非編碼RNAMIATNB對小梁細胞自噬的調(diào)控作用及其機制

[摘要］目的探討長鏈非編碼RNA MIATNB（lncRNAMIATNB）對小梁細胞自噬的調(diào)控作用及其分子機制。方法采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測iHTM細胞和 GTM₃ 細胞中l(wèi)ncRNAMIATNB相對表達量。將iHTM細胞分為A1組（轉(zhuǎn)染siNC）與B1組（轉(zhuǎn)染siMIATNB），將 GTM₃ 細胞分為A2組（轉(zhuǎn)染siNC）與B2組（轉(zhuǎn)染 siMIATNB），使用Western bloting（WB）法檢測 lncRNA MIATNB 對以上各組小梁細胞自噬相關蛋白表達的調(diào)控。將iHTM細胞分為C1組（轉(zhuǎn)染siNC）和D1組（轉(zhuǎn)染siMIATNB），將 GTM₃ 細胞分為C2組（轉(zhuǎn)染 siNC）和D2組（轉(zhuǎn)染 siMIATNB），采用RT-qPCR方法檢測C1、D1組和C2、D2 組細胞中 m⁶A 相關蛋白基因的相對表達量;使用RT-qPCR和WB方法檢測iHTM細胞和 GTM₃ 細胞中IGF2BP1基因和蛋白的相對表達量；將iHTM細胞分為E1組（轉(zhuǎn)染siNC）與F1組（轉(zhuǎn)染siIGF2BP1），將 GTM₃ 細胞分為E2組（轉(zhuǎn)染siNC）與F2組（轉(zhuǎn)染siIGF2BP1），使用WB法檢測 IGF2BP1對小梁細胞中LC3B、p62、Beclin-1表達的調(diào)控；采用RNA免疫共沉淀技術(shù)（RNA-IP）檢測 m⁶A 關鍵閱讀蛋白IGF2BP1與IncRNAMIATNB的特異性結(jié)合能力。結(jié)果IncRNAMIATNB在 GTM₃ 細胞中的相對表達量較iHTM細胞顯著下降 （t=4.355，Plt;0.05） 。B1組與A1組、B2組與A2組比較，LC3B-Ⅱ/1比值顯著升高 t=3.062，6.399，Plt;0.05 ，Beclin-1相對表達量顯著升高 （t=5.454，4.139，Plt;0.05） ，p62蛋白的相對表達量則顯著下降 （t=4.799，4.796，Plt;0.05） 。D1組與C1組、D2組與C2組相比較，細胞中IGF2BP1相對表達量顯著降低 （t=3.003，3.832，Plt;0.05） ;D1組與C1組相比，其他 m⁶A 相關蛋白基因相對表達量比較差異無顯著性（ （Pgt;0.05 ），D2組與C2組相比，METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF3等基因的表達量顯著降低 （t=2.163～5.294，Plt;0.05） ，METTL3基因表達量顯著升高 （t=3.127，Plt;0.05） 。與iHTM細胞比較， GTM₃ 細胞中IGF2BP1mRNA和蛋白的表達量顯著下降 （t=3.636，3.485，Plt;0.05） 。F1組與E1組相比，F(xiàn)2組與E2組相比，LC3B- I/I 比值顯著升高 （t=10，910，6，399，Plt;0.05） ，Beclin-1相對表達量顯著升高（ t= 5.533，4.025，Plt;0.05），p62 蛋白的相對表達量顯著下降 （t=5.035，4.790，Plt;0.05） 。在 GTM₃ 細胞中IGF2BP1與IncRNAMIATNB特異性結(jié)合能力顯著弱于iHTM細胞 （t=3.803，Plt;0.05） 。結(jié)論小梁細胞中IncRNAMI-ATNB通過維持IGF2BP1表達抑制細胞過度自噬，其表達缺失可能通過 m⁶A 參與青光眼發(fā)病。

