幾株分離自麻天牛的白僵菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢特性及產(chǎn)酶能力分析

摘要

昆蟲病原真菌白僵菌Beauveria spp.是害蟲生防產(chǎn)品研發(fā)的主要真菌之一，其生長(zhǎng)及產(chǎn)酶特性是高毒力菌株篩選的重要依據(jù)。本研究對(duì)15株分離自麻天牛僵蟲的白僵菌進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其生長(zhǎng)、產(chǎn)孢以及胞外水解酶活性進(jìn)行了測(cè)定分析。rDNAITS序列進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果顯示，15株白僵菌中11株為球孢白僵菌B.bassiana，4株為硫酸白僵菌B.sulfurescens。不同溫度及培養(yǎng)基條件下菌株生長(zhǎng)與產(chǎn)孢分析結(jié)果表明，25℃，PPDA培養(yǎng)基適合大部分白僵菌的生長(zhǎng)，溫度下降至20℃時(shí)各菌株產(chǎn)孢量更高;CN004、CN011、CN012及CN055菌株為產(chǎn)孢優(yōu)勢(shì)候選菌株，其中CN055菌株產(chǎn)孢量可達(dá)到（1.99±0.57）×106 個(gè)/mm2。胞外水解酶活性測(cè)定結(jié)果表明，CN006、CN012、CN040及CN055的幾丁質(zhì)酶活性較強(qiáng)，且?guī)锥≠|(zhì)酶活性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，培養(yǎng)至第5天酶活性最高。CN009、CN019、CN040及CN055菌株的蛋白酶活性較強(qiáng)，蛋白酶活性呈現(xiàn)先急劇上升、再平緩上升的趨勢(shì)，CN055菌株第9 天的酶活性為（472.5±0.39） U/mL，顯著高于其他菌株（Plt;0.05）。CN040和CN055菌株在產(chǎn)孢、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和蛋白酶能力上兼具優(yōu)勢(shì)，可作為后續(xù)研發(fā)的重點(diǎn)菌株。

關(guān)鍵詞

白僵菌; 產(chǎn)孢; 幾丁質(zhì)酶; 蛋白酶; 篩選

中圖分類號(hào)：

S 476.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024523

Characteristics of growth， sporulation and enzyme production capacity of Beauveria strains isolated from Thyestilla gebleri

CAI Ni1#， QIAO Zhijun1，2#， LIU Fang1， FANG Wei1， LIU Shaofang3， NONG Xiangqun4， WANG Kaimei1*

（1. Hubei Biopesticide Engineering Research Centre， Wuhan 430064， China; 2. School of Life Science and Technology，

Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430030， China; 3. Jiangxi Provincial Key Laboratory of Natural Microbial

Medicine Research， Nanchang 330013， China; 4. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect

Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

The entomopathogenic fungus Beauveria spp. is one of the most important fungal genera for the development of biocontrol agents. Growth and enzyme production traits are key indicators for selecting highvirulence strains. In this study， 15 Beauveria strains were isolated from naturally infected Thyestilla gebleri and identified via rDNAITS sequence analysis. Among them， 11 strains were identified as B. bassiana， and four as B.sulfurescens. The effects of temperature and media on fungal growth and sporulation were evaluated. Most strains exhibited optimal growth at 25℃ on PPDA medium， while sporulation peaked at 20℃. Strains CN004， CN011， CN012 and CN055 exhibited superior sporulation， with CN055 producing up to （1.99±0.57）×106 conidia/mm2. Extracellular enzyme activity assays showed that CN006， CN012， CN040 and CN055 had strong chitinase activity， which peaked on the 5th day after inoculation before declining. CN009， CN019， CN040 and CN055 showed high protease activity， with a sharp initial increase followed by a slower rise. On the 9th day， CN055 displayed the highest protease activity （472.5±0.39 U/mL）， significantly higher than other strains （Plt;0.05）. In summary， CN040 and CN055 demonstrated superior traits in terms of sporulation and hydrolytic enzyme production， making them promising candidates for future development of fungal biopesticides.

