RAD51蛋白對卵巢癌新輔助化療敏感性的影響

[摘要］目的探討RAD51蛋白對卵巢癌新輔助化療（NACT）敏感性的影響。方法取2017年6月—2019年6月于青島大學附屬醫(yī)院婦科行NACT + 中間型腫瘤細胞減滅術(shù)治療的47例晚期高級別漿液性卵巢癌（HG-SOC）患者 NACT前腫瘤穿刺組織，采用免疫組化法檢測腫瘤組織中RAD51蛋白表達水平，并分析其表達水平與患者NACT敏感性的關(guān)系。將SKOV3細胞（分為 a～f 組）和SKOV3-順鉑（DDP）耐藥細胞（分為 A～F 組）中 b～ f組和 B～F 組分別轉(zhuǎn)染 NC-siRNA、siRNA-RAD51-264、siRNA-RAD51-416、siRNA-RAD51-608、siRNA-RAD51-807，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測SKOV3細胞和 SKOV3-DDP 耐藥細胞中 表達水平。將SKOV3-DDP耐藥細胞分為 SKOV3-Control 組（對照組）、SKOV3-DDP-Control 組（DDP 對照組）、SKOV3-DDP-NC-siRNA 組（轉(zhuǎn)染 NC-siRNA）、SKOV3-DDP-siRNA-RAD51 組（轉(zhuǎn)染 siRNA-RAD51），Western blotting 方法檢測各組細胞中RAD51蛋白表達水平。將 SKOV3-DDP耐藥細胞分為NC-siRNA 組（轉(zhuǎn)染NC-siRNA）和 siRNA-RAD51組（轉(zhuǎn)染siRNA-RAD51-264），分別加入 0.39，0.78，1.56，3.12，6.25，12.50，25.00mg/L 濃度的DDP處理^48h ，CCK-8實驗檢測 SKOV3-DDP耐藥細胞轉(zhuǎn)染后細胞活力。將 SKOV3-DDP耐藥細胞分為Control組（對照組）、NC-siRNA 組（轉(zhuǎn)染 NC-siRNA）、siRNA-RAD51 組（轉(zhuǎn)染 siRNA-RAD51）、siRNA-RAD51 + DDP組（轉(zhuǎn)染siR-NA-RAD51十DDP 處理），流式細胞術(shù)檢測 SKOV3-DDP 耐藥細胞周期的變化和細胞凋亡率。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，卵巢癌組織中RAD51蛋白高表達組和低表達組患者的年齡、FIGO分期（Ⅲ期或N期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腹水情況及首次血清CA125水平比較差異無顯著性（ Pgt;0.05 ，化療敏感組和不敏感組患者腫瘤組織中RAD51蛋白表達水平比較差異有顯著性 （Υ²=10.85，Plt;0.05） 。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，SKOV3-DDP細胞中RAD51mRNA相對表達水平顯著高于SKOV3細胞 （t=6.73，Plt;0.05），c/C 組細胞中 水平較 a/A 組顯著降低 （F=7.81，6.58，Plt;0.05），d/D，e/E，f/F 組與 a/A 組比較差異無顯著性 （Pgt;0.05） ;Westernblotting檢測結(jié)果顯示，與A組比較，B組細胞內(nèi)RAD51蛋白表達水平顯著升高；與A組和B組比較，D組細胞內(nèi)RAD51蛋白水平顯著降低 （F=10.56，Plt;0.05） ）。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與NC-siRNA組比較，siRNA-RAD51-264組細胞活力在DDP濃度為 3.12，6.25，12.50，25.00mg/L 時明顯下降 （t=3.72～63.90，Plt;0.05） 。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與Control組和NC-siRNA組比較，siRNA-RAD51組和 siRNA-RAD51 + DDP組細胞的 G₀/G₁ 期細胞比例顯著增加;與siRNA-RAD51 組比較，siRNA-RAD51+DDP 組細胞的 G₀/G₁ 期細胞比例顯著增加 （F=23.29，Plt;0.05） ：與Control組和NC-siRNA組比較，siRNA-RAD51+DDP 組細胞的S期細胞比例顯著減少 （F=12.95，Plt;0.05） ：與Control 組和 NC-siRNA組比較，siRNA-RAD51組和 siRNA-RAD51+DDP 組的細胞凋亡率均顯著性升高（ F= 16.34，Plt;0.05） 。結(jié)論卵巢癌組織中RAD51蛋白高表達患者對 NACT敏感性更差;敲降 SKOV3-DDP 耐藥細胞RAD51基因表達可有效逆轉(zhuǎn)該細胞對DDP的耐藥性，提高化療的敏感性。

[中圖分類號] R737.31 [文獻標志碼] A

The impact of RAD51 protein on the sensitivity of ovarian cancer to neoadjuvant chemotherapy LIU

