點(diǎn)蜂緣蝽滯育和非滯育對嗅覺相關(guān)基因表達(dá)的影響

摘要

有研究表明滯育和非滯育點(diǎn)蜂緣蝽Riptortus pedestris對聚集信息素的感受存在顯著差異，本研究擬通過測定滯育和非滯育點(diǎn)蜂緣蝽觸角轉(zhuǎn)錄組，尋找表達(dá)差異的嗅覺相關(guān)基因，分析與滯育關(guān)聯(lián)的信息素識別機(jī)制。利用高通量測序平臺BGISEQ500對滯育和非滯育點(diǎn)蜂緣蝽雌、雄成蟲觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選差異表達(dá)基因并進(jìn)行通路富集分析，同時對差異表達(dá)的嗅覺基因進(jìn)行RTqPCR驗(yàn)證。點(diǎn)蜂緣蝽觸角轉(zhuǎn)錄組共獲得57 648條unigenes，其中61.05%在七大公共數(shù)據(jù)庫中成功注釋。注釋到NR數(shù)據(jù)庫的基因最多（52.90%），匹配到茶翅蝽Halyomorpha halys的序列最多，為55.83%。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，與非滯育雌蟲相比，滯育雌蟲觸角中共篩選到2 222個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因1 288個，下調(diào)表達(dá)基因934個;與非滯育雄蟲相比，滯育雄蟲觸角中共篩選到2 293個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因1 410個，下調(diào)表達(dá)基因883個;雌、雄蟲觸角間差異基因較少，分別為315個（滯育）和584個（非滯育）。進(jìn)一步對嗅覺相關(guān)基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：滯育和非滯育雌蟲觸角間10個化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）基因和11個氣味結(jié)合蛋白（odorantbinding proteins，OBPs）基因差異表達(dá);滯育和非滯育雄蟲觸角有7個CSPs基因和11個OBPs基因差異表達(dá);滯育雌、雄成蟲僅有1個OBP基因表達(dá)出現(xiàn)差異;非滯育雌、雄蟲間有4個CSPs基因和3個OBPs基因差異表達(dá)。從差異表達(dá)的嗅覺相關(guān)基因中選取10個基因（4個OBPs，4個CSPs 2個ORs）進(jìn)行RTqPCR驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序相符。研究結(jié)果將為今后點(diǎn)蜂緣蝽識別聚集信息素的分子機(jī)制及研發(fā)更為高效的化學(xué)通訊調(diào)控技術(shù)提供參考。

關(guān)鍵詞

點(diǎn)蜂緣蝽; 觸角轉(zhuǎn)錄組; 生殖滯育; 嗅覺相關(guān)基因; 差異表達(dá)基因

中圖分類號：

S 476.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024416

Effects of diapause and nondiapause on the expression of olfactoryrelated genes in Riptortus pedestris

XIE Minghui， ZHONG Yongzhi， LIN Lulu， ZHANG Guangling， ZHAO Wei， CHEN Haoliang*

（Institute of Plant Protection and Agroproducts Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230001， China）

Abstract

Previous studies have shown significant differences in the response to aggregation pheromones between diapause and nondiapause individuals of Riptortus pedestris. To explore the molecular mechanisms underlying pheromone recognition associated with diapause， the antennal transcriptomes of diapause and nondiapause male and female adults were sequenced using the BGISEQ500 highthroughput sequencing platform， screened for differentially expressed genes （DEGs）， performed pathway enrichment analysis， and validated differentially expressed olfactoryrelated genes by RTqPCR. A total of 57 648 unigenes were obtained from the antennal transcriptome， with 61.05% successfully annotated in seven public databases. The highest annotation rate was to the NR database （52.90%）， with most matches corresponding to Halyomorpha halys （55.83%）. Transcriptome analysis identified 2 222 DEGs between diapause and nondiapause females （1 288 upregulated， 934 downregulated） and 2 293 DEGs between diapause and nondiapause males （1 410 upregulated， 883 downregulated）. Comparatively fewer DEGs were found between sexes within the same diapause status： 315 DEGs for diapause and 584 DEGs for nondiapause groups. Analysis of olfactoryrelated genes revealed that ten chemosensory protein （CSP） genes and eleven odorantbinding protein （OBP） genes were differentially expressed between diapause and nondiapause females， while seven CSP genes and eleven OBP genes were differentially expressed between diapause and nondiapause males. Only one OBP gene was differentially expressed between diapause females and males， whereas four CSP genes and three OBP genes differed between nondiapause females and males. Ten olfactoryrelated genes （four OBP genes， four CSP genes） and two OR genes were selected for RTqPCR validation， and the results were consistent with the transcriptome data. These results provide a reference for understanding the molecular mechanisms of pheromone recognition in R.pedestris and support the development of more efficient chemical communication regulation technologies.