[中圖分類號] R775 [文獻標志碼] A

Regulatory effect of the long non-coding RNA MIATNB on autophagy in trabecular meshwork cells and its mechanismHOU Tianyu， YANG Xuejiao， ZHANG Jingjing， ZONG Yao，YANG Songkai， LEI Yanbei ， WU Ruofei，YANGXian（DepartmentofOphthalmology，TheAfiliated Hospitalof Qingdao University，Qingdao ，China）

[ABSTRACT] ObjectiveTo investigate the regulatory effect of the long non-coding RNA（lncRNA） MIATNB on autophagyintrabecular meshwork cellsandits molecular mechanism.MethodsRT-qPCR wasused tomeasure therelative expression le-vel of lncRNA MIATNB in iHTM and GTM₃ cells.The iHTM cells were divided into Al group （transfected with siNC） and Bl group （transfected with siMIATNB），and the GTM₃ cells were divided into A2 group （transfected with siNC） and B2 group （transfected withsiMIATNB）;Western bloting（WB）wasused toobservetheregulatory efect of IncRNA MIATNBon the expresionofautophagy-related proteinsintheabove groupsofTMcells.TheiHTMcellsweredividedintoC1group（transfected with siNC） and Dl group（transfected with siMIATNB），and the GTM₃ cells were divided into C2 group （transfected with siNC） and D2 group （transfected with siMIATNB）；RT-qPCR was used to measure the relative expression level of m⁶A -related genes in cells，and RT-qPCRand WB were used to measurethe relative mRNA and protein expression levels of IGF2BP1 iniHTMand GTM₃ cells.The iHTMcels were divided into E1 group （transfected with siNC）andF1 group（transfected with siIGF2BPl），and the GTM₃ cells were divided into E2 group（transfected with siNC）and F2 group （transfected with siIGF2BP1）；WB was used to measure theregulatory effectof IGF2BP1ontheexpresionofLC3B，p62，andBeclin-1inTMcels，andRNAco-immunoprecipitation（RNA-IP） was used to measure the specific binding capacity between the key m⁶A reader IGF2BP1 and lncRNA MIATNB.ResultsComparedwithiHTMcells，there wasa significant reduction in the relative expression level of lncRNA MIATNBin GTM₃ cells （t=4.355，Plt;0.05） . Compared with group A1/A2，group Bl/B2 had a significant increase in LC3B-ⅡI/I ratio （ ， （20 6.399，Plt;0.05 ，a significant increase in the relative expresson level of Beclin-1 （t=5.454，4.139，Plt;0.05） ，and a significant reduction in the relative expression level of p62 protein （t=4.799，4.796，Plt;0.05） . Compared with group C1/C2 ， group D1/D2 had a significant reduction in the relative expression level of IGF2BPl in cells （t=3.003，3.832，Plt;0.05） ，and there were no significant differences in the relative expression levels of other m⁶A genes between group Dl and group C1 （ ΔPgt;0.05Δ ）；compared with group C2，group D2 had significant reductionsin the expresson levels of the METTL14，F(xiàn)TO，ALKBH5，YTHDF1，and YTHDF3 genes （t=2.163-5.294，Plt;0.05） and a significant increase in the expression level of the METTL3 gene （ ：t=3.127，Plt;0.05; 》 Compared with iHTM cells， GTM₃ cells showed significant reductions in the mRNA and protein expresson levels of IGF2BP1 0 Φ_t=3.636，3.485 Plt;0.05 ）.Compared with group E1/E2 ，group F1/F2 had a significant increase in LC3B- ∥/I ratio Ψ_t= 10.910，6.399，Plt;0.05） ，a significant increase in the relative expression level of Beclin-1 （t=5.533，4.025，Plt;0.05） ，and a significant reduction in the relative expression level of p62 protein （t=5.035，4.790，Plt;0.05） . The specific binding capacity between IGF2BP1 and lncRNA MIATNB in GTM₃ cells was significantly weaker than that in iHTMcells （t=3.803，Plt;0.05） .ConclusionlncRNA MIATNB inibitsexcessveautophagyinTMcelsbymaintaining theexpressionofIGF2BP1，andtheabsentexpression of lncRNA MIATNB may be involved in the pathogenesis of glaucoma through m⁶A

