用于低溫制曲的米曲霉菌株的誘變及篩選研究

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2025.07.017

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2025）07-0115-04

Study on Mutagenesis and Screening of Aspergillus oryzae Strains Used for Low-Temperature Koji Making

FENG Xia，LIAO Yun-sheng，ZHANG Bei-bei*，LI Feng，CHEN Qi-ming， ZHANG Ling-li， MA Zhuo-yuan，GAO Li-hong

（Sichuan Food Fermentation Industry Research and Design Institute Co.，Ltd.， Chengdu 611130，China）

Abstract： In this study，Aspergillus oryzae strain CM5 with good soy sauce brewing performance preserved at the Southwest Center of Industrial Culture Collection in China （SICC） is selected. Ten mutant strains with good performance are obtained through atmospheric pressure and room temperature plasma （ARTP） mutagenesis breeding. After low-temperature screning of the mutant strains， ATM12 with higher total enzyme activity and acid protease activity is selected for further research. The results show that the average spore germination rate of ATM12 koji reaches 87.64% ，indicating that the germination rate is good.There are significant diferences in colony morphology and mycelium between ATM12 and Aspergillus oryzae Huniang 3.O42，and there is no significant diference in spore morphology and size between ATM12 and Aspergillus oryzae Huniang 3.O42 in terms of microstructure. In terms of total enzyme activity，the total enzyme activity of ATM12 is lower than that of Aspergillus oryzae Huniang 3.042，but acid protease activity of ATM12 is significantly higher than that of Aspergillus oryzae Huniang 3.042，which has positive significance for high-salt liquid-state fermentation of sauce mash with acidic pH under low-temperature conditions.

Key Words： soy sauce; Aspergillus oryzae ; low-temperature koji making; ARTP mutagenesis

醬油由豆醬演變而來，從宋朝開始就出現(xiàn)了“醬油\"這個(gè)詞，是我國(guó)的傳統(tǒng)調(diào)味品[1]。醬油是一種以大豆、小麥或麩皮為主要原料，通過發(fā)酵制成的具有獨(dú)特香氣的特殊調(diào)味品，含有多種氨基酸和有機(jī)化合物[2]，根據(jù)醬油的發(fā)酵工藝主要分為低鹽固態(tài)發(fā)酵和高鹽稀態(tài)發(fā)酵兩種[3]。其中，低鹽固態(tài)發(fā)酵時(shí)間較短，導(dǎo)致各種風(fēng)味物質(zhì)的累積不夠，從品質(zhì)上無法與高鹽稀態(tài)發(fā)酵相比[4]。但是高鹽稀態(tài)發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)發(fā)酵條件的要求較高，導(dǎo)致醬油的生產(chǎn)成本居高不下[5]，因此對(duì)其發(fā)酵關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行研究成為該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

米曲霉是釀造醬油的主要菌株，可以分泌蛋白酶、α -淀粉酶、谷氨酰胺酶、果膠酶等多種酶系[6，其中蛋白酶是醬油發(fā)酵過程中的重要酶系，可以促進(jìn)原料降解，生成氨基酸、短肽、多肽等物質(zhì)[7]。已有研究指出，高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的關(guān)鍵控制點(diǎn)是低溫制曲和常溫發(fā)酵[8]，米曲霉蛋白酶活力是影響醬油原料利用率和產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素，因此選育可以用于低溫制曲的米曲霉菌株有極其重要的意義[9]。目前國(guó)內(nèi)的醬油生產(chǎn)企業(yè)主要采用米曲霉滬釀3.042以及在此基礎(chǔ)上優(yōu)化的新菌種，雖然其生長(zhǎng)快速，產(chǎn)酶系豐富，但是菌絲較長(zhǎng)，導(dǎo)致制曲時(shí)出現(xiàn)大曲結(jié)板嚴(yán)重、透氣性差、曲溫升高過快不易控制、燒曲等問題[10-11]。基于此，該項(xiàng)目組結(jié)合SICC菌種儲(chǔ)備優(yōu)勢(shì)，從菌種庫中篩選性能較好的米曲霉菌株，通過ARTP誘變并低溫篩選優(yōu)良菌株，與采用米曲霉滬釀3.042進(jìn)行對(duì)比，以期得到能夠在低溫條件下進(jìn)行制曲且產(chǎn)酶能力強(qiáng)并能克服米曲霉滬釀3.042缺點(diǎn)的優(yōu)良菌株。