Key words

Riptortus pedestris; antennal transcriptome; reproductive diapause; olfactoryrelated genes; differentially expressed genes

點(diǎn)蜂緣蝽Riptortus pedestris屬半翅目Hemiptera蛛緣蝽科Alydidae，是重要的刺吸性害蟲［1］。該蟲每年可發(fā)生2～3代，成蟲和若蟲均以刺吸植株汁液為食，主要為害大豆、蠶豆、豌豆等豆科植物，可造成植株貪青、空莢癟粒等“癥青”現(xiàn)象［23］。成蟲具有很強(qiáng)的飛行能力，同時可傳播多種病原菌，嚴(yán)重影響豆科作物的產(chǎn)量和品質(zhì)［2，4］。近年來，點(diǎn)蜂緣蝽對我國大豆的為害加重，在河南、河北、山東、安徽、北京、山西、陜西等地均有暴發(fā)，且呈逐年加重趨勢，已成為我國大豆生產(chǎn)上亟待解決的重要問題［1， 57］。利用聚集信息素誘殺點(diǎn)蜂緣蝽是有效的綠色防控手段，具有廣闊的應(yīng)用前景［8］。

昆蟲通過嗅覺感知環(huán)境中的氣味，完成寄主定位、求偶、交配、尋找產(chǎn)卵場所和躲避敵害等行為活動［910］。觸角是昆蟲重要的嗅覺感受器官，通過一系列復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)對各種氣味分子的精確靈敏識別和特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［1011］。觸角感器中的多種蛋白參與構(gòu)建昆蟲的外周嗅覺系統(tǒng)，主要有化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）、氣味結(jié)合蛋白（odorantbinding proteins，OBPs）、 味覺受體（gustatory receptors，GRs）、嗅覺受體（olfactory receptors，ORs）、離子型受體（ionotropic receptors，IRs）和感覺神經(jīng)元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）等［12］。嗅覺相關(guān)基因與昆蟲的滯育息息相關(guān)，切除果蠅Drosophila melanogaster觸角會縮短滯育成蟲的壽命，降低滯育解除后的繁殖力，嗅覺受體神經(jīng)元和溫度感應(yīng)神經(jīng)元是滯育成功恢復(fù)所必需的［13］。尖音庫蚊Culex pipiens介導(dǎo)滯育的核心鐘基因Cycle能夠調(diào)控嗅覺相關(guān)基因的表達(dá)［14］。

光周期是誘導(dǎo)點(diǎn)蜂緣蝽生殖滯育的主要因子，成蟲在短日照（lt;13.5 h）進(jìn)入生殖滯育狀態(tài)［15］。此時，雌蟲卵巢停止發(fā)育;雄蟲的附腺囊空癟，不再合成和釋放聚集信息素［16］。點(diǎn)蜂緣蝽的聚集信息素是由雄性成蟲分泌釋放的，主要包括3個組分：異丁酸十四酯（tetradecyl isobutyrate， 14∶iBu）、反2己烯基順3己烯酸酯［（E）2hexenyl （Z）3hexenoate， E2HZ3H］和反2己烯基反2己烯酸酯［（E）2hexenyl （E）2hexenoate， E2HE2H］［17］。點(diǎn)蜂緣蝽雄蟲在非滯育狀態(tài)、寄主植物適宜且充足、營養(yǎng)狀態(tài)良好的前提下合成和分泌聚集信息素;而其他個體在食物源缺乏時，對聚集信息素的敏感性會顯著增加［1619］。在田間，秋季來臨后日照時間逐漸縮短，食物的數(shù)量和質(zhì)量都隨之降低。此時，進(jìn)入生殖滯育的點(diǎn)蜂緣蝽雌蟲雖不與雄蟲交配，但對作為食物源信號的聚集信息素更加敏感［15］。由此推斷，參與聚集信息素識別的嗅覺相關(guān)基因在滯育和非滯育點(diǎn)蜂緣蝽雌蟲間的表達(dá)可能存在差異。

