番茄Slβ-Hex的分子特征及啟動子sgRNA分析

中圖分類號：S641.2；X502 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）05-1131-08

0 引言

【研究意義】N-糖蛋白在植物細(xì)胞器中廣為分布，主要包含寡甘露糖N-聚糖（paucimanno-sidicN-glycans）和復(fù)雜N-聚糖（complex N-glycans）兩類低糖鏈[1]。糖苷水解酶（glycoside-hydrolase）屬于糖蛋白類，在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要的作用，主要作用于各種糖昔和寡糖，形成游離N-聚糖Glycans，會直接影響果實(shí)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的化學(xué)組成成分，從而破壞細(xì)胞壁的完整性，導(dǎo)致番茄果實(shí)軟化（PriemB，1993）[2]其中β-氨基己糖苷酶（ 是糖苷水解酶家族20（GH20）的成員，屬于外切糖苷酶，催化位于N-糖蛋白非還原性末端的N-乙酰氨基葡萄糖降解，使N-糖蛋白攜帶的復(fù)雜N-聚糖變?yōu)楣迅事短荖-聚糖，造成游離N-聚糖積累，加速番茄果實(shí)成熟軟化[3-4]。果實(shí)軟化裂解主要是酶催化的細(xì)胞壁聚合物降解的結(jié)果，其中糖苷水解酶 β-D-N-ζ 酰氨基己糖苷酶（ （β-Hex） 在果實(shí)成熟期間特異性表達(dá)，是糖蛋白糖基化最后階段的關(guān)鍵酶，對果實(shí)的成熟軟化發(fā)揮著重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在番茄中過表達(dá)Slβ-Hex會導(dǎo)致果實(shí)過度軟化，轉(zhuǎn)入Slβ-Hex的RNAi基因則會抑制SIβ-Hex的表達(dá)，可以降低果實(shí)的成熟軟化速率、延長保質(zhì)期，N－聚糖加工與果實(shí)成熟軟化過程有關(guān)，為通過突變失活 β-Hex 酶基因的表達(dá)，抑制番茄細(xì)胞壁水解程度調(diào)控番茄果實(shí)軟化提供了思路[5-8]?！颈狙芯壳腥它c(diǎn)】目前利用CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向編輯加工番茄細(xì)胞壁糖苷水解酶相關(guān)基因改良耐貯性的報(bào)道較少。番茄為呼吸躍變型果實(shí)，容易過熟軟化腐爛，嚴(yán)重影響番茄的種植和加工。把番茄SIβ-Hex的RNAi基因轉(zhuǎn)人番茄，能遲滯果實(shí)軟化，但轉(zhuǎn)基因插入植物基因組位點(diǎn)存在不確定性，使得該項(xiàng)技術(shù)的推廣應(yīng)用受到一定限制[9-10] 。目前，以多種新型高效的DNA靶向內(nèi)切酶為基礎(chǔ)建立的基因組編輯技術(shù)，可以對植物靶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變或替換，不必再通過導(dǎo)人反義基因或RNAi基因等外來轉(zhuǎn)基因調(diào)控靶基因功能[1-3] 。而且番茄是自花授粉作物，可較為便利的通過自交分離剔除編輯植株的轉(zhuǎn)基因組分，為番茄耐貯性改良提供新途徑。【擬解決的關(guān)鍵問題】分析番茄 Slβ-Hex 基因的分子特征、數(shù)字表達(dá)譜及其上游啟動子區(qū)域的順式作用元件和sgRNAs分布及特異性，篩選出高特異性的基因編輯靶位點(diǎn)，為利用基因編輯技術(shù)調(diào)控抑制番茄SIβ-Hex的表達(dá)、降低細(xì)胞壁水解軟化程度、提高番茄果實(shí)耐貯性的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1. 1. 1 Slβ-Hex蛋白質(zhì)基本特性

利用NCBI搜索SIβ-Hex蛋白質(zhì)序列及其保守結(jié)構(gòu)域;利用Expasy-ProtParamtool分析Slβ-Hex理化性質(zhì)。

1.1.2 Slβ-Hex的染色體定位和基因組結(jié)構(gòu)

利用NCBI數(shù)據(jù)庫查詢Slβ-Hex的cDNA，從GenBank 搜索到 Slβ-Hex 的序列，以Slβ-Hex基因的cds作query，在番茄的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast，確定Slβ-Hex的基因組結(jié)構(gòu)以及外顯子所在染色體位置。