Key words

Beauveria spp.; sporulation; chitinase; protease; strain selection

白僵菌 Beauveria spp.是重要的昆蟲病原真菌，其生態(tài)友好，致病力強(qiáng)，對(duì)人畜、作物無毒，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值，尤其在生物防治中表現(xiàn)突出。白僵菌屬真菌已報(bào)道的有20 多個(gè)種［1］，其中以球孢白僵菌Beauveria bassiana與布氏白僵菌B.brongniartii昆蟲致病性研究最多。例如，張瀚文等［2］用 1×108 個(gè)/mL 球孢白僵菌孢子懸浮液分別侵染長(zhǎng)林小蠹Hylurgus ligniperda幼蟲和成蟲，接種后7 d，長(zhǎng)林小蠹幼蟲和成蟲的校正死亡率均達(dá)到 100%;林華峰等［3］用布氏白僵菌處理斜紋夜蛾Spodoptera litura 2齡幼蟲，其致死中時(shí)（LT50）為2.95 d，累計(jì)校正死亡率達(dá)到100%。另外的一些種的代謝產(chǎn)物具有昆蟲毒性或藥用活性。例如硫酸白僵菌B.sulfurescens的代謝產(chǎn)物中有一種N寡甘露糖型糖鏈的糖蛋白，將其注射到大蠟螟Galleria mellonella幼蟲體內(nèi)會(huì)使昆蟲表皮變黑，LD50小于10 μg/kg［4］;丁曉娟等［5］對(duì)多株昆蟲病原真菌代謝物進(jìn)行了單胺氧化酶（MAO）活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)多形白僵菌B.amorpha菌株Ba02代謝物具有很強(qiáng)的抑制MAO的活性，具有潛在藥物開發(fā)價(jià)值。而球孢白僵菌在白僵菌屬中殺蟲譜最廣，能侵染15目149科700 多種昆蟲［6］，因此，目前生防真菌產(chǎn)品的研究與開發(fā)仍以球孢白僵菌為主。

白僵菌主要以分生孢子侵染寄主，菌株的生長(zhǎng)狀況以及分生孢子的產(chǎn)量是與殺蟲真菌生產(chǎn)直接相關(guān)的重要性狀，不同菌株的菌絲生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢初始時(shí)間、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及致病力存在差異［7］，在開發(fā)生防真菌產(chǎn)品時(shí)，需要結(jié)合菌株的生長(zhǎng)特性進(jìn)行篩選，其中產(chǎn)孢量和致病力高低是產(chǎn)品開發(fā)的重要篩選指標(biāo)［8］。

毒力測(cè)定是評(píng)價(jià)高毒力菌株應(yīng)用潛力的基礎(chǔ)。目前常采用生物測(cè)定法，但其過程繁瑣，且由于不同菌株的寄主范圍存在差異，篩選時(shí)容易遺漏有潛在致病能力的菌株，因此諸多學(xué)者在尋求某種補(bǔ)充指標(biāo)，例如酶活力指標(biāo)來輔助篩選［910］，以比較快捷的方式進(jìn)行初篩以獲得高毒力菌株。白僵菌對(duì)昆蟲寄主的侵染和致病過程一般要經(jīng)歷幾個(gè)階段，即分生孢子附著、萌發(fā)、體壁穿透，菌絲在血腔內(nèi)生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)攝取，毒素釋放，最終破壞寄主組織，使昆蟲罹病死亡［11］。穿透昆蟲體壁是昆蟲病原真菌成功感染寄主的關(guān)鍵，此過程涉及特殊侵染結(jié)構(gòu)（附著胞）的形成和機(jī)械力的產(chǎn)生以及表皮降解酶（幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、脂肪酶等）的作用［12］。

蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和脂類等是昆蟲體壁的主要組成物質(zhì)，St Leger等［13］在1987年以昆蟲體壁為培養(yǎng)基離體培養(yǎng)金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae，首次發(fā)現(xiàn)了昆蟲病原真菌蛋白酶的結(jié)構(gòu)特性，隨后的研究表明病原真菌的幾丁質(zhì)酶和蛋白酶與其要入侵的昆蟲表皮存在聯(lián)系［14］，并且在真菌孢子萌發(fā)、入侵寄主和完成侵染的過程中發(fā)揮一定作用，認(rèn)為其與菌株的毒力發(fā)揮有關(guān)［1516］。尤其是其分泌的胞外蛋白酶在侵染宿主過程中降解宿主表皮成分，激活宿主體內(nèi)血淋巴酚原氧化酶超量表達(dá)，導(dǎo)致宿主因中毒而死亡［17］。馮明光［18］以血黑蝗Melanoplus sanguinipes為試蟲測(cè)定了17 株不同來源球孢白僵菌的胞外蛋白酶活性及其毒力，發(fā)現(xiàn)各菌株胞外蛋白酶活性與其毒力顯著正相關(guān)。殷紅福等［19］測(cè)定了球孢白僵菌對(duì)松墨天牛Monochamus alternatus 4齡幼蟲的毒力，結(jié)果顯示其校正死亡率與幾丁質(zhì)酶活性間呈直線正相關(guān)，且相關(guān)性極顯著。以上研究結(jié)果表明，利用菌株幾丁質(zhì)酶以及蛋白酶的活性對(duì)白僵菌菌株進(jìn)行初步的殺蟲活性篩選，是較為可靠的方式。

本研究從麻天牛僵蟲中分離得到了15株白僵菌，擬通過分子生物學(xué)鑒定確定其分類地位，結(jié)合生長(zhǎng)、產(chǎn)孢能力分析以及幾丁質(zhì)酶、蛋白酶活力測(cè)定，初步確定其應(yīng)用潛力，為生防白僵菌產(chǎn)品的開發(fā)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試15株白僵菌由本實(shí)驗(yàn)室從武漢乙森生態(tài)科技有限公司提供的麻天牛Thyestilla gebleri 成蟲僵蟲上分離純化得到。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

真菌純化培養(yǎng)基：麥芽糖 6.25 g/L，麥芽提取物 6.25 g/L，酵母提取物 1 g/L，蛋白胨 6.25 g/L，KH2PO4 1.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，pH 7.0。

真菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量測(cè)定使用培養(yǎng)基PPDA、SDAY、MEA，培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)［2021］，胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量測(cè)定使用干酪素瓊脂培養(yǎng)基（CaA）和殼聚糖培養(yǎng)基（CA），配制方法分別參考文獻(xiàn)［22］與［23］，蛋白酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基和幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)［24］。

1.2 菌株的分離純化

在冷卻至 50～55℃的真菌純化培養(yǎng)基中加入終濃度為70 mg/L的多果定、125 mg/L頭孢霉素和138 mg/L硫酸卡那霉素，進(jìn)行白僵菌的選擇性分離［25］。在無菌條件下，用無菌牙簽挑取僵蟲體表的菌絲，進(jìn)行連續(xù)劃線，重復(fù) 3 個(gè)平板。28℃培養(yǎng)3～5 d，挑取單菌落至純化培養(yǎng)基上，純化3次后保存于PPDA斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株鑒定

1.3.1 基因組 DNA提取

將純化后的菌株接種于鋪有滅菌玻璃紙的PPDA固體培養(yǎng)基表面，28℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，收集菌絲。采用真菌基因組DNA提取試劑盒［簡(jiǎn)石生物技術(shù)（北京）有限公司］提取各菌株的基因組DNA。

1.3.2 ITS序列擴(kuò)增及測(cè)序

以真菌基因組DNA為模板，以通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）對(duì)菌株rDNAITS 區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增［26］。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，共28個(gè)循環(huán);72℃延伸 2 min。PCR產(chǎn)物送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將擴(kuò)增所得到的ITS序列在NCBI網(wǎng)站（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)初步確定其種屬。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)得的序列與GenBank中下載的白僵菌ITS序列信息一起，用BioEdit Sequence Alignment Editor軟件分別對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析并以fasta格式保存，用MEGA X軟件以鄰接法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建單基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)為1 000。根據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行物種鑒定。