為了探索點(diǎn)蜂緣蝽嗅覺相關(guān)基因在聚集信息素識別中的作用，本研究借助高通量測序?qū)头菧c(diǎn)蜂緣蝽成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行生物學(xué)分析，發(fā)掘參與嗅覺感受的重要基因，同時篩選出差異表達(dá)的嗅覺相關(guān)基因。研究結(jié)果將為今后點(diǎn)蜂緣蝽識別聚集信息素的分子機(jī)制及研發(fā)更為高效的化學(xué)通訊調(diào)控技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

點(diǎn)蜂緣蝽成蟲采集于宿州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地（117.09°E， 33.65°N），在人工氣候室內(nèi)的養(yǎng)蟲籠（50 cm×50 cm×50 cm，鋁合金框架，尼龍網(wǎng)罩，紗網(wǎng)網(wǎng)孔為50目）內(nèi)用玉米和四季豆飼養(yǎng)擴(kuò)繁建立實(shí)驗(yàn)種群。飼養(yǎng)條件為溫度（24±1）℃，相對濕度為（70±5）%，光周期為L∥D=16 h∥8 h。待點(diǎn)蜂緣蝽在室內(nèi)飼養(yǎng)5代以上后，采集蟲卵并置于新的養(yǎng)蟲籠中，將光周期分別調(diào)整為L∥D=16 h∥8 h和L∥D=10 h∥14 h，其他飼養(yǎng)條件不變。光周期L∥D=16 h∥8 h條件下點(diǎn)蜂緣蝽可以正常繁殖;而光周期L∥D=10 h∥14 h條件下點(diǎn)蜂緣蝽進(jìn)入生殖滯育狀態(tài)［1415］。將2個光周期下羽化5 d的雌雄成蟲觸角剪下，經(jīng)液氮研磨后放入-80℃超低溫冰箱保存待用，每處理15頭，重復(fù)3次。

1.2 觸角總RNA的提取

采用TRIzolReagent（Invitrogen， Carlsbad， CA， USA）分別提取滯育和非滯育點(diǎn)蜂緣蝽雌、雄成蟲觸角總RNA，并用DNase I（TaKaRa， Dalian， China）清除RNA樣品中殘留的基因組DNA。用Nano Drop 2000（Thermo Scientific， Wilmington， DE， USA）檢測RNA的純度，使用Fragment Analyzer（Agilent 5300， CA， USA）生物分析儀檢測樣品RNA的濃度和完整性，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 cDNA文庫的構(gòu)建和測序

對檢測合格的RNA樣品進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序，基本流程為：取一定量的RNA樣品，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA;用打斷緩沖液將mRNA片段化;轉(zhuǎn)錄后合成雙鏈cDNA;修復(fù)雙鏈cDNA末端，并在3′末端加上A堿基，配制接頭連接反應(yīng)體系，使接頭與cDNA連接，對產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增和質(zhì)檢。文庫質(zhì)檢后，將PCR產(chǎn)物熱變性成單鏈，用一段橋式引物將單鏈DNA環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫，消化掉未被環(huán)化的線性DNA分子;單鏈環(huán)狀DNA分子通過滾環(huán)復(fù)制，形成一個包含多個拷貝的DNA納米球（DNB）。將得到的DNBs采用高密度DNA 納米芯片技術(shù)，加到芯片上的網(wǎng)狀小孔內(nèi)，通過聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)（cPAS）進(jìn)行測序。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝和功能注釋

測序得到的原始數(shù)據(jù)（raw data）使用過濾軟件SOAPnuke進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除包含接頭的reads、未知堿基（N堿基）含量大于5%的reads 和低質(zhì)量的reads，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean data）。使用Trinity對clean reads進(jìn)行de novo組裝，同時通過BUSCO評估組裝質(zhì)量。通過軟件Transdecoder識別unigene中候選編碼區(qū)域，BLAST比對SwissProt并且用Hmmscan搜索Pfam蛋白同源序列，預(yù)測編碼區(qū)域。對組裝得到的unigene進(jìn)行功能數(shù)據(jù)庫注釋。

