長江中游紅鈴蟲耐寒性及滯育解除過程中耐寒物質(zhì)含量的變化

摘要

為了解長江中游紅鈴蟲Pectinophora gossypiella耐寒性及滯育解除過程中的生理變化與機(jī)制，本文對越冬代滯育紅鈴蟲4齡幼蟲的過冷卻點(diǎn)、冰點(diǎn)及耐寒物質(zhì)變化進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，長江中游地區(qū)紅鈴蟲越冬幼蟲的過冷卻點(diǎn)平均范圍為-14.88～-14.06℃，冰點(diǎn)平均范圍為-9.53～-5.63℃。各地理種群間過冷卻點(diǎn)差異不顯著，冰點(diǎn)差異顯著，過冷卻點(diǎn)與經(jīng)緯度無相關(guān)性。在滯育解除過程中，第21天時(shí)紅鈴蟲幼蟲過冷卻點(diǎn)和冰點(diǎn)出現(xiàn)顯著上升，平均值分別為-10.2℃和-5.2℃;幼蟲體內(nèi)含水量變化呈緩慢增加的趨勢，各處理間差異不顯著;總糖、海藻糖、甘油含量及灰分元素含量隨滯育的解除而顯著下降，而糖原含量變化趨勢則相反?？梢?，海藻糖等糖類和甘油等小分子多元醇在紅鈴蟲滯育過程中發(fā)揮了重要的抗凍保護(hù)作用，并在滯育解除過程中可轉(zhuǎn)化為糖原。

關(guān)鍵詞

紅鈴蟲; 滯育; 耐寒性; 過冷卻點(diǎn); 糖類; 甘油

中圖分類號(hào)：

S 435.622

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024422

Cold tolerance and changes in coldtolerant substances during diapause termination of Pectinophora gossypiella in the middle reaches of Yangtze River

CONG Shengbo1， WANG Ling1， YIN Haichen1， ZHANG Yanqin2， XU Dong1， YANG Nina1，WU Huaiheng1， WAN Peng1*

（1. Institute of Plant Protection and Soil Fertilizer， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Huazhong Key

Laboratory of Crop Integrated Pest Management， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Hubei Key

Laboratory of Crop Disease， Insect Pests and Weed Control， Wuhan 430064， China; 2. Shishou

Municipal Bureau of Natural Resources and Planning， Jingzhou 434499， China）

Abstract

To investigate the cold tolerance and physiological changes during diapause termination in overwintering Pectinophora gossypiella from the middle reaches of Yangtze River， we measured the supercooling point， freezing point， and changes in coldtolerant substances in diapause fourthinstar larvae. The results showed that the mean supercooling points ranged from -14.88℃ to -14.06℃， and the mean freezing points ranged from -9.53℃ to -5.63℃. No significant differences were found among the supercooling points of different geographic populations， whereas freezing points differed significantly. Supercooling points showed no correlation with latitude and longitude. During diapause termination， by day 21， both the supercooling point and freezing point increased significantly， with average values of -10.2℃ and -5.2℃， respectively. Larval water content showed a slight increasing trend with no significant differences among treatments. Total sugar， trehalose， glycerol， and ash element content significantly decreased during diapause termination， while glycogen content exhibited an opposite trend. These findings suggest that sugars such as trehalose and polyols such as glycerol play an important role in antifreeze protection during diapause and are gradually converted into glycogens as diapause terminates.

Key words

Pectinophora gossypiella; diapause; cold tolerance; supercooling point; carbohydrate; glycerol