Hui，CHENYunqing，QIHuiyang，SUNXin，LOUYanui（DepartmentofGynecology，TheAfiliatedHospitalofQingdac University，Qingdao 266003，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the impact of RAD51 protein on the sensitivity of ovarian cancer to neoadjuvant chemotherapy（NACT）.MethodsTumor biopsytissue samples werecolected before NACT from47 patients with advanced high-grade serous ovariancancer（HGSOC）whounderwentNACTand intermediate tumorcellreductionsurgery in Departmentof Gynecology，The AffiatedHospitalofQingdao University，from June2O17to June 2O19.Immunohistochemistry wasusedto measuretheexpresionlevelofRAD5lproteinintumor isue，andthecorrelationbetweenitsexpressonlevelandthesesitivity to NACT was analyzed. SKOV3 cells were divided into groups a-f ，and cisplatin （DDP）-resistant SKOV3 cells were divided into groups A-F；the cells in groups b-f or groups B-F were transfected with NC-siRNA，siRNA-RAD51-264，siRNA-RAD51-416， siRNA-AD51-608，and siRNA-RAD51-807，respectively，and then quantitative real-time PCR wasused to measure the mRNA expression levelsof RAD51 in each groupofSKOV3cellsand DDPresistant SKOV3 cells.TheDDP-resistant SKOV3cellswere divided into SKOV3-Control group（control group），SKOV3-DDP-Control group （DDP control group）， SKOV3-DDP-NC-siRNA group （transfected with NC-siRNA），and SKOV3-DDP-siRNA-RAD51 group（transfectedwith siRNA-RAD51），and Western blotting was usedto measuretheexpressonlevelofRAD51protein ineach groupofcells.TheDDP-resistant SKOV3cellsweredivided into NC-siRNA group （transfected with NC-siRNA）andsiRNA-RAD51 group（transfected with siRNA-RAD51-264），and DDP at various concentrations（0.39，0.78，1.56，3.12，6.25，12.50，and 25.00mg/L ）wasadded for culture for ^48h ; CCK-8 assay was used tomeasuretheviabilityofDDP-resistantSKOV3celsaftertransfection.TheDDP-resistantSKOV3cellsweredividedintoControl group，NC-siRNA group（（transfected with NC-siRNA），siRNA-RAD51 group（transfected with siRNA-RAD51），and siRNARAD51+DDP group（transfected with siRNA-RAD51and subsequently treated with DDP），and flow cytometry wasused to observecellcclealterationsandapoptosisateinDD-resistantSKOV3cels.ResultsImmunohistochemistryshowedthatthere werenosignificantdiferencesinage，F(xiàn)IGOstage（stageIorIV），lymphnodemetasasisascitesandinitialserumCA25level between the patients with high RAD5l expression and those with low expression （ （Pgt;0.05） ，and there was a significant difference intheexpressonlevelofRAD51 protein intumor tisse between thechemotherapy-sensitivegroupand theinsensitive group X²= 10.85，Plt;0.05 ）.RT-qPCR showed that the relative mRNA expression level of RAD51 in SKOV3-DDP cells was significantly higher than that in SKOV3 cells （t=6.73，Plt;0.05 ），and the mRNA expression level of RAD51 in group c/C was significantly lower than that in group a/A （ F=7.81，6.58，Plt;0.05） ；there was no significant difference in the mRNA expression level of RAD51 between groups d/D e/E ， f/F and group a/A（ Pgt;0.05' . Western bloting showed that compared with group A，group B hadasignificant increaseintheproteinexpresionlevelofRAD5lincells，andcomparedwith groups AandB，groupDhadasignificant reduction in the protein expression level of RAD51 （ F=10.56，Plt;0.05） . CCK-8 assay showed that compared with the NCsiRNA group，thesiRNA-RAD51-264 grouphadasignificantreductionincellviabilityatDDPconcentrationsof3.12，6.25，12.50， and 25.00mg/L ？ t=3.72-63.90，Plt;0.05） . Flow cytometry showed that compared with the Control group and the NC-siRNA group，the siRNA-RAD51 group and the siRNA-RAD5 1+ DDP group had a significant increase in the proportion of cells in the G₀ / G₁ phase，and compared with the siRNA-RAD5l group，the siRNA-RAD51+DDP group hada significant increase in the proportion of cells in the G₀/G₁ phase ΔF=23.29，PΔlt;0.05Δ ；compared with the Control group and the NC-siRNA group，the siRNARAD51+DDP group had a significant reduction in the proportion of cells in the S phase （ F=12.95，Plt;0.05） .Compared with the Control group and the NC-siRNA group，both the siRNA-RAD51 group and the siRNA-RAD51+DDP group had a significant increase in apoptosis rate F=16.34，Plt;0.05 .ConclusionPatients with a high expression level of RAD51 protein in ovarian cancer tissue tend to have poorer sensitivity to NACT，and knocking down the expression of RAD51 gene in DDP-resistant SKOV3 cells can effectively reverse the resistance of these cels to DDP and enhance the sensitivity to chemotherapy.