1.5 差異表達(dá)基因分析

使用DESeq2進(jìn)行組內(nèi)差異基因分析，條件為差異倍數(shù)（foldchange）≥2和qvalue≤0.05。使用PossionDis進(jìn)行組間差異分析，條件為foldchange≥2和錯誤發(fā)現(xiàn)率（1 discovery rate， FDR）≤0.05。根據(jù)GO及KEGG注釋結(jié)果以及官方分類，將差異基因進(jìn)行功能分類，使用R軟件中的phyper進(jìn)行KEGG富集分析，并使用TermFinder包進(jìn)行GO富集分析。以qvalue≤0.05為閾值，滿足此條件的定義為在候選基因中顯著富集。

1.6 嗅覺相關(guān)基因的分析和RTqPCR驗(yàn)證

從觸角轉(zhuǎn)錄組中篩選和鑒定OBPs、CSPs、Ors、GRs、IRs 和 SNMPs 等嗅覺基因，將得到的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastx比較。選擇10個嗅覺相關(guān)基因（4個OBPs，4個CSPs和2個ORs）進(jìn)行RTqPCR驗(yàn)證。使用Primer Premier 5設(shè)計特異性引物，選擇βtub和EF1a作為內(nèi)參基因（表1）。每個樣本取1 μg總RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄cDNA，按照

SYBR Primer Script RTPCR Kit （TaKaRa）構(gòu)建反應(yīng)體系，并在CFX96系統(tǒng)（BioRad， Hercules， CA， USA）上進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系：SYBR Premix 12.5 μL， cDNA 2 μL， 10 μmol/L上、下游引物各1 μL， ddH2O 8.5 μL。

反應(yīng)程序： 95℃ 30 s; 95℃ 30 s， 58℃ 30 s， 72℃ 30 s， 45個循環(huán)。每個處理均設(shè)3個生物樣品和2個技術(shù)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

RTqPCR結(jié)果通過內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化，并使用2-ΔΔCT計算所測基因的相對表達(dá)量;轉(zhuǎn)錄組測序采用FPKM（fragments per kilobase million， FPKM）值對基因表達(dá)量進(jìn)行評估，根據(jù)不同樣本間的比較計算出相對表達(dá)量。使用Graphpad Prism 5進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

通過對滯育和非滯育點(diǎn)蜂緣蝽雌、雄蟲觸角樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過數(shù)據(jù)質(zhì)控和過濾后，每個樣本均獲得6G以上的數(shù)據(jù)，Clean reads占raw reads百分比在93.97%～97.77%，Q20堿基百分比在97.52%以上，Q30堿基百分比在93.31%以上，GC含量在33.80%～34.25%（表2）。

使用Trinity軟件對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行組裝，共獲得57 648條unigenes，平均長度為1 555 bp，N50為2 848 bp。在所有觸角樣本中均有表達(dá)的unigene數(shù)量為49 211個，在非滯育雌蟲、非滯育雄蟲、滯育雌蟲和滯育雄蟲中特異表達(dá)的unigene數(shù)量分別為371、373、401個和319個（圖1）。

2.2 Unigenes的功能注釋

將獲得的unigene在7個數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行功能注釋，61.05%（34 194個）的unigenes，注釋成功（表3）。

其中，注釋基因數(shù)量最高的數(shù)據(jù)為NR和KEGG，分別為30 494個和24 209個，占比分別為52.90%和41.99%。NR庫注釋比對發(fā)現(xiàn)，注釋到茶翅蝽Halyomorpha halys的序列最多，為55.83%;注釋到先前報道的點(diǎn)蜂緣蝽序列的比例為9.18%;其余依次為溫帶臭蟲Cimex lectularius（4.74%）、錘脅蹺蝽Yemma signatus（1.43%）和褐飛虱Nilaparvata lugens（0.96%）（圖2）。

1） NR：非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫;NT：核酸序列數(shù)據(jù)庫;GO：基因本體數(shù)據(jù)庫;KEGG：京都基因與基因組百科全書;SwissProt：SwissProt蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫;Pfam：蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫;COG：直系同源蛋白質(zhì)簇數(shù)據(jù)庫。

NR： Nonredundant protein sequence database; NT： Nucleotide sequence database; GO： Gene ontology database; KEGG： Kyoto encyclopedia of genes and genomes; SwissProt： SwissProt protein sequence database; Pfam： The protein family database; COG： Clusters of orthologous groups database.