昆蟲是變溫動(dòng)物，耐寒能力的強(qiáng)弱直接影響此物種在生態(tài)系統(tǒng)中的種群興衰。長期協(xié)同進(jìn)化過程中昆蟲形成了多種耐寒策略，通過種群遷徙、滯育或增強(qiáng)抗凍性克服不利環(huán)境條件的影響［12］。滯育作為昆蟲抵抗寒冷的生態(tài)行為策略中的一種特殊方式，不僅可以使其維持種群的繁衍，還能調(diào)節(jié)個(gè)體間發(fā)育進(jìn)度，有更多的交配機(jī)會(huì)產(chǎn)生更多后代［34］。研究表明，滯育昆蟲的耐寒性與其體內(nèi)的脂類、碳水化合物、蛋白質(zhì)及小分子抗凍保護(hù)劑等物質(zhì)積累與轉(zhuǎn)化關(guān)系密切［56］。歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis幼蟲在進(jìn)入滯育之前體內(nèi)積累大量脂肪，以保證滯育期間的能量來源［7］。特斑蛾Zygaena trifolii 滯育期間脂肪含量有輕微的波動(dòng)，而糖原含量顯著降低，糖原與其他物質(zhì)間存在相互轉(zhuǎn)化［8］。紅脂大小蠹Dendroctonus valens越冬期間體內(nèi)甘油、海藻糖、山梨醇的含量均顯著升高，是其主要的越冬抗凍保護(hù)物質(zhì)［9］。甘油是許多越冬滯育昆蟲常見的醇類積累物質(zhì)之一，也有如山梨醇、肌醇、蘇糖醇、核糖醇等其他類型醇類物質(zhì)的積累［5］。許多研究都證實(shí)上述醇或糖的合成與滯育狀態(tài)有一定關(guān)系。

紅鈴蟲Pectinophora gossypiella屬鱗翅目Lepidoptera麥蛾科Gelechiidae，對我國長江流域棉花的生產(chǎn)造成很大危害，近些年隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在我國的大面積種植，紅鈴蟲得到了有效控制［10］。也有研究顯示，紅鈴蟲對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的耐受性增強(qiáng)，發(fā)生與為害有加重的趨勢［11］。紅鈴蟲屬兼性滯育，滯育與否取決于外界環(huán)境條件。滯育的誘導(dǎo)需要多個(gè)環(huán)境因子共同作用，如低溫、低濕、光周期和食料等［1213］。其中光周期為重要的誘導(dǎo)信號(hào)，日照長度低于13 h就可發(fā)生滯育［14］。相反，滯育的解除和幼蟲化蛹條件則是長日照、高濕和高溫［15］。紅鈴蟲進(jìn)入滯育，體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，如幼蟲含水量逐步下降，氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪含量顯著上升［1620］。本文對紅鈴蟲越冬幼蟲耐寒性及滯育解除體內(nèi)物質(zhì)變化進(jìn)行了系統(tǒng)研究，探討了耐寒性與其體內(nèi)糖類、甘油等物質(zhì)的關(guān)系，旨在為該蟲的耐寒機(jī)制和預(yù)測預(yù)報(bào)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蟲源為2022年12月份在江西彭澤（116°32′E，29°51′N）、湖北黃岡（114°52′E，30°27′N）、湖北天門（113°19′E，30°51′N）、湖南常德（111°41′E，29°02′N）、湖南安鄉(xiāng)（112°10′E，29°25′N）、安徽安慶（117°03′E，30°31′N）共6個(gè)地區(qū)野外采集的越冬代（4齡）紅鈴蟲，每地區(qū)采集蟲量500～1 000頭。

1.2 滯育解除

選取大小一致的越冬代紅鈴蟲4齡幼蟲，分裝于24孔養(yǎng)蟲板內(nèi)，再置于溫度28℃， 相對濕度60%～70％，光周期L∥D=13 h∥11 h的人工氣候箱（PRX450D， 寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）中解除滯育［21］直至化蛹，每隔7 d收集幼蟲1次，用于過冷卻點(diǎn)及抗寒物質(zhì)的測定。