[KEY WORDs]Cystadenocarcinoma，serous；Ovarian neoplasms; Chemotherapy，adjuvant； Rad51 recombinase； Drug resistance，neoplasm;Cisplatin

高級別漿液性卵巢癌（high-grade serous ova-riancancer，HGSOC）是婦科惡性腫瘤中致死率最高的類型，對于晚期不適合初始腫瘤細胞減滅術(shù)的患者，新輔助化療（NACT）能夠降低手術(shù)難度，并減少圍術(shù)期患者并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率[1-2]。然而，由于卵巢癌的高度異質(zhì)性以及化療前腫瘤負荷較大，NACT可能誘使鉑類藥物耐藥性進一步加重[3-4]因此，在開始治療前識別可能出現(xiàn)耐藥的卵巢癌患者具有重要意義。

近年來，CA125清除速率常數(shù)K（KELIM）值被用作卵巢癌CA125高表達患者化療敏感性的預(yù)測指標。研究顯示，KELIM值 ?1 的晚期卵巢癌患者對鉑類化療反應(yīng)率較KELIM值 lt;1 的患者高，是后續(xù)鉑類耐藥風險和生存率的獨立和主要預(yù)測因子[5-8]。然而，KELIM值無法在化療開始前對原發(fā)性鉑耐藥患者進行篩選和識別。因此，目前尚缺乏有效的化療前預(yù)測指標。

RAD51是同源重組（HR）修復(fù)過程中的核心蛋白，是DNA雙鏈斷裂（DSBs）修復(fù)的重要因子[9]，在維持基因組完整性和穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用，其過表達可顯著增強癌細胞對鉑類藥物的耐受性[10-11]，并降低了患者術(shù)后對鉑類藥物的化療反應(yīng)性，縮短了患者的無進展生存期[12]。但有關(guān)RAD51蛋白與術(shù)前NACT化療敏感性的研究尚鮮見報道。本研究基于KELIM值將接受NACT的HGSOC患者分為化療敏感組和不敏感組，分析兩組患者RAD51蛋白表達差異及其與化療敏感性的關(guān)系；同時在體外培養(yǎng)卵巢癌細胞，構(gòu)建RAD51敲降模型，進一步探討RAD51蛋白與卵巢癌細胞鉑類藥物化療敏感性的關(guān)系，為逆轉(zhuǎn)化療耐藥提供新的研究靶點。

1對象與方法

1.1 臨床研究對象的數(shù)據(jù)收集和相關(guān)指標檢測

1.1.1研究對象選取2017年6月—2019年6月在婦科行 NACT+ 中間型腫瘤細胞減滅術(shù)治療的晚期HGSOC患者47例，年齡45～76 歲，平均 （57.72±8.28） 歲。納入標準： ① 術(shù)前均接受了 3～4 療程的NACT，化療方案為紫杉醇 + 卡鉑靜脈化療或順鉑（DDP）腹腔灌注者； ② 手術(shù)均達到理想腫瘤細胞減滅術(shù)且術(shù)后經(jīng)病理確診為I～N 期HGSOC者； ③ 無嚴重心腦血管疾病、無影響免疫組化結(jié)果的合并癥（如免疫系統(tǒng)疾?。┱?；④ 術(shù)后未使用貝伐珠單抗和（或）PARP抑制劑維持治療者。收集所有HGSOC患者NACT前的腫瘤活檢組織，經(jīng) 10% 甲醛固定以及石蠟包埋后切片，切片厚度為 4μm 。

1.1.2 免疫組化法檢測腫瘤組織中RAD51蛋白表達量 取患者腫瘤組織切片標本，烤片機 65^°C 烤片30min ，后脫蠟至水，進行抗原修復(fù)后用 3% 過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，一抗 （1：1 000 稀釋） 下孵育 2～3h ，PBS清洗3次，二抗室溫下孵育 40min ，顯色后蘇木素復(fù)染，乙醇脫水后中性樹膠封片，置于熒光顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。以細胞核或細胞漿中有淡黃色至棕褐色顆粒判斷為RAD51蛋白染色陽性，每張切片隨機選5個高倍視野，每個視野中計數(shù)100個細胞，分別對于胞質(zhì)或者胞槳染色強度以及陽性染色細胞占比進行評分，將兩者評分的乘積作為最終得分[13]，得分 lt;8 為RAD51低表達組， 8? 得分 ?12 者納入RAD51高表達組。結(jié)果的判讀由兩位醫(yī)師獨立完成，當結(jié)果不一致時，取兩位醫(yī)師評分的平均值作為最終的結(jié)果。

1.1.3患者的臨床病理特征收集及其KELIM值計算收集所有患者的臨床病理特征資料，包括年齡、FIGO分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否腹水、首次血清CA125水平。收集所有患者每個NACT周期的首日日期和NACT100d內(nèi)的前3次血清CA125水平及相應(yīng)的檢查日期，輸人https：//www.biomar-ker-kinetics.org網(wǎng)站，進而計算KELIM值。根據(jù)KELIM值將所有患者進行分組[5]，KELIM值 ?1 者設(shè)為化療敏感組，KELIM值 lt;1 者設(shè)為化療不敏感組。