1.2 方法

1. 2. 1 番茄 Slβ-Hex 基因的克隆

以加工番茄8號幼嫩葉片為材料，采用植物總RNA提取方法提取番茄總RNA；根據(jù)NCBI已報(bào)道的 β-Hex（GenBankAccession：NM_001247679.2）序列，設(shè)計(jì)合成特異物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、對其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序?qū)Ρ取?/p>

1. 2.2 表達(dá)譜的建立

以番茄的功能基因組數(shù)據(jù)庫（TomatoFunc-tional GenomicsDatabase，TFGD）（http：//ted.bti.cornell.）中RNA-seqdata的數(shù)據(jù)作基礎(chǔ)，建立Slβ-Hex基于RNA-seq的表達(dá)譜。

1.2.3Slβ-Hex啟動子順式作用元件

根據(jù) SIβ-HexgDNA 所在染色體信息，獲取Slβ-Hex基因上游的啟動子序列，利用PlantCare服務(wù)器分析SIβ-Hex啟動子序列分布的順式作用元件。

1.2.4 sgRNA的選擇及引物設(shè)計(jì)

根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，利用CRISPR-P尋找 Solyc01g081610 （ {β-Hex ）的sgRNAs，PAM序列選擇NGG，優(yōu)先選擇在外顯子上，特異性好，GC含量適中，無特殊RNA結(jié)構(gòu)的序列作為靶標(biāo)序列并設(shè)計(jì)引物，挑選2個(gè)靶標(biāo)序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 Slβ-Hex的分子特征

研究表明，從GenBank搜索到番茄Slβ-Hex的蛋白質(zhì)序列（GenBankAccession： NP_- 001234608），該蛋白由575個(gè)氨基酸組成，平均分子量64023.42 g/mol ，分子式為C2884H4377N757O852S23，不穩(wěn)定系數(shù)為30.14，屬于穩(wěn)定蛋白。帶負(fù)電的殘基總數(shù)（ Asp+Glu） 53個(gè)，帶正電的殘基總數(shù)（ Arg+Lys）38 個(gè)，總平均親水性（Grand average of hydropathicity，GRA-VY）為-0.175，屬于親水蛋白。 Slβ-Hex 脂溶指數(shù)（Aliphaticindex）為81.55，消光系數(shù)131125M-1cm-1 ，理論等電點(diǎn)pI為5.56。

2.2Slβ-Hex的保守域和活性位點(diǎn)

研究表明， Slβ-Hex 含有信號肽，位于第1-23位氨基酸。信號肽下游含有2個(gè)保守域，第30-147位氨基酸為Glycoh_ydro_20b2家族保守域，第167-549氨基酸為GH20_HexA_HexB-like保守域，活性位點(diǎn)在178，207，261，330..331，378，404，430，432，494，496位。

2.3Slβ-Hex的基因組結(jié)構(gòu)和定位

研究表明，以Slβ-Hex序列（GenBank Ac-cession：NM_001247679.2）作querry在番茄基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，Slβ-Hex位于番茄的第1號染色體互補(bǔ)鏈（（NC_015438.3），mR-NA1893bp，CDS1728bp，位置在80657804-80660745nt 之間，編碼575aa，分子量為64023.42g/mol ，長 2942nt ，由2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子組成。第1外顯子位于80659673-88660745nt，長1073nt ，編碼區(qū)位于80659673-80660450nt，長

778nt ，第2外顯子位于 長 1087nt ，編碼區(qū)位于 ，長 950nt ，中間被長度 782nt 的內(nèi)含子相隔。圖1

2.4 基于RNA-seq的Slβ-Hex轉(zhuǎn)錄組

研究表明，SIβ-Hex基因在果實(shí)中表達(dá)量較高，尤其在破色期表達(dá)量急劇上升，而在莖、葉、花蕾、花朵中的表達(dá)水平較低，驗(yàn)證了SIβ-Hex是果實(shí)成熟相關(guān)基因。圖2

Fig.1Slβ-Hex genomic constructure and its location on the chromosome.of tomato

圖1 Slβ-Hex 的基因組結(jié)構(gòu)和染色體位置

圖2基于RNA-seq的番茄栽培品種及野生近緣種醋栗番茄不同組織的 Slβ-Hex 的轉(zhuǎn)錄組 Fig.2 Transcriptomic analysis of Slβ -Hex in different tissues of tomato cultivars and wild relatives gooseberry tomato based on RNA -seq