[KEY WORDs]Glaucoma；RNA，long noncoding；Autophagy；RNA-binding proteins； Trabecular meshwork cels;IGF2BPl protein，human

青光眼是世界首位不可逆的致盲性眼病，小梁細胞功能障礙所導致的高眼壓是最主要的危險因素[1]。研究表明自噬在小梁細胞功能調(diào)控及青光眼發(fā)病中發(fā)揮重要作用，長期眼壓升高可對小梁細胞產(chǎn)生持續(xù)牽拉，青光眼患者眼內(nèi)氧化應激水平過高，均可誘導細胞發(fā)生自噬[2-4]，自噬的過度激活可能加劇小梁細胞功能障礙。然而，小梁細胞自噬調(diào)控的具體分子機制尚未完全闡明。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類重要的表觀遺傳調(diào)控分子，通過影響基因表達、RNA穩(wěn)定性及蛋白功能參與多種疾病的病理過程。近來研究表明，lncRNA的表達失調(diào)可能影響青光眼的發(fā)生發(fā)展[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNASNHG11可通過Rho/ROCK調(diào)控小梁細胞中 Wnt/β -catenin信號通路，影響細胞增殖、遷移、凋亡和自噬；在人角膜上皮細胞中，lncRNAMIATNB表達下調(diào)可以通過抑制自噬溶酶體降解而促進細胞凋亡7]

此外，N6-甲基腺苷 （m⁶A） 修飾是RNA最常見和最豐富的表觀遺傳修飾，它是指RNA中腺苷酸（A）第6位N上發(fā)生甲基化，是一個動態(tài)可逆的修飾過程，從催化形成到功能實現(xiàn)主要受 m⁶A 甲基轉(zhuǎn)移酶復合物，如甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（METTL3）、METTL14、 m⁶A 去甲基化酶[如脂肪肥胖相關蛋白（FTO）和alkB同系物5（ALKBH5）]和 m⁶A 讀取蛋白（主要包括 YTHDC1～2 和 YTHDF1～3. 調(diào)控，可通過影響RNA代謝調(diào)控細胞自噬[8-9]，但其在青光眼小梁細胞中的功能尚未明確。本研究擬利用永生化正常人小梁細胞（iHTM）和青光眼患者小梁細胞（ GTM₃ ），探究lncRNAMIATNB在小梁細胞自噬中的作用及其是否與 m⁶A 修飾有關，旨在進一步明確青光眼小梁細胞自噬相關的發(fā)病機制，為后續(xù)實驗奠定基礎。

1材料與方法

1.1 實驗材料

iHTM和 GTM₃ 細胞分別由加拿大魁北克市眼遺傳學和基因組學實驗室和美國德克薩斯州沃思堡愛爾康實驗室贈予。SYBRTM GreenqPCR MasterMix試劑盒購買于南京諾唯贊生物科技有限公司，GAPDH抗體購自美國CST公司，ULK1、Beclin-1、LC3B、p62、GAPDH等抗體購自艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司，IGF2BP1抗體購自美國Immuno-way公司，細胞轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine3OoO）購自美國Invitrogen公司，RNA免疫共沉淀試劑盒以及蛋白酶K購買于美國Millipore公司，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）及Westernblotting實驗所用儀器購買于美國Bio-Rad公司，siRNA（包括siNC、siMIATNB、siIGF2BP1）購買于蘇州吉瑪基因股份有限公司， IgG 購買于愛博泰克（武漢）生物科技有限公司。