1.2 細胞株及主要試劑

卵巢癌細胞系SKOV3細胞及SKOV3-DDP耐藥細胞購自南京萬木春生物有限公司，RAD51siR-NA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Anti-RAD51Antibody購自生工生物工程（上海）股份有限公司，DDP購自上海陶術(shù)生物科技有限公司，CCK-8檢測試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，Trizol裂解液購自美國AppliedBiosystems公司，蛋白質(zhì)抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 SKOV3細胞和SKOV3-DDP耐藥細胞的培 養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將SKOV3細胞和SKOV3-DDP耐藥細胞置于含 10% 胎牛血清和 1% 青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）中，于 、含體積分數(shù) 0.05CO₂ 的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，其中SKOV3-DDP耐藥細胞培養(yǎng)液中添加 0.5mg/L DDP維持細胞耐藥性。待培養(yǎng)至細胞融合度達 60%～70% 時，分別將SKOV3細胞和SKOV3-DDP細胞分為 a～f 組和 A～F 組。b～f 組以及 B～F 組分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA、siRNA-RAD51-264、siRNA-RAD51-416、siRNA-RAD51-608、siRNA-RAD51-807，操作嚴格按照細胞轉(zhuǎn)染說明書進行，a組和轉(zhuǎn)染后的 b～f 組均于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^48h ，A組和轉(zhuǎn)染后的 B～F 組均于含有0.5mg/L DDP的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^48h 。

1.4RT-qPCR檢測 SKOV3 和 SKOV3-DDP耐藥細胞中 表達水平

在SKOV3細胞和SKOV3-DDP細胞中，以及上述處理結(jié)束后各組細胞中，分別加入Trizol裂解液提取各組細胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列見表1。反應(yīng)條件設(shè)置為： 95^°C，30s ;然后 95^°C，10s，60^°C 30 s，共40 個循環(huán)。采用 2^-ΔΔCT 法計算各組細胞中mRNA相對表達水平。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5Western blotting方法檢測各組 SKOV3-DDP耐藥細胞中RAD51蛋白表達水平

取對數(shù)生長期的SKOV3-DDP耐藥細胞，以每孔約 6×10⁵ 個細胞數(shù)接種于6孔板中，待細胞融合度達 60%～70% 時，將其分為SKOV3-Control組、SKOV3-DDP-Control組、SKOV3-DDP-NC-siRNA組、SKOV3-DDP-siRNA-RAD51組。SKOV3-Con-trol組和SKOV3-DDP-Control組分別于完全培養(yǎng)基和含有 0.5mg/L DDP完全培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^48h SKOV3-DDP-NC-siRNA 組 和 SKOV3-DDP-siR-NA-RAD51組分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA以及siRNA-RAD51-264后，于含 0.5mg/L DDP完全培養(yǎng)基中培養(yǎng) ^48h 。處理結(jié)束后，以RIPA蛋白裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，各蛋白樣品取 20μg 行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST洗膜3次，浸入RAD51一抗過夜孵育。再次TBST洗膜3次，浸入二抗，搖床室溫孵育 。ECL發(fā)光液A和B按 1：1 比例等體積混勻，取適量均勻滴于目的條帶位置，于化學發(fā)光系統(tǒng)曝光，使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以 β -actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達水平。

1.6CCK-8實驗檢測SKOV3-DDP耐藥細胞的細胞活力

將融合度達 60%～70% 的SKOV3-DDP耐藥細胞分為NC-siRNA組和siRNA-RAD51組，分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA和siRNA-RAD51-264。兩組細胞培養(yǎng) ^48h 后，分別加人0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50，25.00mg/L 濃度的DDP，繼續(xù)培養(yǎng) ^48h 以后每孔加入 10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng) ^2h 。采用酶標儀檢測波長 450nm 處的吸光度值，并計算細胞活力。細胞活力 （實驗組吸光度值一空白組吸光度值）/（對照組吸光度值一空白組吸光度值） x 100% 。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。計算DDP抑制SKOV3-DDP耐藥細胞活力的 IC₅₀ ，后續(xù)實驗的DDP濃度為 IC₅₀ 的 50% 。

1.7流式細胞術(shù)檢測SKOV3-DDP耐藥細胞的細胞周期

將細胞融合度達 60%～70% 的 SKOV3-DDP耐藥細胞分為Control組、NC-siRNA組、siRNA-RAD51組、siRNA-RAI ）51+DDP 組。Control組細胞在含有 0.5mg/L DDP的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)^48h ;NC-siRNA組、siRNA-RAD51組細胞分別轉(zhuǎn)染了NC-siRNA和siRNA-RAD51-264以后在含有0.5mg/L DDP完全培養(yǎng)基當中培養(yǎng) ^48h ; siRNA-RAD51+DDP 組細胞轉(zhuǎn)染siRNA-RAD51-264后在含有 0.5mg/L DDP完全培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h 后，再加入濃度為 7.30mg/L 的DDP溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h 。胰酶消化各組細胞后轉(zhuǎn)移至 15mL 離心管中， 1380r/min 離心 5min 。棄上清液，加入預(yù)冷的PBS洗滌細胞沉淀 2～3 次，以 -20°C 預(yù)冷的體積分數(shù)0.75乙醇重懸細胞，后置于一 20°C 冰箱固定過夜。次日 1380r/min 離心 5min 收集細胞，加入500μL 預(yù)冷的PBS，調(diào)整細胞密度至 1×10⁸ 個/L，加入碘化丙啶（PI）染色液以及RNA酶室溫染色10min 。以流式細胞儀檢測各組SKOV3-DDP耐藥細胞的細胞周期情況，使用FlowJo軟件計算處于 G₀/G₁ 期和S期的細胞比例。