注：1.花蕾；2.開放的花；3.1cm大的果實(shí)；4. 2cm 大的果實(shí)；5. 3cm 大的果實(shí)；6.青熟果實(shí)；7.轉(zhuǎn)色果實(shí)；8.轉(zhuǎn)色后期果實(shí)；9. 根；10.葉；11.醋栗番茄未熟綠果；12.醋栗番茄轉(zhuǎn)色果實(shí);13．醋栗番茄轉(zhuǎn)色后期果實(shí)；14.醋栗番茄葉片 Notes：1.unopenedflowerbuds;2.fullyopenedflowers；3.1cmfruits；4.cmfruits；5.3cmfruits;6.maturegreenfruits;7beaker fruits;8.breaker +10 fruits;9.roots;1.laves;11.pimpiellfolumimmaturegeefruits;12.pimpinelifolimbreakerfruits；13.pimpinellfolium breaker +5 fruits ;14.pimpinellfolium leaves.

Slβ-Hex基因在果實(shí)的表皮、外果皮、隔膜和種子中均有表達(dá)。在SA3中，表皮的表達(dá)水平在花后不同時(shí)間均高于隔膜和種子，尤其花后7d的表皮表達(dá)水平最高；在SA4中，花后7d的隔膜表達(dá)水平最高，而在花后4和10d的表皮表達(dá)水平高于隔膜和種子。圖3

2.5 Slβ-Hex啟動子順式作用元件分析

研究表明，基因表達(dá)主要受其上游的啟動子序列上分布的順式作用元件調(diào)控。利用在線工具PlantCare分析Slβ-Hex上游 840bp 啟動子上分布的順式作用元件。結(jié)果顯示，該序列除了含有典型的TATA-box、CAAT-box核心啟動子元件外，還分布有ABRE、AE-box，ARE，Box4，G-Box、GCN4_motif，GT1-motif，HD-Zip 3，MYB，MYB-like sequence，MYC，Myb，TCT-motif，TGA-element，chs-CMA2a等順式作用元件。表1

2.6Slβ-Hex啟動子序列 sgRNA分布和評價(jià)

研究表明，SIβ-Hex起始密碼子上游 840bp 的啟動子序列上分布著27條sgRNA，其中分布7條正鏈和20條負(fù)鏈，其中在起始密碼子上游 140bp 內(nèi)有7條sgRNA位于外顯子鄰接處或者含有TTTTs序列，因此在使用polIII啟動子時(shí)應(yīng)盡量不選擇。在其他20條sgRNA中，有10條sgRNA含有16個(gè)順式作用元件，包含9個(gè)CAAT-box，2條TGA-element，2條ARE，另外還含有1個(gè)CArG-box和2個(gè)ASR1bindingsite，預(yù)示若對這些sgRNA進(jìn)行基因編輯，有可能使其所含的順式元件序列突變，隨之啟動子調(diào)控的SIβ-Hex表達(dá)模式發(fā)生改變，對其進(jìn)行定點(diǎn)突變使其失活，抑制細(xì)胞壁水解程度，進(jìn)而調(diào)控果實(shí)過度軟化，改善番茄果實(shí)的耐貯性。圖4

注：1.SA3花后4d的表皮和外果皮；2.SA3花后4d的隔膜和種子;3.SA3花后7d的表皮；4.SA3花后7d的隔膜;5.SA3花后7d的種子；6.SA3花后10d的表皮；7.SA3花后 10d 的隔膜；8.SA3花后 10d 的種子；9.SA4花后4d的表皮和外果皮；10.SA4花后4d的隔膜和種子；11SA4花后7d的表皮；12.SA4花后7d的隔膜;13.SA3花后7d的種子;14.SA3花后10d的表皮；15.SA3花后10d的隔膜;16.SA4花后10d的種子。

圖3 基于RNA-sequence的番茄 Slβ-Hex 在果實(shí)不同部位的轉(zhuǎn)錄組 Fig.3 TheSlβ-Hextranscriptomeprofilingofthreefruit tissuesd baded on RNA -sequence

表1 Slb-Hex 啟動子順式作用元件

Tab.1 Predicted cis-regulatoryelements in Slb-Hex promoter

2.7 加工番茄Slβ-Hex基因的克隆

研究表明，以加工番茄8號的RNA為模板，以設(shè)計(jì)的 Slβ-Hex-F/Slβ-Hex-R 為引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序獲得Slβ-Hex的cDNA 序列，CDS大小為 1728bp 。表2，圖5

2.8Slβ-HexsgRNA的篩選、設(shè)計(jì)和選擇

研究表明，利用CRISPR－P尋找 Solyc01g 081610（β-D-N-乙酰氨基己糖苷酶，β-Hex）的sgRNA，PAM序列選擇NGG，N為任意核苷酸，優(yōu)先選擇在外顯子上，特異性好，GC含量適中，無特殊RNA結(jié)構(gòu)的序列作為靶標(biāo)序列并設(shè)計(jì)引物，一個(gè)基因挑選2個(gè)靶標(biāo)序列。篩選出的 β -Hex兩個(gè)靶點(diǎn)在一個(gè)外顯子上。表3，圖6

