新疆野生平菇的遺傳多樣性分析

中圖分類號：S188 文獻標志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）05-1266-07

0 引言

【研究意義】平菇（Pleurotus spp.）隸屬于擔子菌亞門Basidiomyceta、蘑菇目Agarieales、側耳科 Pleurotaceae、側耳屬 Pleurotus[1]，泛指生產(chǎn)栽培中的一類側耳屬食用菌[2.3]，又稱糙皮側耳物種復合群 Pleurotus ostreatus species complex[4.5]2021年我國平菇產(chǎn)量達611 ?34×10⁴t ，占我國食用菌總產(chǎn)量的 14.79% ，是我國第三大栽培菇種，平菇在我國新疆栽培范圍最廣、產(chǎn)量最高。野生平菇種質資源具有遺傳背景廣、變異大、抗逆性強等特征，是選育優(yōu)良菌種的有利資源[4]，新疆野生平菇種質資源豐富，然而目前關于新疆野生資源遺傳多樣性的情況并不明確。研究新疆野生平菇的遺傳多樣性，對開發(fā)挖掘平菇新品種基礎材料有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】ITS（internaltranscripitingspacer，內轉錄間隔區(qū)）序列是真菌中應用最廣泛的核糖體基因片段，被認為是真菌的 DNA 條形碼[7-8]。 ISSR（inter－ simple se-quencerepeat）分子標記多態(tài)性高、重復性好、成本低，是目前在食用菌中使用最廣泛的分子標記之-[9-10]。ITS 和 ISSR分子標記在側耳屬遺傳多樣性研究中均有廣泛應用[4.8-17]，He等[8]對不同側耳屬菌株的ITS序列進行了菌株內、種內及種間多態(tài)性分析，以評估ITS片段作為側耳屬DNA條形碼的可靠性，結果表明，除鮑魚菇外，ITS片段對其他側耳屬可進行有效鑒定。努爾孜亞·亞力買買提等[\"]采用ISSR標記對不同來源的野生平菇菌株進行了遺傳多樣性分析，顯示出較強的地域性，其中2株新疆野生菌株分在2個類群中?！颈狙芯壳腥朦c】目前有關新疆野生平菇生物學特征和遺傳多樣性方面的研究相對匱乏，需對從新疆不同區(qū)域采集的40個平菇菌株進行菌絲培養(yǎng)和遺傳多樣性評價?！緮M解決的關鍵問題】采用生物學培養(yǎng)和ITS/ISSR分子標記相結合的方法，確定菌株間的親緣關系和菌絲培養(yǎng)特點，篩選優(yōu)異種質，為豐富和開發(fā)平菇可利用性種質資源與育種材料提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1. 1.1 供試菌株

40個供試菌株保藏于新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所食用菌菌種庫。

1. 1.2 培養(yǎng)基

PDA標準培養(yǎng)基：稱 46g （PDA），加蒸餾水定容 1000mL，121% ， 15min 高壓滅菌，用于菌絲純化和培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 菌株純化

在凈化工作臺上，對40個野生平菇菌株進行菌株活化，將母種接種至PDA培養(yǎng)基平板，置于25^°C 培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。待菌絲長好后挑取菌落邊緣新生菌絲轉接至PDA培養(yǎng)基平板，連續(xù)轉接兩次即可得到純化菌株。

1.2.2 菌絲培養(yǎng)和菌落特征測定

待純化菌絲長滿平板后，用直徑為 9mm 的打孔器在菌落邊緣處取大小相同菌塊，分別接種于PDA培養(yǎng)基平板中心，每個處理設3個重復，放置 25^°C 培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7d。每日監(jiān)測菌絲的生長狀況，并對菌絲顏色、菌落邊緣形態(tài)、菌絲長速、菌絲長勢等進行定期統(tǒng)計。采用“十\"字形交叉法測定菌落直徑，計算菌絲生長速度。

1. 2.3 菌絲體培養(yǎng)和收集

將純化菌株用直徑 0.5cm 打孔器取菌塊接種至鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基平板上，置于 25°C 恒溫培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)5～7d，待菌絲長滿時，用滅菌的小藥匙沿著玻璃紙的表面將菌絲體輕輕刮下，收集至濾紙包好后放置烘干箱內 35^°C 烘干備用。

1.2.4 DNA提取和ITS序列測定

采用試劑盒法（新型植物基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司）進行基因組DNA的提取，用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量和PCR產(chǎn)物，Nano-5OO測定DNA的濃度，而后用滅菌的雙蒸水將樣品DNA濃度調至50ng/μL 左右，放至 -20% 冰箱內保存待用。