2.3 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

與非滯育雌蟲相比，滯育雌蟲觸角中共篩選到2 222個差異表達(dá)基因，包括1 288個上調(diào)表達(dá)基因和934個下調(diào)表達(dá)基因。與非滯育雄蟲相比，滯育雄蟲觸角中篩選到的差異表達(dá)基因2 293個，其中1 410個上調(diào)表達(dá)，883個下調(diào)表達(dá)。滯育雌、雄蟲觸角中差異表達(dá)的基因較少，僅有315個;非滯育雌、雄蟲觸角中差異表達(dá)的基因?yàn)?84個。

功能注釋，共富集到生物學(xué)過程（biologicalprocesses）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）三大類別的46個功能分類中（圖3）。

滯育和非滯育雌蟲差異表達(dá)基因注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能的百分比分別為28.40%、42.12%和29.47%。在生物學(xué)組分中，滯育和非滯育雌蟲差異表達(dá)基因主要富集到細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)等;在細(xì)胞組分中，注釋到20種與細(xì)胞和機(jī)體構(gòu)建相關(guān)，如細(xì)胞膜、細(xì)胞膜部位和細(xì)胞有關(guān)的功能分類;而在分子功能中，注釋到9種功能，主要為結(jié)

合和催化活性。滯育和非滯育雄蟲差異表達(dá)基因注釋到生物學(xué)過程（28.54%）、細(xì)胞組分（44.43%）、分子功能（27.03%）共45個功能分類，其中差異表達(dá)基因顯著富集的功能注釋與滯育和非滯育雌蟲相同。滯育雌雄蟲之間和非滯育雌雄蟲之間差異表達(dá)的基因數(shù)量較少，其中滯育雌雄蟲之間僅注釋到31個功能分類，非滯育雌雄蟲之間注釋到36個功能分類。

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

將不同處理觸角比對產(chǎn)生的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：滯育和非滯育雌蟲共有947個差異表達(dá)基因比對到KEGG中的

235個代謝通路里，富集的通路主要為蛋白代謝（ko04974）、溶酶體（ko04142）和藥物代謝（ko00983）;

滯育和非滯育雄蟲共有1 014個差異表達(dá)基因比對到KEGG中的245個代謝通路里，富集的通路主要為藥物代謝、溶酶體和吞噬體（ko04145）;滯育雌雄蟲之間僅有124個差異表達(dá)基因比對到KEGG代謝通路，主要涉及昆蟲激素合成（ko00981）、mRNA調(diào)控途徑（ko03015）和mTOR信號通路（ko04150）;非滯育雌雄蟲之間共有229個差異表達(dá)基因顯著富集到昆蟲激素合成、藥物代謝和溶酶體。

2.5 嗅覺相關(guān)基因篩選分析

根據(jù)關(guān)鍵詞搜索和注釋基因分析，從點(diǎn)蜂緣蝽

觸角轉(zhuǎn)錄組共鑒定出12個CSPs、37個OBPs、8個GRs、60個ORs、14個IRs和3個SNMPs基因，進(jìn)

一步對點(diǎn)蜂緣蝽滯育和非滯育觸角轉(zhuǎn)錄組間的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)：滯育和非滯育雌蟲觸角轉(zhuǎn)錄組中有10個差異表達(dá)的CSPs基因，其中1個上調(diào)表達(dá)，9個下調(diào)表達(dá);11個OBPs基因，其中3個上調(diào)表達(dá)，8個下調(diào)表達(dá);3個ORs基因上調(diào)表達(dá)和1個OR基因下調(diào)表達(dá);1個IR基因上調(diào)表達(dá)。滯育與非滯育雄蟲比較，共得到1個上調(diào)表達(dá)和6個下調(diào)表達(dá)的表達(dá)的OBPs基因;差異表達(dá)的ORs基因有16個，7個上調(diào)表達(dá)，9個下調(diào)表達(dá)。同是滯育狀態(tài)下的雌、雄成蟲僅有1個OBP基因表達(dá)出現(xiàn)差異;4個ORs基因上調(diào)表達(dá)，2個ORs基因下調(diào)表達(dá)。非滯育狀態(tài)下的雌、雄蟲比較發(fā)現(xiàn)，4個CSPs基因差異表達(dá)，1個基因上調(diào)表達(dá)和3個基因下調(diào)表達(dá);3個OBPs基因上調(diào)表達(dá);18個ORs基因差異表達(dá)，其中9個上調(diào)表達(dá)，9個下調(diào)表達(dá)（表4）。