1.2RT-qPCR方法檢測iHTM和 GTM₃ 細胞中l(wèi)ncRNAMIATNB的表達

將iHTM和 GTM₃ 細胞接種于6孔板中，使用完全培養(yǎng)基（含 15% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基）培養(yǎng) 24h ，嚴格按照RT-qPCR試劑盒說明書要求提取兩種細胞中RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR，采用 2^-ΔΔCT 法計算lncRNA MIATNB 相對表達量。引物名稱和序列見表1。

1.3 Westernblotting方法檢測敲低了lncRNAMIATNB后iHTM和 GTM₃ 細胞中自噬相關蛋白的表達

將iHTM細胞和 GTM₃ 細胞接種于6孔板中，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞融合度約達 60% 時，將iHTM細胞分為A1、B1組，將 GTM₃ 細胞分為A2、B2 組，在A1、A2組的細胞當中分別加入 5μL 的Lipofectamine 3000和 5μL 的siNC，B1、B2組細胞中分別加入 5μL 的Lipofectamine 3000 和 5μL 的siMIATNB，以上各組細胞均置于 、含體積分數(shù)0.05的 CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ^48h 后，使用蛋白裂解液裂解上述細胞 30min 。采用 Western blotting法獲取蛋白條帶，其中抗體孵育條件為：兔抗人Be-clin-1、LC3B、p62一抗 （1：2 000） 在 4^°C 下孵育過夜，次日將膜與山羊抗兔二抗 （1：10 000） 共同孵育^2h 。利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAP-DH為內(nèi)參，計算目標蛋白的相對表達量。實驗重復3次，結(jié)果取平均值。

1.4敲低lncRNA MIATNB 后iHTM和 GTM₃ 細胞中 m⁶A 修飾蛋白相關基因的表達

將iHTM細胞分為C1、D1組，將 GTM₃ 細胞分為C2、D2組，C1、C2組處理方法與A1、A2組細胞相同，D1、D2組與B1、B2組細胞相同。將上述細胞均置于 、含體積分數(shù) 0.05CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 。使用Trizol法提取細胞RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄和 RT-qPCR 。采用 2^-ΔΔCT 法計算目的基因的相對表達量。引物名稱和序列見表1。

1.5 iHTM和 GTM₃ 細胞中IGF2BP1mRNA和蛋白的檢測

將iHTM和 GTM₃ 細胞接種于6孔板中，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h ，采用 RT-qPCR和 Westernblotting方法檢測兩種細胞中IGF2BP1mRNA和蛋白相對表達量。RT-qPCR中所使用的IGF2BP1引物名稱和序列見表1。

1.6Westernblotting方法檢測敲低IGF2BP1后iHTM和 GTM₃ 細胞中自噬相關蛋白的表達

將iHTM和 GTM₃ 細胞接種于6孔板當中，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞融合度約達 60% 時，將iHTM細胞分為E1、F1組，同時將 GTM₃ 細胞分為E2、F2組。E1、E2組的細胞當中分別加入 5μL 的Lipofectamine3ooo以及 5μL 的siNC，F(xiàn)1、F2組細胞中分別加入 5μL 的 Lipofectamine 3000 和 5μL 的siIGF2BP1，以上各組細胞均置于 、含體積分數(shù) 0.05CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ^48h 后，使用蛋白裂解液裂解上述細胞 30min 。采用Westernblotting法獲取蛋白條帶，其中抗體孵育條件為：兔抗人Bec-lin-1、LC3B、p62一抗 （1：2000） 在 4^°C 下孵育過夜，次日將膜與山羊抗兔二抗 （1：10 000） 共同孵育^2h 。利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAP-DH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，結(jié)果取平均值。

1.7采用RNA免疫共沉淀（RNA-IP）技術(shù)檢測iHTM和 GTM₃ 細胞當中l(wèi)ncRNAMIATNB以及IGF2BP1蛋白的特異性結(jié)合能力