1.4 菌株生長(zhǎng)與產(chǎn)孢性能測(cè)定

將純化的白僵菌產(chǎn)生的分生孢子用0.1%的吐溫80配成1.0×107個(gè)/mL的懸浮液。在PPDA、SDAY及MEA 平板中央放置直徑為5 mm的滅菌濾紙，用移液器分別點(diǎn)滴接種5 μL孢子懸浮液于濾紙上，晾干后分別于20、25℃及28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，各重復(fù)3次。于接種后第7 天用電子數(shù)顯卡尺測(cè)量菌落直徑，按十字交叉法測(cè)量后取其平均值，通過計(jì)算生長(zhǎng)直徑比較各白僵菌菌株的菌絲生長(zhǎng)速率。同時(shí)用直徑 5 mm的打孔器在菌落上距離菌落中心1/2處打取菌餅，每菌落按十字對(duì)稱取4個(gè)菌餅，置于5 mL的0.1%吐溫80無菌水中，振蕩使孢子充分分散。用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度并換算成單位面積（mm2）的產(chǎn)孢量，各菌株重復(fù)測(cè)定3 次。

1.5 不同白僵菌菌株幾丁質(zhì)酶和蛋白酶活性測(cè)定

1.5.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶及蛋白酶的能力測(cè)定

白僵菌菌株的胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶產(chǎn)酶量測(cè)定參照何景超［27］的方法加以改進(jìn)。將15株白僵菌的分生孢子用0.1%吐溫80配成1.0×108個(gè)/mL的孢子懸浮液，用移液槍吸取3 μL分別接種于CA和CaA平板中央，CA平板于28℃培養(yǎng)9 d后用 5% NaOH溶液鋪滿平板表面，CaA平板于28℃培養(yǎng)5 d后用 0.4 moL/L 三氯乙酸溶液鋪滿平板表面，觀察菌落的周圍是否出現(xiàn)清晰透明的環(huán)狀，產(chǎn)酶量以直徑比（直徑比=透明圈直徑/菌落直徑）來表示。每個(gè)菌株設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。

1.5.2 幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)分泌活性測(cè)定

胞外幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)與檢測(cè)參考文獻(xiàn)［24］：在 250 mL 的三角瓶中裝入 40 mL 滅菌的幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將1.0×108個(gè)/mL的白僵菌菌株的分生孢子按照2%比例（V/V）接入，（25±1）℃、180 r/min 于恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)，每組 3 個(gè)重復(fù)。于誘導(dǎo)后的第5 天 取培養(yǎng)液于 4℃、6 000 r/min離心 10 min，上清液即為粗酶液。以 1%的膠體幾丁質(zhì)為底物測(cè)量幾丁質(zhì)酶活性，將粗酶液和 1%膠體幾丁質(zhì)混合，放入 40℃ 水浴鍋中反應(yīng) 1 h 后加入 DNS 試劑，沸水煮 5 min 后取出，待冷卻至室溫后用超純水定容至25 mL，在 540 nm 處測(cè)量吸光度，

每處理取3份樣品，分別

測(cè)定 3 次，取平均值計(jì)算幾丁質(zhì)酶活性，每分鐘轉(zhuǎn)化生成 1 μg N乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量定義為 1 個(gè)酶活單位。

1.5.3 蛋白酶誘導(dǎo)分泌活性測(cè)定

胞外蛋白酶誘導(dǎo)與檢測(cè)參考文獻(xiàn)［28］：在 250 mL 的三角瓶中裝入 50 mL 滅菌的蛋白酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基，參照1.5.2接種菌株孢子及誘導(dǎo)培養(yǎng)。于誘導(dǎo)后的第5 天 取培養(yǎng)液于 4℃、6 000 r/min 離心 10 min，上清液即為粗酶液。以 2%酪蛋白為底物測(cè)量蛋白酶活性，將粗酶液和 2%的酪蛋白混合，在40℃水浴鍋中反應(yīng)10 min后取出，加入三氯乙酸終止反應(yīng)，25℃、 12 000 r/min 離心 5 min 后取上清液，加入 2 mL 0.4 mol/L的 Na2CO3 和1 mL 福林酚試劑混勻后40℃顯色反應(yīng) 20 min， 在 680 nm 處測(cè)量吸光度，每處理取3份樣品，分別測(cè)定3次吸光度取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白酶活性，將每分鐘轉(zhuǎn)化生成 1 μg 的酪氨酸所需要的酶量定義為 1 個(gè)酶活單位。