采用通用引物 ITS1-F/ITS4^[18] 作為擴增和測序引物，擴增ITS序列。PCR反應體系 25μL 引物（ 10μmol/L 各 1.0μL 模板 2.0μL，2×Taq PCRMasterMix 12.5μL 無菌雙蒸水補足至25μL 。PCR擴增程序： 94^°C 預變性 4min 94^°C 變性45s， 55^°C 退火 延伸 1min，30 個循環(huán)，72% 修復延伸 10min 。

測序工作委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成，采用BioEdit軟件讀取自測序列，對于因poly結構或基因組內缺失突變導致的套峰，采用反向測序，并采用Sequenchervl.1.4軟件拼接得到理想序列。將修飾好的自測序列在NCBI上進行BLASTn比對，選取挑選出相似度 99% 以上，覆蓋度 90% 以上的序列構建數(shù)據(jù)集，用MEGA7.O中Neighbor-joining法（Maximum like-hoodBootstraptrials =1 000 ），構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 ISSR擴增與聚類

通過引物篩選試驗[19]從28個引物中篩選出10個引物，進行ISSR-PCR擴增，擴增體系和程序參考朱堅[19]和李輝平[20]的方法。電泳結果進行人工比對校正，有條帶記為1，無條帶記為0，構建初始“0/1\"矩陣表。統(tǒng)計條帶總數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)并計算多態(tài)位點百分率 P ，計算公式為 P= k/n（100%） ，式中， P 為多態(tài)性條帶比率， k 為多態(tài)性條帶數(shù)， n 為測定的位點總數(shù)。表1

表1供試ISSR引物的序列

Tab.1 Sequence of ISSR primers usedinthestudy

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用NTSYSpcVersion2.1分析軟件根據(jù)SM相似系數(shù)按非加權組算數(shù)平均數(shù)（UPGMA）進行遺傳相似性聚類，根據(jù)聚類圖分析供試野生平菇菌株間的遺傳多樣性及遺傳分化特征。

2 結果與分析

2.1 野生平菇菌株菌絲培養(yǎng)特征比較

研究表明，40個野生平菇菌株菌絲顏色基本均為白色，菌絲較為濃密且邊緣整齊，菌落形態(tài)上無顯著差異。在菌絲生長速度方面差異較顯著，其中菌株XPG017和XPG021生長最快，平均生長速度為 11.85mm/d ；菌株XPG006生長最慢，平均生長速度為 5.75mm/d 。圖1，表2

2.2 ITS序列測定

研究表明，將40個平菇菌株大致劃分為4個類群，基本判定糙皮側耳（ P. ostreatus）有31個，佛羅里達側耳（P.floridanus）有6個，刺芹側耳（P.eryngii）有2個，肺形側耳（P.pulmonarius）有1個。圖2

表2平菇菌株的菌絲培養(yǎng)特征描述

Tab.2 The description of culture characteristics for Pleurotus spp.

續(xù)表2 平菇菌株的菌絲培養(yǎng)特征描述

Tab.2 The description of culture characteristics for Pleurotus spp

注：菌絲生長速度后的字母代表顯著性差異，小寫字母表示顯著水平 α=0.05 ，大寫字母表示 α=0 .01Notes：The lower case letter representsthe significant level α∝0.05 ，and the upper case letter represents the α∝0.01

圖1 平菇的菌絲形態(tài)特征 Fig. 1Hyphae of Pleurotus spp.

圖2 基于ITS序列的野生平菇的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2 Phylogenetictreebased on ITS sequence

2.3 遺傳多態(tài)性

研究表明，10條引物對40個供試菌株進行ISSR-PCR，不同引物擴增出的條帶在6～11條，共擴增出83條，平均每個引物擴增出8.3條。對每個引物擴增的多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)性條帶比例進行了統(tǒng)計，平均多態(tài)性條帶比率為 98.80% ，除P₂ 外，其他9個引物擴增的條帶多態(tài)性比率均為100.00% ，供試野生平菇菌株間的遺傳多態(tài)性較高。表3，圖3

在相似系數(shù)0.6時，40個菌株可劃分為3個類群：XPG001單獨為第I類群；XPG002和XPG006為第Ⅱ類群，其余為第Ⅲ類群，包含37個菌株，占總數(shù)的 92.50% ;在相似度為0.66時，又將第Ⅲ類群劃分為3個類群，其中采自察布查爾縣的XPG014單獨為一個類群；第二類群除了XPG028、XPG043、XPG047采自哈巴河縣，其余均采自烏魯木齊昌吉一帶;剩余第三類群采自伊犁哈薩克自治州、塔城地區(qū)與阿勒泰地區(qū)，顯示出較強的地域性，不同地理分布的新疆野生平菇具有較豐富的遺傳多樣性。圖4