1.8流式細胞術(shù)檢測各組SKOV3-DDP耐藥細胞的細胞凋亡率

將處理結(jié)束的Control組、NC-siRNA組、siR-NA-RAD51組、 Δ.siRNA–RAD51+DDP 組細胞，胰酶消化后調(diào)整細胞密度至 1×10⁹ 個/L;加入 4^°C 預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，每次以 1380r/min 離心3min ；用 300μL 預(yù)冷的BindingBuffer重懸細胞后，每管加入 2μL Annexin V-FITC和 5μL PI，室溫下避光孵育 10min ;每管再加入 200μL 預(yù)冷的BindingBuffer，使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡的情況，使用FlowJo軟件計算細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS27.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。計數(shù)資料以例（率）表示，組間比較采用 χ² 檢驗。計量資料以 x±s 表示，兩組間比較采用 Ψ_tΨ_Ψ 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法；不同濃度、不同組別的比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1RAD51蛋白在HGSOC患者腫瘤組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

免疫組化法染色結(jié)果顯示，RAD51蛋白主要在腫瘤組織的細胞核中表達（圖1），細胞槳中部分表達。47例HGSOC患者當中，RAD51高表達組19例，RAD51低表達組28例。RAD51高、低表達組患者的年齡、FIGO分期（Ⅲ期或Ⅳ期）、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否腹水及首次血清CA125水平比較差異無顯著性 （Pgt;0.05） 。見表2。

A、B分別為RAD51蛋白在HGSOC患者腫瘤組織的細胞核中高、低表達；免疫組化染色，200倍

2.2HGSOC患者腫瘤組織中RAD51蛋白表達與NACT敏感性的關(guān)系

47例患者中，化療敏感組26例，其中腫瘤組織中RAD51蛋白高表達患者5例，RAD51蛋白低表達者21例；化療不敏感組21例，其中腫瘤組織中RAD51蛋白高表達者14例，低表達者7例，兩組患者的腫瘤組織中RAD51蛋白表達水平比較差異具有顯著性 （Υ²=10.85，Plt;0.05） 。

2.3敲降SKOV3 和SKOV3-DDP細胞RAD51基因后其 及蛋白表達情況

RT-qPCR結(jié)果顯示，SKOV3細胞和SKOV3-DDP細胞中 相對表達水平分別為1.00±0.00，1.19±0.05 ，兩者比較差異具有顯著性0 ?t=6.73，Plt;0.05） 。 a～f 組 相對表達水平分別為 1.00±0.00，1.08±0.32，0.31± 0.07，0.81±0.21，0.94±0.14，0.65±0.10 ，各組間比較差異有顯著性 （F=7.81，Plt;0.05） ，其中c組與a、b組比較顯著降低 （Plt;0.05），d，e，f 組分別與a、b組相比較差異無顯著意義 （Pgt;0.05） 。 A～F 組 相對表達水平分別為 1.00±0.00 、1.14±0.21，0.50±0.10，0.87±0.27，0.95±0.12. 0.63±0.12 ，各組之間比較具有顯著差異（ F=6.58 .Plt;0.05^? ，其中C組與A組、B組比較顯著降低（ ΔPlt;0.05Δ ，D、E、F組分別與 A，B 組比較差異無顯著性（ ）。因此選用siRNA-RAD51-264用于后續(xù)細胞的轉(zhuǎn)染。

Westernblotting方法檢測結(jié)果顯示， A～D 組細胞中RAD51蛋白表達水平分別為 0.68±0.14 、1.04±0.13，0.87±0.20，0.39±0.57 ，各組間比較差異有顯著性 （F=10.56，Plt;0.05） ；其中B組較A組比較顯著升高，D組較A、B組比較顯著降低（ Plt; 0.05）。見圖2。