1.5.4 候選菌株幾丁質(zhì)酶和蛋白酶活性測(cè)定

通過比較各個(gè)白僵菌菌株的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢以及產(chǎn)酶能力，選取候選菌株對(duì)其胞外幾丁質(zhì)酶（CN006，CN012，CN040，CN055）與蛋白酶（CN009，CN019，CN040，CN055）的活性進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。參照1.5.2和1.5.3，于誘導(dǎo)后第 1、3、5、7、9天分別取少量培養(yǎng)液制備粗酶液，測(cè)量其酶活并進(jìn)行比較。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，采用Oneway ANOVA 和Tukey’s honest significant difference （HSD） test檢驗(yàn)（SPSS 26.0）進(jìn)行差異顯著性分析（Plt;0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 白僵菌菌株的分子生物學(xué)鑒定

15個(gè)菌株的rDNAITS序列長(zhǎng)度約為 570 bp。將序列與 GenBank 中的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，其中有11個(gè)菌株與球孢白僵菌Beauveria bassiana的相似性高于99%，4株白僵菌菌株（CN002、CN003、CN009和CN043）與硫酸白僵菌B.sulfurescens的相似性高于99%。從 GenBank下載親緣關(guān)系較近的 ITS 序列，以淡紫擬青霉Purpureocillium lilacinum （NR165946.1）為外群，利用 MEGA X軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 1）。結(jié)果顯示，所有白僵菌菌株與淡紫擬青霉聚類在不同分支，其中11個(gè)菌株與球孢白僵菌 B.bassiana 聚為一類;CN002、CN003、CN009和CN043與硫酸白僵菌B.sulfurescens （PP384656.1）聚為一類，并與白僵菌屬的其他菌株形成明顯分支。因此將分離菌株中的11 個(gè)菌株初步鑒定為球孢白僵菌，將CN002、CN003、CN009和CN043初步鑒定為硫酸白僵菌。

2.2 白僵菌菌株的生長(zhǎng)特性與產(chǎn)孢能力

2.2.1 15株白僵菌在不同溫度不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性

為評(píng)估不同白僵菌菌株生長(zhǎng)特性，將 15 株白僵菌菌株孢子懸浮液分別點(diǎn)接在 PPDA、SDAY和MEA 培養(yǎng)基中心，于20、25、28℃恒溫培養(yǎng) 7 d，15株白僵菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)量不同，菌落平均生長(zhǎng)直徑以在PPDA上最大（表1）;在同一培養(yǎng)基及不同溫度下，菌株在25℃生長(zhǎng)最好，菌落平均生長(zhǎng)直徑最大。因此，PPDA培養(yǎng)基及25℃培養(yǎng)適合大部分白僵菌菌株的生長(zhǎng)。

比較不同菌株在不同溫度和培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)量，結(jié)果顯示，CN003、CN005、CN015、CN019及CN033菌株的生長(zhǎng)量在不同培養(yǎng)基上較其他菌株更有優(yōu)勢(shì)。20、25℃及28℃下這5個(gè)菌株在PPDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)量高于其他菌株，且在SDAY，MEA上的生長(zhǎng)量也較高。其中CN003菌株25℃下PPDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)量最高，為（40.22±0.67） mm，顯著高于20、28℃下在該菌株在PPDA上的生長(zhǎng)量（Plt;0.05），但與25℃下PPDA培養(yǎng)基上CN005、CN015、CN019及CN033（菌落直徑gt;39 mm）菌株的生長(zhǎng)直徑無顯著差異。

2.2.2 白僵菌菌株在不同溫度及不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量

20、25℃及28℃下，供試的15 株白僵菌在PPDA、SDAY和MEA 培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量測(cè)定結(jié)果表明，在同一溫度下，不同培養(yǎng)基上15株白僵菌的平均產(chǎn)孢量總體上表現(xiàn)出PPDAgt;SDAYgt;MEA（表2）。在PPDA和MEA培養(yǎng)基上，菌株在不同溫度下的產(chǎn)孢量表現(xiàn)出20℃gt;28℃gt;25℃;其中在20℃的PPDA和MEA平板上，15株白僵菌的平均產(chǎn)孢量分別為8.8×105 個(gè)/mm2和1.5×105 個(gè)/mm2。但在SDAY培養(yǎng)基上，菌株在不同溫度下的產(chǎn)孢量表現(xiàn)出25℃gt;20℃gt;28℃，25℃下15株白僵菌的平均產(chǎn)孢量為2.4×105個(gè)/mm2。

