IRGM在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

[中圖分類號]R375.34 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

Expression of immune-related guanosine triphosphatase M in colorectal cancer and its association with clinicopathological features and prognosisLI Na，RAN Wenwen ， ZHAO Han， XING Xiaoming（Department of Pathology，School of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266O71，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate theexpressioncharacteristicsof immune-related guanosine triphosphatase M（IRGM）incolorectalcancer（CRC）tisueanditsasociationwithclinicopathologicalfeaturesand prognosis.MethodsFreshtumor tissuesamplesandthecoresponding paracancerous normal tissuesamples werecollctedfrom16patientswhounderwentradical resectionfor CRCin The Afiliated Hospitalof Qingdao University，andRT-qPCR was used to measure themRNA expressionlevel of IRGM.Postoperativeparafi-embedded tumor tisue samples and thecorresponding paracancerous normal tisue samples were colectedfrom143CRCpatientswhoweretreatedinTheAfliatedHospitalofQingdaoUniversity，andimmunohistochemicalstaining wasused tomeasuretheproteinexpressonlevelofIRGM;theassociationoftheprotein expresionlevelofIRGMwithclinicopathological featuresandprognosis wasanalyzed.ResultsThemRNAexpresionlevelof IRGM in paracancerous normal tissue was significantly higher than that in CRC tumor tissue （ ）. The protein expression level of IRGM in paracancerous normal tissue was also significantly higher than that in CRC tumor tissue ?χ²=23.738，Plt;0.05? . The low expression of IRGM in CRC tumor tissue was significantly associated with lymph node metastasis and vascular tumor thrombus （ χ²=9.827，7.690 ， （20 Plt;0.05 ）.The survival analysis showed thatthe expression level of IRGMhad no significantcorrelation with overallsurvival rate or disease-free survival rate in CRC patients （ ΔPgt;0.05 ）.ConclusionThe expression level of IRGM is significantly downregulatedin CRCtissue；thelowexpressonof IRGMis closelyasociated with lymphnode metastasisandvasculartumorthrombus， whileitisnotsignificantlyassociatedwithteoverallsurvivalrateanddiseasefreesurvivalrateofptients，sugestingthat IGM may become a potential target for the treatment of CRC.

[KEYWORDs]Colorectal neoplasms; GTP-binding proteins;Lymphatic metastasis；Neoplasm invasiveness; Immunohisto chemistry;Prognosis;Pathological conditions， signs and symptoms

結(jié)直腸癌（colorectalcancer，CRC）作為全球高發(fā)的惡性腫瘤，其早期診斷和治療策略雖不斷進(jìn)步，但轉(zhuǎn)移性病變的出現(xiàn)仍是導(dǎo)致患者治療失敗和死亡的主要原因[1-2]。目前，根治性切除聯(lián)合化療、放療或靶向治療是CRC的主要治療方法，然而對于轉(zhuǎn)移性CRC 患者而言，治療效果并不理想[3-4]。因此，尋找更有效的CRC治療靶點(diǎn)，開發(fā)新的治療策略對提高CRC患者生存預(yù)后至關(guān)重要。

IRGM基因位于人類5號染色體上，包含1個較長的第一外顯子（編碼181個氨基酸）及4個較短的推定外顯子[5]。作為GTPase蛋白家族的成員，IRGM通過N端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)GTP結(jié)合與水解，C端結(jié)構(gòu)域調(diào)控蛋白互作與亞細(xì)胞定位，共同協(xié)調(diào)下游信號傳導(dǎo)[6-8]。該蛋白具有雙重生物學(xué)功能：一方面通過單核巨噬細(xì)胞溶酶體途徑促進(jìn)胞內(nèi)病原體清除并參與固有免疫[9-10]；另一方面通過調(diào)控線粒體動力學(xué)、介導(dǎo)ULK1-Beclin1復(fù)合體組裝等途徑增強(qiáng)細(xì)胞自噬[11-12]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，IRGM可以通過抑制NLRP3炎性小體的活化從而緩解炎癥性腸病[13-16]。IRGM在食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)，并通過增強(qiáng)自噬在體外促進(jìn)人食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[17]。然而，IRGM在CRC中的表達(dá)特征及其臨床意義尚未完全闡明。本研究旨在檢測CRC患者腫瘤組織中IRGM的表達(dá)水平，為CRC的精準(zhǔn)診斷與潛在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月—2018年12月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院行CRC根治性切除術(shù)、術(shù)前未接受新輔助治療且無其他部位惡性腫瘤的143例患者的CRC腫瘤及癌旁正常組織石蠟標(biāo)本，同時收集患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤大小、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯及脈管癌栓等方面的臨床病理特征資料，其中患者年齡、腫瘤大小按中位數(shù)分組；以電話方式進(jìn)行隨訪，記錄所有患者的總體生存期（從手術(shù)開始至全因死亡的時間）和無病生存期（從手術(shù)開始至首次發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移或全因死亡的時間），以計算總體生存率及無病生存率。隨訪截至2023年12月1日。收集2023年5月—2023年7月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院行CRC根治性切除術(shù)的16例患者的CRC腫瘤組織和癌旁正常組織的新鮮組織樣本。