將iHTM和 GTM₃ 細胞接種于直徑 10cm 培養(yǎng)皿中，待融合度約達 90% 時，將iHTM細胞分為iHTM- ?IgG 組、iHTM-IP組和iHTMinput組，并將 GTM₃ 細胞分為 GTM₃-IgG 組、 GTM₃-IP 組和GTM₃ input組。以預先預冷的PBS清洗細胞2次后轉(zhuǎn)移到離心管中，置于 4^°C 下 1 500r/min 離心2min ，棄上清液，加入RIPA裂解液裂解細胞后，于iHTM-IgG組和 GTM₃-IgG 組中加入吸附有 IgG 的磁珠，iHTM-IP組和 GTM₃-IP 組中加入吸附有IGF2BP1抗體的磁珠，iHTMinput組和 GTM₃ in-put組不進行處理。嚴格按照美國Millipore公司MagnaRIPKit說明書提取各組裂解液中RNA，用酶標儀測定RNA濃度后進行RT-qPCR實驗，實驗重復3次。采用 2^-ΔΔCT 法計算lncRNA MIATNB相對表達量，以iHTM-IP組/iHTM-IgG組細胞中l(wèi)ncRNAMIATNB相對表達量比值來表示iHTM細胞中l(wèi)ncRNAMIATNB與IGF2BP1特異性結(jié)合能力，同樣以 GTM₃-IP 組與 GTM₃-IgG 組中的lncRNAMIATNB相對表達量比值來表示 GTM₃ 細胞當中l(wèi)ncRNAMIATNB與IGF2BP1特異性結(jié)合能力。

1.8 統(tǒng)計學處理

使用GraphPadPrism9.O軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計量資料以 x±s 表示，兩組間比較采用非配對 Student's t 檢驗。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 iHTM和 GTM₃ 細胞中l(wèi)ncRNAMIATNB的表達

lncRNAMIATNB在iHTM和 GTM₃ 細胞中相對表達量分別為 1.01±0.05，0.51±0.19，GTM₃ 細胞當中l(wèi)ncRNAMIATNB的表達水平顯著低于iHTM細胞 （t=4.355，Plt;0.05） 。

2.2敲低lncRNA MIATNB 后iHTM和 GTM₃ 細胞中自噬相關蛋白的表達

Bl組與A1組、B2組與A2組比較，iHTM細胞和 GTM₃ 細胞中LC3B-ⅡI/I比值、Beclin-1相對表達量均顯著升高 （t=3.062～6.399 . Plt;0.05） ，p62蛋白相對表達量均顯著下降（ Φ_t=4.799，4.796 Plt;0.05） 。見圖1、表2。

2.3 敲低lncRNAMIATNB后iHTM和 GTM₃ 細胞中 m⁶A 修飾蛋白相關基因的表達

D1組與C1組比較，細胞中IGF2BP1相對表達量顯著降低 （t=3.003，Plt;0.05） ，其他 m⁶A 修飾蛋白相關基因相對表達量比較差異無顯著性（ ??Pgt; 0.05）。D2組與C2組進行比較，細胞中IGF2BP1、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF3相對表達量顯著降低 （t=2.163～5.294，Plt;0.05） ，METTL3的相對表達量顯著升高 （t=3.127，Plt; 0.05），YTHDF2、YTHDC1相對表達量無顯著變化 （Pgt;0.05） 。見表3。

2.4iHTM和 GTM₃ 細胞中IGF2BP1mRNA和蛋白相對表達量比較

iHTM細胞和 GTM₃ 細胞中IGF2BP1mRNA的相對表達量分別為 1.01±0.19 和 0.60±0.05 IGF2BP1蛋白的相對表達量分別為 1.00±0.12 和0.75±0.05 ，見圖2。與iHTM細胞相比， GTM₃ 細胞中 和蛋白相對表達量均顯著下降 （t=3.636，3.485，Plt;0.05） 。

2.5敲低IGF2BP1后iHTM和 GTM₃ 細胞中自噬相關蛋白的表達

F1組與E1組相比，F(xiàn)2組與E2組相比，LC3B-∥/I 比值均顯著升高 （t=10.910，6.399，Plt;0.05） ，Beclin-1相對表達量顯著升高 （t=5.533，4.025，Plt;0.05），p62相對表達量顯著下降 （t=5.035，4.790） ，Plt;0.05） ，見圖3、表4。