CN004、CN011、CN012及CN055菌株在不同溫度下的PPDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量顯著高于其他菌株，其中CN055菌株在28℃下PPDA平板上產(chǎn)孢量最高，為（1.99±0.57）×106 個(gè)/mm2， 顯著高于同溫度下（28℃）其他菌株的產(chǎn)孢量（Plt;0.05）。但CN004、CN011和CN012菌株在20℃下的產(chǎn)孢量較25℃、28℃更優(yōu)。因此總體上看，在20℃培養(yǎng)條件下，PPDA培養(yǎng)基適合大部分白僵菌產(chǎn)孢。

2.3 白僵菌菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和蛋白酶的能力及誘導(dǎo)分泌活性

不同菌株在 CA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 9 d 后，采用 5% NaOH 溶液處理 CA 平板后均出現(xiàn)明顯的透明圈，這表明所有的白僵菌菌株均具有產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的能力。透明圈直徑比較大的菌株分別為CN006gt;CN004gt;CN012gt;CN011gt;CN055gt;CN040（圖2a），其中CN006菌株的平均透明圈直徑為（34.28±0.3）mm，直徑比最大（1.48±0.01），顯著高于其他菌株（Plt;0.05）（表3）。在對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)第5 天各個(gè)菌株胞外幾丁質(zhì)酶活性進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，胞外幾丁質(zhì)酶活力較高的菌株分別為CN009gt;CN055gt;CN006gt;CN040gt;CN012，酶活力均大于18 U/mL，其中CN009菌株的胞外幾丁質(zhì)酶活力最高，為（23.37±0.66） U/mL，顯著高于其他菌株（Plt;0.05）。并且CN006、CN012、CN040和CN055菌株透明圈的直徑比與胞外幾丁質(zhì)酶活力均位于前五位，表現(xiàn)出一致性。

不同菌株在CaA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，采用三氯乙酸溶液處理CaA平板后均出現(xiàn)明顯的透明圈，且各個(gè)菌株透明圈的直徑比均高于1.9（表4），這表明15株白僵菌菌株均具有產(chǎn)蛋白酶能力。透明圈直徑比較大的菌株分別為CN009gt;CN040gt;CN055gt;CN004gt;CN011gt;CN019（圖2b），其中CN009菌株的平均透明圈直徑為（33.56±0.17）mm，直徑比最大（2.34±0.01），顯著高于其他菌株（Plt;0.05）（表4）。在對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)后第5 天各個(gè)菌株胞外蛋白酶活性進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，各菌株蛋白酶活性均高于108 U/mL，胞外蛋白酶活性較高的菌株分別為CN055gt;CN002gt;CN009gt;CN040gt;CN019，其中CN055菌株的蛋白酶活性最高，為（249.41±1.35） U/mL，顯著高于其他菌株（Plt;0.05）。并且CN009、CN019、CN040及CN055菌株透明圈的直徑比與蛋白酶活性均較高，表現(xiàn)出一致性。

2.4 候選菌株幾丁質(zhì)酶和胞外蛋白酶產(chǎn)生動(dòng)態(tài)

對(duì)透明圈直徑比與胞外酶活力表現(xiàn)出一致性的菌株進(jìn)一步進(jìn)行胞外酶活性測(cè)定，結(jié)果顯示，各菌株幾丁質(zhì)酶和蛋白酶的產(chǎn)酶趨勢(shì)在整個(gè)生長(zhǎng)期基本一致。其中幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量在生長(zhǎng)1～3 d無顯著上升，第5天達(dá)到最高，隨后下降。CN055菌株的幾丁質(zhì)酶活力最高可達(dá)到（21.26±0.79） U/mL，顯著高于CN006、 CN012和CN040菌株（Plt;0.05）（表5）。各菌株蛋白酶的產(chǎn)量在第3天大幅上升，5～7 d進(jìn)入一個(gè)平緩期，第9天產(chǎn)酶量達(dá)到最高，其中第9天，CN055菌株的產(chǎn)蛋白酶酶活最高，為（472.5±0.39） U/mL，顯著高于CN009、 CN019和CN040菌株（Plt;0.05）（表6）。