1.3 越冬幼蟲過冷卻點(diǎn)和冰點(diǎn)的測定

采用熱電偶原理進(jìn)行過冷卻點(diǎn)和冰點(diǎn)的測定［22］。選取蟲體大小一致的紅鈴蟲4齡幼蟲，將待測蟲體放入1.5 mL離心管中，每管1頭，將智能昆蟲過冷卻測定儀（SUNV，北京鵬程電子科技中心，測量范圍-55～55℃，精度±0.3℃）的感溫探頭伸入管中并與蟲體腹面緊密接觸，用脫脂棉固定，置于高低溫試驗(yàn)箱（REXC900，意爾達(dá)試驗(yàn)設(shè)備制造有限公司）1℃/min 降溫，蟲體溫度變化通過計(jì)算機(jī)及其配套軟件進(jìn)行自動(dòng)記錄，實(shí)時(shí)繪制蟲體溫度變化曲線。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)測定15頭幼蟲。

1.4 越冬幼蟲體內(nèi)的含水量和灰分元素的測定

體內(nèi)含水量和灰分元素測定分別參考劉玉娟等［22］和賈龍等［23］的方法。取10頭紅鈴蟲4齡幼蟲，用電子天平［ME204E，梅特勒托利（上海）有限公司］稱總重，然后把試蟲放入60℃烘箱（FCD3000，萊特機(jī)械設(shè)備有限公司）中24 h，取出后迅速稱重并記錄，得到蟲體自由水含量。稱完后再把試蟲放入105℃烘箱中24 h，取出后迅速稱重并記錄，得到蟲體結(jié)合水的含量。最后采用高溫灼燒法再測定其灰分含量。 每處理重復(fù)3次。

1.5 越冬幼蟲體內(nèi)糖類含量的測定

參照劉兆良等［24］的方法測定糖類含量。

1.5.1 總糖含量的測定

取紅鈴蟲4齡幼蟲10頭，蒸餾水沖洗、去除體表水分并稱重后，放入勻漿器（福州泰美實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）中，加入蒸餾水充分勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)入10 mL的離心管中， 用10％三氯乙酸溶液沖洗勻漿器，合并勻漿液后離心5 min （離心力為7 000 g），將上清液轉(zhuǎn)入另一10 mL離心管中。沉淀用10％三氯乙酸溶液清洗2次，離心，合并上清液，加入10%三氯乙酸溶液補(bǔ)足至10 mL，待測，試驗(yàn)重復(fù)3次。含量測定采用恩酮比色法，用紫外分光光度計(jì)［UV2700，島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司］在620 nm波長下進(jìn)行比色分析，采用D葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。

1.5.2 海藻糖和糖原含量的測定

參照上述總糖的制樣方法取得上清液后，加入無水乙醇4 mL后放入4℃冰箱中靜置24 h。取放置24 h的上清液l mL，離心15 min （離心力為14 000 g），上清液加入0.15 mol/L 硫酸溶液l mL，沸水浴水解15 min，充分冷卻后緩慢加入30% KOH溶液l mL，振蕩混勻后沸水浴15 min，冷卻后取上清液即得到海藻糖測定樣品。離心管中剩余的沉淀用1 mL蒸餾水溶解，待沉淀充分溶解后，作為待測糖原樣品。試驗(yàn)重復(fù)3次。在620 nm下進(jìn)行比色分析，方法同上。

根據(jù)待測液的吸光度，在D葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖含量，按下式計(jì)算試蟲體內(nèi)各種測試成分的實(shí)際含量。

蟲體含糖量（μg/mg）=［從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的糖含量（μg/mL）×樣品稀釋量（mL）］/蟲體質(zhì)量（mg）。

1.6 甘油含量的測定

取紅鈴蟲4齡幼蟲10頭，按1.5的方法沖洗、稱重、勻漿，用4 mL蒸餾水4次沖洗玻璃棒。室溫離心10 min（離心力為7 000 g），取上清液移入10 mL玻璃試管中。沉淀加入蒸餾水5 mL搖勻，再離心1次，合并上清液。每處理重復(fù)3次。含量測定采用高碘酸氧化還原法，用甘油制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，甘油濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。

根據(jù)待測液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的甘油含量，按下式計(jì)算試蟲體內(nèi)甘油的實(shí)際含量。

蟲體甘油含量（μg/mg）=［從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的甘油含量（μg/mL）×樣品稀釋量（mL）］/蟲體質(zhì)量（mg）。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