2.4不同濃度DDP對SKOV3-DDP耐藥細胞活力的影響

CCK-8方法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)0.39、0.78、1.56、3.12.6.25.12.50.25.00mg/L 濃度的DDP處理后，NC-siRNA組細胞的細胞活力分別為 2.53±0.08 、2.58±0.08，2.69±0.09，2.75±0.02，2.84±0.23， 2.81±0.02，2.24±0.35 ，siRNA-RAD51-264組的細胞活力分別為 2.45±0.07，2.62±0.04，2.62±0.07 2.49±0.04，2.24±0.16，1.55±0.03，0.47±0.04， 。重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，分組、濃度、分組和濃度交互作用對細胞活力均有顯著影響 （F_//f= 389.58，F(xiàn)_???=70.95，F(xiàn)_??=38.84，Plt;0.05） ；單獨效應(yīng)的分析結(jié)果顯示，隨著DDP濃度升高，siRNA-RAD51-264組細胞活力明顯下降（ F=338.17，Plt; 0.05），NC-siRNA組細胞活力無顯著性差異（ Pgt; 0.05）；在DDP濃度為 3.12.6.25.12.50.25.00mg/L 時，siRNA-RAD51-264組的細胞活力較NC-siRNA組顯著降低 （t=3.72～63.90，Plt;0.05） 。

2.5敲降SKOV3-DDP耐藥細胞中RAD51基因?qū)ζ浼毎芷诘挠绊?/p>

Control組、NC-siRNA組、siRNA-RAD51組、siRNA-RAD51+DDP組細胞阻滯于 G₀/G₁ 期的細胞比例分別為 （53.73±2.98）% ： （50.53±4.56）% （ 60.73±1.70）% 、 （69.30±1.78）% ，各組間比較差異有顯著性 （F=23.29，Plt;0.05） ，除了Control組與NC-siRNA組比較無顯著差異外，其他幾組各組間兩兩比較均有顯著差異 （Plt;0.05） 。Control組、NC-siRNA組、siRNA-RAD51組、siRNA-RAD51十DDP組中S期細胞的比例分別為 （21.27±0.76）% 、（2 （21.97±2.02）% 服 （18.33±3.23）% 、（ 12.50± 1.44）% ，各組間比較差異有顯著性 （F=12.95，Plt; 0.05），其中 siRNA-RAD51+DDP 組與Control組、NC-siRNA組比較差異有顯著性 （Plt;0.05） 。見圖3。

2.6敲降SKOV3-DDP耐藥細胞中RAD51基因?qū)ζ浼毎蛲龅挠绊?/p>

流式細胞術(shù)檢測的結(jié)果顯示，Control組、NC-siRNA組、siRNA-RAD51組以及siRNA-RAD ⁵¹⁺DDP組的細胞調(diào)亡率分別為 （10.18±5.52）% 、（8.70±1.32）% 、 16.02±2.18）% 、（ ?19.97± 3.31）% ，各組間比較差異有顯著性 （F=16.34，Plt; 0.05），其中siRNA-RAD51組、siRNA-RAD51 +DDP組分別與Control組、NC-siRNA組相比，細胞凋亡率顯著升高 （Plt;0.05 。見圖4。

3討論

近年來，對于無法實現(xiàn)理想腫瘤細胞減滅術(shù)的晚期卵巢癌患者，常需要先進行 3～4 次NACT，以降低腫瘤負荷后再行中間型腫瘤細胞減滅術(shù)治療[14]。對于一些化療耐藥的原發(fā)性患者，NACT不僅達不到理想的化療效果，而且在化療過程中積累的細胞毒性或細胞突變可能會進一步增強腫瘤的耐藥性[15]。因此，有效篩選適合NACT的患者，提高初治后鉑類藥物的化療反應(yīng)性，對于延長患者生存期非常重要。DSBs是鉑類化療藥物致腫瘤細胞死亡的重要環(huán)節(jié)，抑制鉑類化療藥物誘導(dǎo)的DNA損傷的關(guān)鍵修復(fù)途徑是 HR^[16-17] 。RAD51蛋白過表達可增強HR修復(fù)能力，改變重組途徑及增加基因組的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致腫瘤細胞對放療和化療耐受性增強[18-20]。HOPPE等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，RAD51高表達卵巢癌患者的原發(fā)性鉑耐藥風險更高。

本研究顯示，RAD51蛋白主要在腫瘤組織的細胞核中表達，而且RAD51蛋白高表達者較RAD51蛋白低表達者對NACT敏感性更差?？赡苣[瘤組織中高表達的RAD51可及時修復(fù)損傷的DNA，增強腫瘤細胞耐藥性，進而降低其化療敏感性。研究顯示，在乳腺浸潤癌和結(jié)腸腺癌患者中，化療不敏感組的RAD51表達要高于敏感組[22]；RAD51高表達卵巢癌患者對鉑、紫杉烷和PARP抑制劑的耐藥性增加，鉑類耐藥患者腫瘤組織中RAD51表達水平顯著升高[23]。為進一步驗證RAD51蛋白表達與卵巢癌細胞鉑類藥物化療敏感性的關(guān)系，本研究在體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細胞和SKOV3-DDP耐藥細胞，對兩種細胞RAD51mRNA和蛋白的表達水平進行檢測。研究結(jié)果顯示，SKOV3-DDP耐藥細胞中RAD51mRNA和蛋白相對表達水平較SKOV3細胞顯著升高。隨后篩選出轉(zhuǎn)染效果最佳的siR-NA-RAD51-264用于后續(xù)細胞實驗。