3 結(jié)論與討論

白僵菌是昆蟲病原真菌的典型代表之一，已開發(fā)成多種生防真菌產(chǎn)品用于防治農(nóng)林害蟲。昆蟲病原真菌菌株的生長(zhǎng)特性、初始產(chǎn)孢時(shí)間和產(chǎn)孢量以及對(duì)靶標(biāo)害蟲的毒力高低是判斷其生物防治潛力以及能否進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。依據(jù)菌落形態(tài)特征、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量和蛋白酶等生物學(xué)特性可對(duì)高活性昆蟲病原真菌菌株開展初步篩選［2930］。

溫度和營(yíng)養(yǎng)成分是影響白僵菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的重要因素。前人曾報(bào)道大多數(shù)真菌生長(zhǎng)的最適溫度范圍為 20～30℃［31］，此外培養(yǎng)基碳源和氮源含量與白僵菌生物學(xué)特性密切相關(guān)［32］。林華峰等［33］研究發(fā)現(xiàn)布氏白僵菌B.brongniartii和金龜子綠僵菌Metrzhizium anisopliae的最適宜培養(yǎng)基為 PPDA。王定鋒等［20］發(fā)現(xiàn)白僵菌菌株 Bbr1552 生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量也在PPDA上最高，且菌株 Bbr1552 的最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢溫度均為 25℃。在對(duì)布氏白僵菌MM1菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化中也同樣發(fā)現(xiàn)，15℃下菌株產(chǎn)孢量較20、25℃更高［34］。本研究結(jié)果表明，相較于營(yíng)養(yǎng)較為豐富的SDAY培養(yǎng)基和MEA培養(yǎng)基， PPDA 培養(yǎng)基更適合從天牛僵蟲分離的白僵菌菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。此外，本研究中供試的15株白僵菌菌株在25℃培養(yǎng)條件下的平均生長(zhǎng)直徑普遍優(yōu)于20℃和28℃培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)直徑，但在20℃下各菌株的平均產(chǎn)孢量（8.8×105 孢子/mm2）較25℃及28℃培養(yǎng)條件下更優(yōu)，其原因可能是一定的低溫脅迫有利于菌株生殖生長(zhǎng)，但更低溫度是否更有利于從天牛僵蟲分離的白僵菌菌株的產(chǎn)孢還需進(jìn)一步探討。

魏靈燕等［35］對(duì)15株白僵菌菌株的培養(yǎng)特性（孢子萌發(fā)率、產(chǎn)孢量和菌落生長(zhǎng)速率）進(jìn)行相關(guān)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌株的產(chǎn)孢量與菌落生長(zhǎng)速率無顯著相關(guān)性。本研究在比較不同溫度及培養(yǎng)基下各個(gè)菌株的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢量時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一溫度同一培養(yǎng)基上生長(zhǎng)與產(chǎn)孢較為優(yōu)勢(shì)的菌株也并不一致，其中生長(zhǎng)能力較為突出的菌株為CN003、CN005、 CN015、CN019和CN033，而產(chǎn)孢能力較為突出的菌株為CN004、CN011、CN012和CN055。由此可推測(cè)菌株的生長(zhǎng)量與產(chǎn)孢量并不直接關(guān)聯(lián)。