不同處理間數(shù)據(jù)差異性采用單因素方差分析，多重比較采用Duncan氏新復(fù)極差法，采用斯皮爾曼等級相關(guān)分析法，分析不同變量間的相關(guān)性。以上所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 22.0軟件完成，繪圖在Microsoft Excel軟件上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 長江流域中游地區(qū)紅鈴蟲越冬幼蟲的抗寒性

由表1可知，長江流域中游6個(gè)地區(qū)間紅鈴蟲越冬4齡幼蟲的過冷卻點(diǎn)差異不顯著（F5，12=1.297;P=0.328），結(jié)冰點(diǎn)差異顯著（F5，12=7.87; P=0.002）。湖北天門種群幼蟲過冷卻點(diǎn)和冰點(diǎn)值均為最高，幼蟲個(gè)體間過冷卻點(diǎn)變化范圍最大，江西彭澤種群幼蟲個(gè)體間過冷卻點(diǎn)變化最小。通過斯皮爾曼等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，長江中游不同地理種群紅鈴蟲幼蟲過冷卻點(diǎn)與經(jīng)度（P=0.240）、緯度（P=0.701）無相關(guān)性。

2.2 紅鈴蟲越冬幼蟲滯育解除過程中過冷卻點(diǎn)和冰點(diǎn)的變化

由圖1可見，在第0、7 天和第14 天，紅鈴蟲4齡幼蟲的過冷卻點(diǎn)值分別為-14.3℃、-13.4℃和-14.23℃，冰點(diǎn)值分別為-7.5℃、-7.1℃和-7.9℃，三者間差異均不顯著（過冷卻點(diǎn)：F2，6=2.015，P=0.214;冰點(diǎn)：F2，6=0.552，P=0.603）。第21天紅鈴蟲幼蟲的過冷卻點(diǎn)和冰點(diǎn)平均值分別為（-10.2±0.4）℃和（-5.2±0.4）℃，與前三者相比差異顯著（過冷卻點(diǎn)：F3，8=30.02，P=0.00;冰點(diǎn)：F3，8=5.62，P=0.023）。

2.3 紅鈴蟲越冬幼蟲滯育解除過程中體內(nèi)含水量和灰分元素含量的變化

滯育解除過程中，紅鈴蟲4齡幼蟲蟲體自由水和結(jié)合水含量變化均呈緩慢增加的趨勢，但各處理間差異不顯著（自由水：F3，8=0.476，P=0.707;結(jié)合水：F3，8=0.465，P=0.714），自由水含量平均值為59.4%～61.0%，結(jié)合水含量平均值為3.3%～4.4%。紅鈴蟲4齡幼蟲蟲體灰分元素含量呈逐漸下降的趨勢（F3，8=4.64，P=0.043），第0天灰分元素含量為4.2%，至第21天灰分元素含量降為2.9%，兩處理間差異顯著（圖2）。

2.4 紅鈴蟲越冬幼蟲滯育解除過程中體內(nèi)糖類含量的變化

由圖3可見，紅鈴蟲4齡幼蟲滯育解除過程中體內(nèi)總糖和海藻糖含量均存在顯著變化（總糖：F3，8=6.99，P=0.013; 海藻糖：F3，8=25.26，P=0.000），呈現(xiàn)由高到低的趨勢。第0天總糖和海藻糖含量最高，分別為31.36 μg/mg和12.11 μg/mg，與其他3個(gè)處理相比，差異顯著。而糖原含量變化與總糖和海藻糖含量變化趨勢相反，呈現(xiàn)由低到高增加的趨勢，第21天糖原含量為5.94 μg/mg， 與其他3個(gè)處理相比，差異顯著（F3，8=3.72，P=0.042）。