1.2免疫組化（IHC）染色檢測CRC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中IRGM蛋白表達(dá)情況

取143例CRC患者的腫瘤組織和癌旁正常組織石蠟標(biāo)本，制備成孔徑 2.0mm 、厚度 4μm 的組織芯片。再經(jīng)脫蠟水化后，EDTA高壓加熱修復(fù)2min ，加人過氧化氫溶液反應(yīng) 10min ，血清封閉10min 。IRGM一抗 [1：500 ，艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司，貨號 PS08476]4^°C 孵育過夜，二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號PV-6000）37°C 孵育 30min ，DAB顯色 1min ，于顯微鏡下觀察細(xì)胞的染色情況。IRGM表達(dá)評定基于顯微鏡下觀察的細(xì)胞漿/膜染色程度：棕黃色或棕褐色為高表達(dá)，無著色或淡黃色為低表達(dá)。

1.3實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測CRC患者腫瘤組織和癌旁正常組織當(dāng)中IRGMmRNA表達(dá)水平

使用RNA提取試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，貨號TCH022）從16例CRC患者的腫瘤組織及其配對的癌旁正常組織中提取mRNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，貨號RR037Q）將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后，使用SYBRGreen試劑（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，貨號6210）在熒光定量PCR儀[賽默飛世爾（上海）分析儀器有限公司，貨號202232702]上進(jìn)行檢測。反應(yīng)程序： 60s;共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCT 方法計算目的基因的相對表達(dá)量。PCR 引物購買于上海吉凱基因有限公司，正向引物序列為：5^′ -CAATGGGATGTCCACCTTCAT- ?3^′ ，反向引物序列為： 5^′ -CCAGGCAGGTCCCACAAC- 3^′ 。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS26.O軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以 表示，組間比較采用配對 Ψ_tΨ_Ψ 檢驗(yàn)，計數(shù)資料以例（率）表示，組間比較采用McNemar檢驗(yàn)；采用Pearson X² 檢驗(yàn)分析CRC腫瘤組織IRGM蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，使用Kap-lan-Meier法以及Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析；以Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1CRC患者腫瘤組織與癌旁正常組織中IRGMmRNA表達(dá)水平比較

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，腫瘤組織和癌旁正常組織中 表達(dá)水平分別為 1.92±0.41 、4.80±0.85 ，兩者比較差異有顯著性 Ω^′=2.836，Plt; 0.05）。

2.2CRC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中IRGM的IHC染色結(jié)果

IHC染色結(jié)果顯示，CRC患者的腫瘤組織以及癌旁正常組織中IRGM蛋白均定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中。143例CRC患者的腫瘤組織中，IRGM高表達(dá)者58例 （40.6%） ，低表達(dá)者85例 （59.4%） ；癌旁正常組織中，高表達(dá)者99例 （69.2%） ，低表達(dá)者44例 （30.8% ），CRC患者腫瘤組織中IRGM高、低表達(dá)者相比較，差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（ χ²= 23.738，Plt;0.05） 。見圖1。

2.3腫瘤組織中IRGM蛋白表達(dá)水平與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系

CRC患者腫瘤組織當(dāng)中IRGM低表達(dá)者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓的比例顯著高于高表達(dá)者（χ²=9.827，7.690 ！ Plt;0.05 ），IRGM高、低表達(dá)者在性別、年齡及腫瘤分化程度、神經(jīng)侵犯情況、TNM分期及大小方面比較，差異均無顯著性 （Pgt;0.05） 。見表1。