表3 ISSR引物的擴增結果及多態(tài)性 Tab.3 Primerspolymorphism montained byISSRanalysis

3討論

3.1邊銀丙2認為其包括糙皮側耳 P ostrea-tus、紫孢側耳 P ：sapidus、白黃側耳 P . cornucopiae、肺形側耳P.pulmonarius和佛州側耳 P florida等5種可以人工栽培的食用菌，統(tǒng)稱為側耳類食用菌;鄭素月等[2]認為除了以上5個種之外，還包含鳳尾菇P.sajorcaju;張瑞穎等[3研究表明，已知側耳屬有50種，商業(yè)化栽培的有10余種，且這些近緣種之間大多可以雜交；Li等[4.13]從生物進化角度出發(fā)，結合形態(tài)特征指出我國的栽培“平菇”包含7個物種，即冷杉側耳P.abieticola、佛羅里達側耳P.floridanus刺芹側耳 P ：eryngii糙皮側耳P.ostreatus、卵孢側耳P.placentode肺形側耳 P. pulmonarius和白靈側耳 P ，tuoliensis，糙皮側耳復合群在側耳屬中是一個自然的單系，全球糙皮側耳復合群的系統(tǒng)發(fā)育分析可識別出20個系統(tǒng)發(fā)育種，劃分為3個支系及7個亞支系。因此對平菇種質資源進行準確鑒定和遺傳多樣性評價是開展優(yōu)良菌株選育和新品種開發(fā)，進而促進整個平菇產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的前提和基礎。

圖3 ISSR-PCR電泳圖譜（引物 P₁₁?P₁₈ 和 P₂₄ ）

Fig.3Agarose gel electrophoretic analysis of ISSR-PCR（ Primer P₁₁，P₁₈ and P₂₄ ）

圖4 供試平菇菌株ISSR多態(tài)性聚類

Fig.4The dendrogram based on ISSR of Pleurotus spp.

3.2采用生物學、ITS和ISSR 相結合的方法，欲從不同角度對新疆野生平菇菌株進行多樣性評價，然而40個菌株的菌落形態(tài)無明顯差異。ITS作為非編碼區(qū)，承受的選擇壓力較少，相對進化速率較快，并且能夠提供詳盡的系統(tǒng)學分析所需要的可遺傳性狀，被認為是真菌分類的首選條形碼，能對平菇中大多物種進行有效鑒定區(qū)分[8]。ISSR分子標記因無需預先克隆和測序，簡便有效，被廣泛應用于種質資源鑒定、遺傳作圖、基因定位及分析和評估生物種群的遺傳多樣性等方面[18]。研究中，ITS和ISSR均能明顯將 P ：pulmonarius ?_?P eryngii與其他菌株區(qū)分開來，ITS還能將 P. flori-danus鑒定出來，在物種鑒定方面比ISSR更為有效，然而ISSR標記可以將菌株按地理分布進行劃分。二者從不同角度證明了新疆野生平菇菌株具有豐富的遺傳多樣性。

4結論

采集于新疆境內的40個平菇樣本經(jīng)ITS序列測定并構建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可大致劃分為4個類群；對其生物學菌絲培養(yǎng)特征包括菌絲長速、長勢、菌落形態(tài)進行了描述；10條ISSR引物共擴增出83條清晰的DNA條帶，多態(tài)性條帶82條，多態(tài)比率為 98.80% 。遺傳相似系數(shù)為0.66時，可將40個樣本分為5個類群，并顯示出較強的地域性。

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Identification and genetic diversity of wild Pleurotus in Xinjiang

LUO Ying1，2，Nurziya Yarmamat1*，JIA Wenjie'， ZHU Qi² ， LI Yutong2，SHI Wenting2，JIA Peisong'

（1. Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crop in Northwestern Oasis， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi ， China; 2. Xinjiang Agricultural University， Urumqi 83Oo91， China）

Abstract：【Objective】 The objective of the study is to analyze their genetic diversity of wild strains of the Pleurotus in Xinjiang in the hope of providing basic materials and theoretical basis for enriching and developing new varieties.【Methods】 The ITS sequence was used to identify the species and the ISSR markers technology to carry out the genetic diversity analysis on 4O wild oyster mushroom strains.【Results】The mycelia of 40 strains of wild oyster mushroom in Xinjiang were basically white，and there were no significant diferences in colony morphology，but certain diferences in mycelia growth and growth speed. By ITS sequence analysis，40 strains couldbe divided into 4 groups.10 ISSR primersamplified atotal of 83 clear DNA bands，including 82 polymorphic bands with a polymorphism ratio of 98.8O% ，and the 40 tested strains were divided into 5 groups at thegenetic similarity coeficient ofO.66.In general，the 4O strains of wild oyster mushroom tested showed significant genetic diversity，which had important reference value for the breeding of Xinjiang oyster mushroom.【Conclusion】Pleurotus spp. strains have the occurrence of genetic differentiation with relatively rich genetic diversity.

Key words： oyster mushroom； Pleurotus ostreatus species complex； ITS;ISSR ;genetic diversity