本研究進一步的結(jié)果顯示，隨著DDP濃度升高，siRNA-RAD51-264組細胞活力顯著下降；同一濃度之下，siRNA-RAD51-264組細胞的活力較NC-siRNA組也顯著下降。提示敲降RAD51基因后，SKOV3-DDP耐藥細胞對DDP的耐藥性降低，敏感性增加，DDP的抗腫瘤活性增強。本研究的細胞周期檢測結(jié)果顯示，敲降SKOV3-DDP耐藥細胞中RAD51基因后，細胞阻滯于 G₀/G₁ 期，S期細胞比例下降，同時敲降RAD51基因后再行DDP處理，阻滯于 G₀/G₁ 期的細胞比例進一步增加，提示細胞增殖受到抑制。RAD51基因敲降后，DSBs修復(fù)能力下降，激活A(yù)TM-CHK1/CHK2信號通路，觸發(fā)細胞 G₁/S 檢查點，使腫瘤細胞阻滯于 G₀/G₁ 期而不能進入S期。鉑類藥物作用于腫瘤細胞后形成DNA 鏈交聯(lián)，導(dǎo)致DSBs[24-25]，此時再加人DDP，進一步加劇了DDP對SKOV3-DDP耐藥細胞的損傷作用。綜合以上研究結(jié)果，敲降RAD51基因后，SKOV3-DDP耐藥細胞對DDP敏感性增加，耐藥性下降，DDP抗腫瘤細胞作用增強。ZHANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍和DDP聯(lián)合應(yīng)用后，二甲雙胍抑制了DDP引起的ATM/CHK2信號通路的激活，同時上調(diào)卵巢癌細胞中RAD51修復(fù)蛋白，導(dǎo)致卵巢癌細胞對DDP的耐藥性增強。本研究的細胞凋亡實驗也顯示，敲降SKOV3-DDP耐藥細胞中的RAD51基因后，細胞凋亡率顯著升高。提示SK-OV3-DDP耐藥細胞可能因為阻滯于 G₀/G₁ 期，無法進行復(fù)制，最終導(dǎo)致細胞死亡。

鉑類藥物耐藥性通常與HR修復(fù)能力增強有關(guān)，HR修復(fù)能力增強可使癌細胞更有效地修復(fù)鉑類藥物造成的 DSBs^[17，27] 。而通過敲降或者抑制RAD51來抑制HR修復(fù)能力，也是逆轉(zhuǎn)耐藥性、增強化療敏感性的有效策略[28]。既往研究報道，用RAD51小分子抑制劑作用于食管腺癌和結(jié)腸癌細胞系后，鉑類化療藥物的細胞毒性增強，腫瘤細胞對化療藥物的敏感性增加[29]。綜上可見，通過敲降RAD51或者開發(fā)RAD51抑制劑，可以有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對DDP的耐藥性，提高化療敏感性，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥提供新的研究靶點。

綜上所述，卵巢腫瘤組織中RAD51蛋白高表達患者對NACT敏感性差，腫瘤組織中RAD51蛋白表達水平有望成為卵巢癌患者NACT敏感性指標，敲降RAD51可有效逆轉(zhuǎn)SKOV3-DDP耐藥細胞對DDP的耐藥性，提高化療敏感性。期待通過靶向RAD51開發(fā)新的治療藥物，通過下調(diào)RAD51表達來增強化療敏感性，以改善卵巢癌患者生存預(yù)后，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類藥物耐藥性提供新的研究靶點。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過醫(yī)學倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL29813）。所有試驗過程均遵照《醫(yī)學倫理委員會標準》的條例進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。作者聲明：婁艷輝、劉慧、陳云慶參與了研究設(shè)計；劉慧、戚慧陽、孫欣、婁艷輝參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1]LV XF，CUISH，ZHANG X A，et al. Efficacy and safety of neoadjuvant chemotherapy versus primary debulking surgery

[2]COLERIDGE S L，BRYANT A，KEHOE S，et al. Neoadjuvant chemotherapy before surgery versus surgery followed by chemotherapy for initial treatment in advanced ovarian epithelial cancer[J]. Cochrane Database Syst Rev，2O21，7（7）： CD005343.

[3]LIU J H， JIAO X F，GAO Q L. Neoadjuvant chemotherapyrelated platinum resistance in ovarian cancer[J]. Drug Discov Today，2020，25（7）：1232-1238.

[4]AMABLE L. Cisplatin resistance and opportunities for precision medicine[J]. Pharmacol Res，2016，106：27-36.

[5]YOU B，PURDY C，COPELAND L J，et al. Identification of patients with ovarian cancer experiencing the highest benefit from bevacizumab in the first-line seting on the basis of their tumor-intrinsic chemosensitivity（KELIM）：The GOG-0218 validation study[J]. J Clin Oncol， 2022，40（34） ：3965-3974.

[6]COLOMBAN O，SWISHER E M，KRISTELEIT R，et al. Mathematical modeling of the early modeled CA-125 longitudinal kinetics （KELIM-PARP） as a pragmatic indicator of rucaparib efficacy in patients with recurrent ovarian carcinoma in ARIEL2 amp;. STUDY 10[J]. EBioMedicine，2023，89：104477.