2.6 差異表達(dá)的嗅覺相關(guān)基因的RTqPCR驗(yàn)證

由表4我們可以看出，滯育和非滯育成蟲觸角中差異表達(dá)的嗅覺基因較多，特別是OBPs和CSPs，因此，我們選取10個差異表達(dá)的嗅覺基因（包括4個OBPs，4個CSPs和2個ORs）進(jìn)行RTqPCR驗(yàn)證。結(jié)果表明：2個OBPs （CL1466.Contig3和CL418.Contig5）和1個OR（CL2647.Contig1）在滯育雌雄成蟲觸角的表達(dá)量均高于非滯育雌雄成蟲;CSP基因（Unigene9693）在滯育雌蟲觸角中上調(diào)表達(dá);其他所選OBPs，CSPs和ORs基因在滯育雌雄蟲觸角中均下調(diào)表達(dá);RTqPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致（圖5）。

3 結(jié)論與討論

本研究利用BGISEQ500測序平臺對滯育和非滯育點(diǎn)蜂緣蝽雌、雄成蟲觸角的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序，共獲得57 648條unigenes，平均長度為1 555 bp，N50為2 848 bp，高于宋月芹等［20］的測序結(jié)果（平均長度618 bp，N50為1 013 bp），經(jīng)過功能注釋和同源搜索，共有34 194條unigenes注釋成功，占所有unigenes的61.05%。而宋月芹等［20］的測序結(jié)果得到21 365條注釋成功的unigenes，僅占總unigenes數(shù)量的23.15%。這證明我們得到高質(zhì)量的點(diǎn)蜂緣蝽觸角轉(zhuǎn)錄組測序及組裝結(jié)果。同時，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，測序的深度和靈敏度都有很大提升，加上各大數(shù)據(jù)庫儲存基因的數(shù)量和種類日趨豐富，成功注釋的unigene數(shù)量較之前顯著增加。采用NR蛋白數(shù)據(jù)庫比對，共有30 494條unigenes成功注釋，占比為52.90%。其中，注釋到茶翅蝽的基因比例最多，為55.83%，其次為先前報道的點(diǎn)蜂緣蝽序列（9.18%）。而宋月芹等［20］的比對結(jié)果顯示，注釋基因比例最高的是內(nèi)華達(dá)古白蟻Zootermopsis nevadensis（15.22%），其次為赤擬谷盜Tribolium castaneum（5.2%），這主要?dú)w因于內(nèi)華達(dá)古白蟻和赤擬谷盜具有相對完整的全基因組序列和豐富的基因組注釋信息［2122］，而半翅目昆蟲的基因數(shù)據(jù)還不夠豐富［23］。隨著半翅目昆蟲研究的不斷深入，本次測序點(diǎn)蜂緣蝽觸角轉(zhuǎn)錄組中注釋到的基因與親緣關(guān)系更近的同為半翅目的茶翅蝽相似序列最多。