1材料與方法

1.1材料

黃豆、面粉、麩皮等原材料：購于成都市菜大全超市；米曲霉菌株CM5：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心西南站保藏的醬油釀造米曲霉菌株；培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為米曲汁培養(yǎng)基；篩選培養(yǎng)基為酪蛋白察氏培養(yǎng)基，由蔗糖 30g 、硝酸鈉 2g 、磷酸氫二鉀 1g 硫酸鎂 _0.5g 氯化鉀 0.5g 、硫酸亞鐵 _0.1g 、酪蛋白 6g 、瓊脂 18g 水1000g 配制而成；米曲霉種曲培養(yǎng)基為麩皮培養(yǎng)基，由麩皮、面粉、水按 8：1：9 的比例混勻制備而成。

1.2 試劑

L-酪氨酸（分析純）、酪蛋白、瓊脂：北京索萊寶科技有限公司； 95% 酒精、硫酸、福林試劑、無水碳酸鈉、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、氯乙酸、葡萄糖、蔗糖（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

ARTP-M常壓室溫等離子體誘變育種儀無錫天木生物科技有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SPX-250B-2型生化培養(yǎng)箱上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；YP402N電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；UB203i正置生物顯微鏡重慶澳浦光電技術(shù)有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；XH-B旋渦振蕩器上海比朗儀器制造有限公司。

1.4方法

1.4.1 ARTP誘變[12]

以氮?dú)庾鳛榉烹姎怏w，射頻功率設(shè)定為120W，氣體流量設(shè)定為10SLM，誘變時(shí)間分別為120，150，180，210s，處理0s作為對(duì)照，進(jìn)行照射，處理結(jié)束后用 1mL 生理鹽水對(duì)載玻片進(jìn)行洗脫。

1.4.2致死率曲線測(cè)定

依次稀釋未誘變菌液和洗脫后EP管原液，分別吸取 0.1mL 稀釋菌液涂布于酪蛋白察氏培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度進(jìn)行2次平行試驗(yàn)，平板于 25°C 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 3～4d ，觀察并記錄菌落數(shù)量和透明圈大小，計(jì)算致死率。

致死率 （%）= （未經(jīng)誘變處理的載玻片組活菌落數(shù) （CFU/mL） 一各誘變時(shí)間處理組活菌落數(shù)（CFU/mL））/未經(jīng)誘變處理的載玻片組活菌落數(shù) （CFU/mL）×100%。

1. 4.3 突變菌株初篩

根據(jù)誘變結(jié)果，選取合適的誘變時(shí)間進(jìn)行誘變處理，將處理后的載玻片用 1mL 生理鹽水進(jìn)行洗脫，制成孢子懸浮液，根據(jù)初始孢子液濃度和致死率，選取合適的稀釋梯度，吸取 0.1mL 稀釋菌液均勻涂布于酪蛋白察氏培養(yǎng)基上，于 25°C 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 2～4d 挑選透明圈直徑/菌落直徑較大的菌株，計(jì)算H/C比值，同時(shí)將菌株轉(zhuǎn)接到米曲汁培養(yǎng)基上，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4突變菌株復(fù)篩

將初篩得到的優(yōu)良菌株在米曲汁培養(yǎng)基斜面活化后，挑取一接種環(huán)孢子接種于種曲培養(yǎng)基，于 28^°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基出現(xiàn)白點(diǎn)，結(jié)餅時(shí)，搖瓶打碎，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，菌絲大量繁殖，此時(shí)麩曲再次結(jié)餅，進(jìn)行扣瓶，倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，種曲成熟，以菌絲發(fā)育粗壯、整齊、稠密、頂囊肥大、孢子呈黃綠色為標(biāo)準(zhǔn)。在黃豆大曲制作冷卻的過程中，首先以1.5‰ 的接種量預(yù)先將種曲與面粉混勻，混勻后的面粉再與黃豆混勻后放入竹筐中，成曲厚度 8cm ，覆蓋紗布， 下培養(yǎng)至成曲表面被黃綠色孢子覆蓋后結(jié)束。根據(jù)生長(zhǎng)狀況進(jìn)行翻曲通風(fēng)。對(duì)初篩后的優(yōu)良菌株制曲后進(jìn)行蛋白酶活力測(cè)定，驗(yàn)證米曲霉初篩結(jié)果，測(cè)定方法參照SB/T10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》[13]和GB/T 23527.1—2023《蛋白酶制劑》[14]