2.5 紅鈴蟲越冬幼蟲滯育解除過程中體內(nèi)甘油含量的變化

紅鈴蟲4齡幼蟲滯育解除過程中甘油含量存在顯著變化（F3，8=6.17，P=0.018）。第0天體內(nèi)甘油含量最高，為16.06 μg/mg，隨后體內(nèi)甘油含量逐漸降低，第14天甘油含量降至12.37 μg/mg，第21天甘油含量略有上升，為13.00 μg/mg（圖4）。

3 結(jié)論與討論

滯育是生長、發(fā)育的停頓狀態(tài)，是許多昆蟲為逃避田間生境的季節(jié)不利性，增強(qiáng)自身耐寒性而采取的生存策略［25］。耐寒性的強(qiáng)弱直接決定其種群分布，而過冷卻點(diǎn)是衡量耐寒性的重要指標(biāo)［24］。本研究測得長江流域中游6個(gè)地區(qū)間紅鈴蟲越冬幼蟲的過冷卻點(diǎn)差異不顯著，過冷卻點(diǎn)與經(jīng)緯度無相關(guān)性，這可能與各地區(qū)緯度跨度較小有關(guān)。不同地理種群亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis滯育幼蟲耐寒性也表現(xiàn)出較小緯度跨度種群間的耐寒性差異不顯著，這與本研究結(jié)果較一致［26］。

紅鈴蟲一旦進(jìn)入滯育，體內(nèi)含水量減少，待溫度上升滯育解除的過程中，其體內(nèi)水分含量又逐漸增加，而脂肪含量變化則相反，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，紅鈴蟲幼蟲解除滯育過程中，體內(nèi)含水量呈緩慢增加的趨勢，這與傅勝發(fā)等［18］的研究結(jié)果一致。解除滯育第21天紅鈴蟲幼蟲的過冷卻點(diǎn)和冰點(diǎn)，出現(xiàn)了顯著的升高，這可能與其體內(nèi)抗凍物質(zhì)進(jìn)行了代謝轉(zhuǎn)化，含量降低有關(guān)。

許多滯育昆蟲越冬期間常通過積累糖類、糖原或小分子多元醇來增加其抗寒性［27］?？萑~蛺蝶Kallima inachus滯育期間積累大量海藻糖［28］。Cymbalophora pudica滯育期間會(huì)積累大量糖原［29］。甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae蛹進(jìn)入滯育過程，其體內(nèi)海藻糖含量顯著增加，耐寒性增強(qiáng)［30］。在滯育期間，鞭角華扁葉蜂Chinolyda flagellicornis糖原和海藻糖含量呈相反的變化趨勢，兩者存在相互轉(zhuǎn)變［31］。有些昆蟲種類滯育解除，糖原可轉(zhuǎn)化為糖類或醇類，還可和海藻糖之間進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化［28，32］。黃足黑守瓜Aulacophora lewisii可將糖原轉(zhuǎn)化為肌醇［33］。實(shí)蠅類昆蟲Eurosta solidaginis 滯育幼蟲體內(nèi)糖原可逐漸轉(zhuǎn)化為甘油、山梨醇等冷凍保護(hù)劑，翌年溫度升高，部分低溫保護(hù)物質(zhì)可重新轉(zhuǎn)化為糖原［34］。本研究結(jié)果顯示，紅鈴蟲幼蟲滯育解除過程中，海藻糖和甘油含量逐漸降低，而糖原含量卻逐漸升高。反過來說明，紅鈴蟲幼蟲在進(jìn)入滯育過程中，體內(nèi)的糖原會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為海藻糖和甘油等抗凍保護(hù)物質(zhì)，并出現(xiàn)量的積累，在越冬過程中發(fā)揮重要作用。這種情況與大斑芫菁Mylabris phalerata幼蟲進(jìn)入滯育，體內(nèi)海藻糖和甘油含量逐漸升高，而糖原含量逐漸降低的報(bào)道一致［35］。本研究通過對滯育紅鈴蟲耐寒性及體內(nèi)各種生化物質(zhì)的測定，探討其越冬耐寒機(jī)制，以期為長江流域中游地區(qū)紅鈴蟲預(yù)測預(yù)報(bào)及綜合治理提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：張文蔚）