A：癌旁正常組織中IRGM蛋白高表達(dá)；B：CRC腫瘤組織中IR-GM蛋白低表達(dá)；IHC染色，放大100倍

2.4腫瘤組織中IRGM表達(dá)水平與CRC患者預(yù)后的關(guān)系

143例CRC患者隨訪 1～60 月，隨訪中位時間35（21，52）月。在隨訪過程中，20例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中共計36例患者死亡。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CRC患者腫瘤組織中IRGM表達(dá)水平與患者總體生存率及無病生存率均無顯著相關(guān)性 （Pgt;0.05） 。見圖2。

3討論

CRC的高度侵襲性和易轉(zhuǎn)移的特性是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因[18]。盡管近年來分子靶向治療和免疫治療均取得了一定進(jìn)展，但治療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)仍是臨床面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)[4]。因此，深入探索CRC發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，鑒定參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵分子，并評估其作為預(yù)后標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)的潛力，對實(shí)現(xiàn)CRC的精準(zhǔn)治療至關(guān)重要。

IRGM屬于干擾素誘導(dǎo)的GTPase超家族成員，具有促進(jìn)自噬和抑制先天免疫反應(yīng)的作用[19]，是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。有體外研究顯示，IRGM在人肝癌細(xì)胞、人黑色素瘤細(xì)胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，敲低人肝癌細(xì)胞中的IRGM后，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加，在人黑色素瘤細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)IR-GM后，促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力[20-23]。本研究的RT-qPCR技術(shù)檢測顯示結(jié)果，與癌旁正常組織相比，CRC患者腫瘤組織中IRGMmRNA相對表達(dá)水平顯著降低。免疫組化檢測結(jié)果顯示，CRC腫瘤組織中IRGM低表達(dá)比例顯著高于癌旁正常組織。進(jìn)一步對腫瘤組織中IRGM蛋白表達(dá)水平與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析顯示，IRGM低表達(dá)患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓的發(fā)生比例顯著高于IRGM高表達(dá)組。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓形成是反映CRC侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵指標(biāo)。因此，腫瘤組織中IRGM的表達(dá)下調(diào)，可能與其促進(jìn)CRC局部（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）和遠(yuǎn)處（脈管侵犯）播散相關(guān)。其他的研究結(jié)果也顯示，IRGM基因缺失導(dǎo)致TRAF6先天免疫信號通路過度激活，在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中引發(fā)持續(xù)且過度的促炎信號傳導(dǎo)，最終促成del5q骨髓增生異常綜合征的發(fā)生[24]，但是關(guān)于具體機(jī)制，還需要進(jìn)一步探索。

既往研究提示IRGM可作為黑色素瘤和肝細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物，研究者通過建立Cox比例風(fēng)險模型分析結(jié)果顯示，IRGM蛋白高表達(dá)會顯著增加患者死亡風(fēng)險，致總生存期縮短，患者預(yù)后不佳[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者的總體生存率和無病生存率與腫瘤組織IRGM蛋白表達(dá)水平之間無顯著統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)。分析原因可能是由于本研究隊列的樣本量較小及中位隨訪時間較短，從而影響了統(tǒng)計分析的結(jié)果，難以揭示遠(yuǎn)期預(yù)后差異。

綜上所述，本研究顯示IRGM在CRC組織中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓形成相關(guān)，但與總體生存率及無病生存率未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性。該結(jié)果為揭示CRC的病理機(jī)制提供了新視角，提示IRGM可能是CRC治療的潛在靶點(diǎn)。然而，其確切的預(yù)后價值及作為獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物的可行性，仍需通過更大規(guī)模的前瞻性隊列研究及深入的分子機(jī)制探索予以驗(yàn)證。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準(zhǔn)（文件號QYFYWZLL29212）。所有試驗(yàn)過程均遵照《青島大學(xué)附屬醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)》的條例進(jìn)行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：李娜、再雯雯、趙涵、邢曉明參與了研究設(shè)計；李娜、邢曉明參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯耿波）