幾丁質(zhì)酶與蛋白酶能夠協(xié)助真菌穿透宿主的角質(zhì)層感染宿主［15］。有研究報(bào)道，幾丁質(zhì)酶在白僵菌侵染家蠶的過程中起重要作用，而蛋白酶是白僵菌導(dǎo)致家蠶死亡的主要因素［36］。林志偉等發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌Bz4菌株在膠體幾丁質(zhì)液體中培養(yǎng)5～6 d時(shí)菌株幾丁質(zhì)酶活性達(dá)到最大［37］。王露露等比較了菌株 SQJC1，SDJC3 和 GXHC1在培養(yǎng)2、4、5、6、8 d時(shí)胞外蛋白酶的活性，結(jié)果顯示SQJC1菌株胞外蛋白酶含量在第 5 天達(dá)到最高，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)［38］，本研究通過平板透明圈法分析了15株白僵菌菌株的產(chǎn)酶能力，結(jié)果顯示，菌株 CN006、CN012、CN040及CN055的透明圈直徑比與幾丁質(zhì)酶活性表現(xiàn)出一致性，均高于其他菌株。菌株CN009、CN019、CN040和CN055的透明圈直徑比與蛋白酶活性較高，也表現(xiàn)出一致性。分別測(cè)定誘導(dǎo)后1、3、5、7、9 d這兩組菌株幾丁質(zhì)酶以及蛋白酶活性發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶在培養(yǎng)第5天即達(dá)到最高，隨后下降，這與林志偉等［37］測(cè)定球孢白僵菌Bz4菌株在膠體幾丁質(zhì)液體中產(chǎn)酶量的結(jié)果基本一致。本研究中蛋白酶活性則表現(xiàn)出“升高——平緩——升高”的趨勢(shì)，培養(yǎng)第9 天時(shí)4株白僵菌菌株的酶活性均高于200 U/mL，其中CN055菌株的酶活性達(dá)到（472.5±0.39） U/mL，這一趨勢(shì)與他人的研究結(jié)果存在一定差異，具體原因還需進(jìn)一步探討。

昆蟲病原真菌胞外酶活性與菌株毒力的關(guān)系一直被廣為探討。近年來，采用超量表達(dá)、基因敲除等基因工程方法已證實(shí)昆蟲病原真菌產(chǎn)生的胞外酶可以作為毒力因子。在球孢白僵菌中過表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因（Bbchit1）可增強(qiáng)白僵菌對(duì)桃蚜Myzus persicae的毒力［39］，在白僵菌中轉(zhuǎn)入胞外水解酶，蛋白酶和幾丁質(zhì)酶融合基因（CDEP1：Bbchit1）后，通過蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的交互協(xié)同作用，工程菌株對(duì)桃蚜的致死中時(shí)間降低了23%，菌株毒力顯著提高［40］。但胞外水解酶活性與菌株毒力的相關(guān)性還不確定。胡錦江等發(fā)現(xiàn)，隨著菌株繼代次數(shù)的增加，產(chǎn)胞外蛋白酶水平降低，且對(duì)馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus的毒力也隨之減弱［41］，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胞外蛋白酶活性與其毒力具有正相關(guān)關(guān)系［42］;而在以亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis為試蟲探討胞外蛋白酶活性與累積死亡率相關(guān)性時(shí)，R2僅為0.224，酶活性和累積死亡率只具有簡(jiǎn)單的趨勢(shì)關(guān)系，并無直接相關(guān)性［43］。這些差異性結(jié)果可能是由于胞外蛋白酶和胞外幾丁質(zhì)酶為誘導(dǎo)性酶，主要作用于病菌穿透寄主體壁的過程，在利用液體培養(yǎng)測(cè)定酶活時(shí)，缺失寄主誘導(dǎo)因子，可能會(huì)出現(xiàn)酶活與實(shí)際毒力水平不一致的情況。故本研究測(cè)定胞外蛋白酶活性及幾丁質(zhì)酶活性也僅作為白僵菌毒力的補(bǔ)充篩選指標(biāo)，后續(xù)還將結(jié)合生物測(cè)定進(jìn)一步確定候選菌株。

綜上所述，通過對(duì)從天牛僵蟲中分離的15株白僵菌生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酶能力測(cè)定，確定白僵菌最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢培養(yǎng)基為 PPDA 培養(yǎng)基，在PPDA培養(yǎng)基中的最適產(chǎn)孢溫度為20℃。CN006、CN012、CN040及CN055菌株具有較高的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力，CN009、CN019、CN040及CN055菌株產(chǎn)蛋白酶能力較為突出，并且CN040和CN055菌株在產(chǎn)孢、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶及蛋白酶能力上兼具優(yōu)勢(shì)，在進(jìn)一步研發(fā)中值得重點(diǎn)關(guān)注。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）