3討論

3.1游離N－聚糖是促進(jìn)果實(shí)成熟的重要信號分子，注射外源游離N－聚糖能加速番茄果實(shí)成熟軟化[14]。 β-Hex 在果實(shí)成熟軟化過程中特異性表達(dá)，參與果蔬果實(shí)的成熟軟化過程， β -hex可催化N-糖蛋白攜帶的復(fù)雜N-聚糖變?yōu)楣迅事短荖-聚糖，造成游離N-聚糖積累，加速成熟番茄果實(shí)的軟化[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，利用 RNAi干擾技術(shù)抑制a-Man或 β-Hex 表達(dá)后均可提高番茄果實(shí)硬度和延長保質(zhì)貯藏時(shí)間，而且未對包括產(chǎn)量在內(nèi)的其他表型性狀產(chǎn)生負(fù)面影響[5]RNAi技術(shù)一般是把反向重復(fù)基因序列通過轉(zhuǎn)基因?qū)胫参铮D(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過序列互補(bǔ)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，雙鏈RNA降解成小片段RNA，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)同源mRNA降解，阻斷靶基因的表達(dá)。RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）。能否在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控Slβ-Hex基因的表達(dá)，值得進(jìn)一步探討。

圖4 Slβ-Hex 啟動子包含的誘導(dǎo)型順式作用元件和sgRNAs

Fig. 4The position of cis-acting elements and sgRNAs in the promoter of Slβ-Hex

圖5Hex 電泳 CDL 2000 Marker：2000、1000、750、500、250 和100 bpFig.5 Hex electroph-0res is 2000、1000、750、500、250 and 100 bp

圖6雙sgRNA靶位點(diǎn)在SIβ-Hex中的位置

Fig.6The position of the dual sgRNA targeting sife in Slβ-Hex

表2 基因克隆所用引物

Tab.2 Primersusedinthisstudy

表3包含β-HexsgRNA的引物序列

Tab.3 Primer sequence containingβ -Hex sgRNA

啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5端上游的一段DNA序列，它調(diào)控著下游基因的表達(dá)方式[17]。本研究基于RNA-seq的Slβ-Hex的轉(zhuǎn)錄組分析表明，SIβ-Hex在果實(shí)中表達(dá)量較高，尤其在破色期表達(dá)量急劇上升，而在莖、葉、花蕾、花朵中的表達(dá)水平較低，進(jìn)一步證實(shí)了SIβ-Hex啟動子主要驅(qū)動SIβ-Hex基因在果實(shí)中表達(dá)，促進(jìn)果實(shí)成熟軟化。降低 Slβ-Hex 啟動子的活性，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控 Slβ-Hex 的表達(dá)量，將為提高番茄耐貯性開辟新途徑。

3.2啟動子本身不編碼任何蛋白質(zhì)，對下游基因的表達(dá)調(diào)控主要通過其包含的順式作用元件與對應(yīng)的反式作用因子的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。SIβ-Hex啟動子包含眾多順式作用元件，其中一些重要元件包含在sgRNA序列中，預(yù)示著利用基因編輯技術(shù)可以敲除這些元件，改變啟動子的功能[18]。番茄MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子SIRIN（RIPENING IN-HIBITOR）是果實(shí)成熟過程中的正調(diào)控因子[19]在RIN轉(zhuǎn)錄因子功能缺失的rin突變體中，許多成熟相關(guān)的代謝途徑受到影響。轉(zhuǎn)錄因子ASR1（Abscisicacid stressripening1）是非生物脅迫調(diào)控基因編碼的低分子量植物特異性蛋白質(zhì)。當(dāng)番茄中的 SIRIN 或 SIASR1 的表達(dá)被抑制時(shí)，SIβ-Hex啟動子活性降低、Slβ-Hex酶表達(dá)量減少[20]。SIRIN 和 SIASR1 分別與 SIβ－Hex 啟動子含有的順式作用元件CArG-box和ASR1結(jié)合位點(diǎn)（C2-3（C/G）A）結(jié)合[21]，調(diào)控 Slβ-Hex 啟動子活性。研究表明，在Slβ-Hex基因起始密碼子上游840bp的啟動子序列中，含有3個(gè)CArG-box和2個(gè)ASR1結(jié)合位點(diǎn)，其中1個(gè)CArG-box和2個(gè)ASR1結(jié)合位點(diǎn)分別包含在sgRNA序列中，預(yù)示著可以利用基因編輯技術(shù)將這3個(gè)順式元件敲除，降低Slβ-Hex啟動子活性，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控SIβ-Hex的表達(dá)，提高番茄耐貯性。