2.6iHTM 細胞和 GTM₃ 細胞中l(wèi)ncRNAMIAT-NB和IGF2BP1蛋白的特異性結(jié)合能力

RNA-IP檢測結(jié)果顯示，iHTM-IP組與iHTM-IgG 組的lncRNAMIATNB的相對表達量比值為66.97±7.96，GTM₃-IP 組與 GTM₃-IgG 組的 cRNAMIATNB相對表達量比值為 47.62±3.79 ，在iHTM和 GTM₃ 細胞當中，lncRNAMIATNB與IGF2BP1兩者均可以特異性結(jié)合，特異性結(jié)合能力在 GTM₃ 細胞中弱于在iHTM細胞中 （t=3.803 ，Plt;0.05） 。

3討論

小梁網(wǎng)是房水外流的關鍵部位，小梁細胞功能障礙會導致房水排出受阻，進而引起眼壓升高和青光眼[10]。自噬過度激活可能導致小梁網(wǎng)細胞外基質(zhì)降解異常及房水流出阻力增加[11]。以往研究顯示，lncRNA可以通過調(diào)控小梁細胞功能，在青光眼的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用[6，12-13]。如敲低小梁細胞中的lncRNAPVT1或過表達 miR–29a–3p 后，可以顯著抑制VEGFA、MMP-2、ICAM-1及 α-SMA 的表達，改善小梁細胞的功能障礙，減少細胞的凋亡，促進細胞的遷移[12]；當小梁細胞當中的lncRNASNHG11水平降低以后，可以通過Rho/Rock信號通路，誘導小梁細胞發(fā)生凋亡以及自噬[；lncRNAENST00000523905通過調(diào)控TP53INP1增強小梁細胞的自噬，從而抑制氧化應激狀態(tài)下細胞外基質(zhì)的生成[13]。本研究首次將lncRNAMIATNB功能與 m⁶A 關聯(lián)，為lncRNA對小梁細胞功能的調(diào)控提供了新的靶點。

本研究結(jié)果顯示，青光眼小梁細胞（ GTM₃ ）當中l(wèi)ncRNAMIATNB的表達與永生化的小梁細胞（iHTM）相比較顯著下調(diào)，于是后續(xù)通過敲低小梁細胞當中l(wèi)ncRNAMIATNB的表達，檢測細胞中LC3B、p62和Beclin-1等蛋白的表達來衡量小梁細胞自噬水平。一般來說，自噬活性依賴于自噬底物p62的消耗和自噬體LC3B的形成，LC3B蛋白在自噬過程中起著重要作用，在自噬體形成時會被加工，從LC3B-I轉(zhuǎn)化為LC3B-Ⅱ，并定位到自噬體膜上[14]。LC3B-Ⅱ／I比值的升高意味著自噬體的生成增多，即自噬活性增強；Beclin-1是自噬起始的關鍵調(diào)控因子，其表達升高提示著自噬啟動信號的增強[14]。LC3B-ⅡI／I比值與Beclin-1同時升高通常表明自噬活性增強。本研究結(jié)果顯示，在iHTM細胞和 GTM₃ 細胞中敲低lncRNAMIATNB可以提高自噬標志物LC3B- ∥/I 及Beclin-1的表達，并減少p62的表達，說明敲低lncRNAMIATNB，可以起到促進小梁細胞自噬作用。