我們比較了滯育雌、雄蟲，非滯育雌、雌蟲4個處理觸角的轉(zhuǎn)錄組信息。其中，點(diǎn)蜂緣蝽雌蟲和雄蟲觸角間差異表達(dá)基因數(shù)量較少，滯育和非滯育狀態(tài)下分別為315個和584個;而滯育和非滯育相比，差異表達(dá)的基因數(shù)量較多，其中雌蟲為2 222個，雄蟲為2 293個。從差異表達(dá)的基因數(shù)量上來看，滯育和非滯育因素帶來的差異比性別因素的差異要大。昆蟲滯育或休眠的轉(zhuǎn)錄組分析多見于整個成蟲，涉及激素調(diào)控、脂肪酸代謝等［2426］，關(guān)注滯育前后觸角中差異基因的研究較少。GO功能注釋結(jié)果顯示，差異表達(dá)的基因多集中在結(jié)合、催化以及細(xì)胞過程。KEGG代謝途徑富集分析顯示，滯育和非滯育成蟲觸角差異表達(dá)基因富集在蛋白代謝（ko04974）、溶酶體（ko04142）、藥物代謝（ko00983）和吞噬體（ko04145），多數(shù)基因在滯育成蟲中是上調(diào)表達(dá)的，這可能與昆蟲在滯育期間需要積累能量，上調(diào)免疫能力來應(yīng)對滯育時的不良環(huán)境，并為滯育解除后的生長發(fā)育做準(zhǔn)備［27］。

觸角是昆蟲嗅覺系統(tǒng)的主要器官，昆蟲的嗅覺感受和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依靠各種嗅覺蛋白的共同參與，構(gòu)成昆蟲高度靈敏發(fā)達(dá)的嗅覺感受系統(tǒng)［28］。近年來，隨著高通量測序和全基因組測序的高速發(fā)展，眾多非模式昆蟲的嗅覺相關(guān)基因得到了深度挖掘和研究。本研究通過BLAST和同源搜索，共鑒定出134個嗅覺相關(guān)基因，包括12個CSPs基因、37個OBPs基因、8個GRs基因、60個ORs基因、14個IRs基因和3個SNMPs基因。與宋月芹等［20］從點(diǎn)蜂緣蝽轉(zhuǎn)錄組中鑒定出嗅覺相關(guān)基因相比，OBP基因數(shù)量較多，OR基因數(shù)量較少，其他基因在合理范圍內(nèi)。在點(diǎn)蜂緣蝽全基因組序列公布后，學(xué)者們從基因組中鑒定出更多的嗅覺相關(guān)基因［2931］。本研究的轉(zhuǎn)錄組測序是在點(diǎn)蜂緣蝽全基因組序列公布之前，且只對昆蟲觸角做了轉(zhuǎn)錄組分析，因此鑒定出的嗅覺相關(guān)基因是在觸角中特異性表達(dá)的基因，數(shù)量較少，后續(xù)還要結(jié)合全基因組對鑒定出的嗅覺相關(guān)基因做進(jìn)一步分析。

利用FPKM值分析點(diǎn)蜂緣蝽觸角中嗅覺相關(guān)基因的表達(dá)量，以及這些基因在滯育、非滯育雌、雄觸角中的差異表達(dá)情況。我們選取了10個差異表達(dá)的嗅覺基因并利用熒光定量 RTqPCR 進(jìn)行驗(yàn)證。 非滯育點(diǎn)蜂緣蝽雌、雄成蟲觸角中差異表達(dá)的嗅覺基因包括4個CSPs基因和3個OBPs基因，推測這些基因可能在性信息素識別過程中發(fā)揮著重要作用［32］。而滯育點(diǎn)蜂緣蝽成蟲兩性間僅有1個OBP基因表達(dá)出現(xiàn)差異，這可能是由于雌、雄成蟲進(jìn)入滯育后，性腺停止發(fā)育，不再合成和釋放性信息素，雄蟲觸角中對性信息素的識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等活動也隨之停止，因而嗅覺相關(guān)基因在滯育成蟲兩性間的表達(dá)差異性降低［1516］。滯育點(diǎn)蜂緣蝽對聚集信息素的敏感度增加［16， 1819］，推測滯育和非滯育點(diǎn)蜂緣蝽觸角中差異表達(dá)的嗅覺相關(guān)基因與聚集信息素或食物源氣味物質(zhì)的識別相關(guān)，有待后續(xù)深入研究。

本研究通過分析點(diǎn)蜂緣蝽滯育和非滯育雌雄蟲觸角的轉(zhuǎn)錄組差異，較詳細(xì)地解析了轉(zhuǎn)錄組間基因的表達(dá)水平、功能分類及代謝通路間的差異。進(jìn)一步對這些差異表達(dá)的基因開展深入研究，將為今后利用嗅覺靶標(biāo)防治點(diǎn)蜂緣蝽提供參考，并為研發(fā)更為高效的化學(xué)通訊調(diào)控技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）