番茄Slβ-Hex是一個(gè)基因家族，基因組搜索結(jié)果表明，還存在 Slβ-Hex2 和 Slβ-Hex3 ，分別位于第5和第11條染色體上，3條 Slβ-Hex 基因在基因組結(jié)構(gòu)、序列組成、表達(dá)模式等方面存在顯著差異。進(jìn)一步探明3個(gè)基因及其上游啟動子的功能和調(diào)控模式，將為進(jìn)一步利用基因編輯技術(shù)精準(zhǔn)改善番茄耐貯性及其它相關(guān)重要農(nóng)藝性狀提供依據(jù)。

4結(jié)論

番茄Slβ-Hex基因位于番茄第1號染色體的互補(bǔ)鏈上，由2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子組成，編碼575個(gè)氨基酸。Slβ-Hex含有Glycoh_ydro_20b2家族保守域和GH20_HexA_HexB-like保守域。基于RNA-seq 的SIβ-Hex 轉(zhuǎn)錄組分析表明， Slβ-Hex 主要在番茄的果實(shí)中表達(dá)，尤其在果皮中表達(dá)量較高。分析SIβ-Hex起始密碼子上游 840bp 的啟動子序列分布的順式作用元件，該序列除了含有典型的TATA-box和CAAT-box核心啟動子元件外，還分布有ABRE、AE-box，ARE，Box4，G-Box、GCN4_motif，GT1-mo-tif，HD - Zip 3，MYB，MYB - like sequence，MYC，Myb，TCT- motif，TGA-element，chs-CMA2a等眾多順式作用元件。在線工具CRISPRdirect分析表明，該啟動子的正鏈分布7條sgRNA，負(fù)鏈分布20條sgRNA，其中的10條sgRNA含有16個(gè)順式作用元件，包含9個(gè)CAAT-box，2個(gè)TGA-element，2個(gè)ARE，2個(gè)ASR1binding site，1個(gè) CArG-box ，根據(jù)CRISPR-Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，最終篩選出的 β-Hex 兩個(gè)靶點(diǎn)在一個(gè)外顯子上，預(yù)示選用高特異性sgRNA進(jìn)行基因編輯，有可能使其所含的順式元件序列突變，抑制改變 Slβ-Hex 的表達(dá)，調(diào)控果實(shí)過度軟化，從而提高番茄果實(shí)的耐貯性。

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Molecular characteristics and promoter analysis of Slβ-Hex gene in tomato

ZHANG Xiying，LIU Jiangna，BAI Yunfeng，LI Rongxia，ZHANG Aiping （Institute of Agricultural Sciences， Sixth Division， Xinjiang Production and Construction Corps ，Wujiaqu Xinjiang 831300，China）

Abstract：【Objective】Playing an important role in fruit ripening and softening，In order to inactivate the tomato cell wall glycoside hydrolase gene β-Hex by mutation of CRISPR -Cas system and inhibit the degradation of n -glycoprotein and the production of free n-glycan，to reduce the degree of hydrolytic softening of cell wall and regulate the excessive softening of tomato fruit lay the foundation for further research. CRISPRCas gene editing system will be used to regulate tomato fruit softening by site-specific mutation. 【Methods】 The characteristics，conserved domain，genome structure，digital expression profile and promoter cis-acting elements of Slβ-Hex polypeptide were systematically analyzed using biological online tools，and suitable sgRNAs were designed and screened according to CRISPR - Cas9 target design principles to promote the construction of tomato gene editing efficient expression vector.【Results】 Tomato SLβhex gene was located on the complementary chain of tomato chromosome 1，and composed of 2 exons and1 intron，encoding 575 amino acids. Transcriptome analysis of Slβ -Hex based on RNA -seq showed that Slβ -Hex was mainly expressed in the fruit of tomato，especiallyin the peel.The positive chain of the promoter distributed7 Sgrnas，negative chain distributed 2O Sgrnas，of which 10 Sgrnas contained 16 cis-acting elements.【Conclusion】High - specific sgRNA is selected for gene editing to mutate the cis -element sequence and inhibit the expresion of Slβ - Hex.

Key words：tomato； molecular characteristics of Slβ -Hex； promoter; Cis -acting element； sgRNA