RNA甲基化形成的 m⁶A 通過動態(tài)調(diào)控RNA的代謝過程，包括剪接、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運及翻譯，廣泛參與基因表達的轉(zhuǎn)錄后修飾及細胞增殖以及死亡調(diào)控等過程[15]。常見的 m⁶A 修飾蛋白相關基因有MET-TL3、METTL14、ALKBH5、FTO、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、IGF2BP1。以往研究發(fā)現(xiàn)，過表達的METTL3可以抑制眼球缺血再灌注模型小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的自噬[16]，過表達的YTHDF2可以促進高糖人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的自噬[17]， FTO 能夠去除自噬相關基因ULK1的 3^′ -UTR上 m⁶A 修飾，抑制ULK1的降解，從而促進細胞自噬9]，提示 m⁶A 修飾與細胞自噬密切相關。本研究中，在iHTM細胞和 GTM₃ 細胞中敲低lncRNAMIATNB后，檢測 m⁶A 修飾蛋白相關基因的表達，結(jié)果顯示IGF2BP1是受lncRNAMI-ATNB敲低影響最大的基因；另外，與iHTM細胞相比， GTM₃ 細胞中IGF2BP1mRNA和蛋白相對表達量均顯著下降。但本研究在 GTM₃ 細胞中敲低lncRNAMIATNB后，結(jié)果顯示，在 m⁶A 修飾蛋白相關基因當中，除IGF2BP1表達量顯著下降之外，METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF3等基因相對表達量也顯著降低，而METTL3相對表達量顯著升高。這可能是由于在青光眼疾病繼續(xù)惡化過程中，除自噬進程外，小梁細胞會選擇凋亡等其他細胞死亡形式[1.3]，因此后續(xù)只選擇IGF2BP1作為調(diào)節(jié)自噬最主要的 m⁶A 修飾蛋白相關基因。

為進一步明確IGF2BP1對小梁細胞功能的作用，本研究檢測自噬相關蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，敲低IGF2BP1后，iHTM細胞和 GTM₃ 細胞中自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/I比值、Beclin-1相對表達量均顯著升高， p62 相對表達量均顯著下降。以上結(jié)果提示IGF2BP1表達量下調(diào)會促進小梁細胞自噬，導致小梁細胞功能障礙，從而參與青光眼的發(fā)生與發(fā)展過程。IGF2BP1可以通過其KH3-4雙結(jié)構(gòu)域識別富含“GGAC”的 m⁶A 基序，從而促進RNA的穩(wěn)定性和翻譯表達[18]。在lncRNAMIATNB的序列中，其40、70及848號位的腺苷，符合“GGAC\"基序中腺昔的位點要求，尤其是70號位點的 m⁶A 腺苷最有可能被IGF2BP1蛋白識別并且結(jié)合。因此在最后，本研究又通過RNA-IP技術(shù)檢測了 cRNAMIATNB與IGF2BP1是否存在著特異性結(jié)合，結(jié)果顯示，在iHTM細胞和 GTM₃ 細胞中，lncRNAMIATNB與IGF2BP1均可以特異性結(jié)合，并且在 GTM₃ 細胞當中l(wèi)ncRNAMIATNB與IGF2BP1的特異性結(jié)合能力顯著低于iHTM細胞，這可能是由于 GTM₃ 細胞中IGF2BP1或lncRNAMIATNB低表達所導致。lncRNAMIATNB與IGF2BP1特異性結(jié)合表明兩者分子間密切相互作用，這提示IGF2BP1可能是lncRNAMIATNB調(diào)節(jié)小梁細胞自噬的一個關鍵蛋白。

綜上，小梁細胞中l(wèi)ncRNAMIATNB可通過維持IGF2BP1表達水平抑制細胞自噬過度激活，lncRNAMIATNB下調(diào)可能導致青光眼病理進展；同時lncRNAMIATNB通過調(diào)控 m⁶A 修飾蛋白相關基因IGF2BP1的表達抑制小梁細胞自噬活性，進而參與青光眼發(fā)病的分子機制。這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)基于RNA表觀遺傳調(diào)控的青光眼治療策略提供了新的思路和數(shù)據(jù)參考。

作者聲明：侯天宇、楊雪嬌、楊先參與了研究設計；侯天宇、楊先、楊雪嬌、張京京、宗瑤、楊淞凱、雷妍蓓、吳若霏參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）