[7]YOU B，ROBELIN P，TOD M，et al. CA-125 ELIMination rate constant K（KELIM） is a marker of chemosensitivity in patients with ovarian cancer：Results from the phase II CHIVAtrial[J].Clin Cancer Res，2020，26（17）：4625-4632.

[8]KUS F，GUVEN D C， YILDIRIM H C，et al. KELIM score predicts outcome in patients with platinum-resistant/refractory recurrent ovarian cancer[J]. Biomark Med，2023，17（7） ： 379- 389.

[9]WANG Z Y，JIA R X，WANG L L， et al. The emerging roles of Rad51 in cancer and its potential as a therapeutic target[J]. Front Oncol，2022，12：935593.

[10] VAN DER ZON N L， KANAAR R， WYMAN C. Variation in RAD51 details a hub of functions：Opportunities to advance cancer diagnosis and therapy[J]. F10ooResearch，2018，7： 1453.

[11］DEMEYER A，BENHELLI-MOKRANI H，CHENAIS B，et al. Inhibiting homologous recombination by targeting RAD51 protein[J]. Biochim Biophys Acta Rev Cancer， 2021，1876（2）： 188597.

[12] COMPADRE A J，VAN BILJON L N，VALENTINE M C， et al.RAD51 foci as a biomarker predictive of platinum chemotherapy response in ovarian cancer[J]. Clin Cancer Res，2023， 29（13）：2466-2479.

[13］盧小麗，劉絲蓀，熊振芳.RAD51C蛋白在卵巢癌組織中的表 達及意義[J].南昌大學學報（理科版），2018，42（6）：584-587.

[14］董海燕，李力.卵巢上皮性癌新輔助治療的研究進展[J].中華 婦產(chǎn)科雜志，2025，60（1）：71-78.

[15] LHEUREUX S， KARAKASIS K， KOHN E C，et al. Ovarian cancer treatment： The end of empiricism？ [J]. Cancer，2015， 191（10）

[16]PIKKUSAARIS，TUMIATIM，VIRTANENA，etal.Functional homologous recombination assay on FFPE specimens ofadvanced high-grade serous ovarian cancer predicts clinical out-comes[J].Clin CancerRes，2023，29（16）：3110-3123.

[17]OH JM，MYUNG K.Crosstalk between different DNA repairpathways forDNA double strand break repairs[J].Mutat ResGenet Toxicol Environ Mutagen，2022，873：503438.

[18]ORHANE，VELAZQUEZC，TABETI，etal.Regulation ofRAD51 at the transcriptional and functional levels：What pros-pectsforcancer therapy？[J].Cancers（Basel），2o21，13（12）：2930.

[19]LAURINIE，MARSOND，F(xiàn)ERMEGLIAA，etal.Role ofRad51 and DNA repair in cancer：A molecular perspective[J].Pharmacol Ther，2020，208：107492.

[20]陸泓雨，付瑋，丁士剛.Rad51在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥中的作用及研究進展[J].臨床腫瘤學雜志，2022，27（3）：273-277.

[21]HOPPEMM，JAYNESP，WARDYNJD，etal.Quantita-tive imaging of RAD5l expression as a marker of platinum re-sistance in ovariancancer[J].EMBO Mol Med，2021，13（5）：e13366.

[22]LIU HR，WENGJL.A pan-cancerbioinformatic analysis ofRAD51 regarding the values for diagnosis， prognosis，andtherapeutic prediction[J].Front Oncol，2022，12：858756.

[23]FENGYC，WANGDQ，XIONGLY，etal.Predictive value of RAD51 on the survival and drug responsiveness of ovarian cancer[J].Cancer Cell Int，2021，21（1）：249.

[24]BROWN A，KUMAR S，TCHOUNWOU P B.Cisplatinbased chemotherapy of human cancers[J].JCancer Sci Ther， 2019，11（4）：97.

[25]FU R，ZHAO BR，CHEN M，et al. Moving beyond cisplatin resistance：Mechanisms，challenges，and prospects for overco ming recurrence in clinical cancer therapy[J].Med Oncol， 2023，41（1）：9.

[26]ZHANGJJ，ZHOUP，WUTC，et al.Metformin combined withcisplatin reducesanticancer activity via ATM/CHK2-dependent upregulation of Rad51 pathway in ovarian cancer[J]. Neoplasia，2024，57：101037.

[27]ALHEGAILI A S.Role of DNA repair deficiency in cancer development[J].PakJBiol Sci，2023，26（1）：15-22.

[28]RAY U，RAGHAVAN SC.Understanding the DNA doublestrand break repair and itstherapeutic implications[J].DNA Repair（Amst），2021，106：103177.

[29]LIAO CC，TALLURI S，ZHAOJN，et al.RAD51 is implicated in DNA damage，chemoresistance and immune dysregulationin solid tumors[J].Cancers（Basel），2022，14（22）： 5697.

（本文編輯耿波）