1.4.5種曲產(chǎn)孢能力及孢子萌發(fā)率實(shí)驗(yàn)[15]

種曲產(chǎn)孢能力：稱取種曲1g（精確至 0.002g） ，倒入盛有玻璃珠的 250mL 三角瓶?jī)?nèi)，加入 95% 酒精 5mL 、無菌水 20mL 、稀硫酸 （1：10）10mL ，在旋渦振蕩器上充分振搖后用3層紗布過濾，用無菌水反復(fù)沖洗后稀釋至 500mL 。取潔凈干燥的血球計(jì)數(shù)板，蓋上蓋玻片，用無菌滴管取孢子稀釋液1小滴滴于蓋玻片的邊緣處，靜置 5min ，待孢子沉降。使用 16×25 規(guī)格的計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)觀察計(jì)數(shù)不少于2次，然后取其平均值。

式中： C 表示孢子數(shù)（個(gè)/g）；N表示80小格內(nèi)孢子總數(shù)（個(gè)）； V 表示孢子稀釋液體積（mL）； G 表示樣品質(zhì)量（g）。

孢子萌發(fā)率：稱取 1g 種曲，加入 50mL 生理鹽水，充分振蕩后將孢子打散，過濾得到孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算孢子數(shù)。將孢子懸浮液進(jìn)行稀釋，選擇合適的稀釋濃度，進(jìn)行2次重復(fù)，采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)孢子萌發(fā)率進(jìn)行檢測(cè)。

ω=A/B×100% 。

式中： ω 表示種曲孢子萌發(fā)率 （%） ；A表示1g種曲平板菌落數(shù)（個(gè)）； B 表示 1g 種曲血球計(jì)數(shù)（個(gè)）。

2 結(jié)果與分析

2.1致死率曲線測(cè)定

由于米曲霉的孢子具有較厚的孢子壁，需要較長(zhǎng)的處理時(shí)間，結(jié)合已有的研究結(jié)果[12]，將菌株的誘變起始時(shí)間設(shè)定為120s，對(duì)米曲霉的孢子誘變處理時(shí)間為 120～210s. 。ARTP誘變選育的致死率曲線見圖1。

由圖1可知，隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體的致死率不斷上升，在180s時(shí)致死率最高，在210s時(shí)致死率有所下降；各誘變時(shí)間的致死率相差不大。因此，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及相關(guān)研究，選擇致死率最高的180s作為誘變時(shí)間。

2.2 突變菌株初篩

在誘變時(shí)間180s的條件下，對(duì)經(jīng)過初步篩選得到的米曲霉菌株CM5進(jìn)行低溫誘變選育，挑選出培養(yǎng)相同時(shí)間后H/C比值較大的10株菌株進(jìn)行復(fù)篩，菌落透明圈見圖2。選取透明圈 H/C 比值較大的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，挑選的菌株編號(hào)分別為ATM3、ATM4、ATM5、ATM8、ATM9、ATM10、ATM11、ATM12、ATM14、ATM16，其中ATM4的H/C比值最大，為1.85。

米曲霉蛋白酶活力H/C比值見圖 3，H/c 值從大到小依次為ATM4、ATM12、ATM8、ATM5、ATM9、ATM3、ATM11、ATM14、ATM16、ATM10。

2.3 突變菌株復(fù)篩

分別對(duì)上述突變菌株和原始菌株進(jìn)行種曲和成曲制作，并對(duì)其進(jìn)行蛋白酶活力測(cè)定，結(jié)果見表1。

由表1可知，酶活較高的菌株為ATM12和ATM9，對(duì)比復(fù)篩結(jié)果，ATM12和ATM9兩株菌總酶活相對(duì)較高，分別達(dá)到 1748，1709U/g ，相較于突變前的酶活分別提高了11. 04% 和 9.01% ，考慮到高鹽稀態(tài)發(fā)酵隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，醬醪的 pH 逐漸降低，因此在ATM12和ATM9兩株菌間，選擇總酶活和酸性蛋白酶活力較高的ATM12作為突變菌株。

2.4突變菌株孢子計(jì)數(shù)及萌發(fā)率實(shí)驗(yàn)

ATM12種曲孢子計(jì)數(shù)見圖4。

通過突變菌株孢子計(jì)數(shù)及萌發(fā)率實(shí)驗(yàn)得到ATM12種曲的孢子數(shù)達(dá)到 1.0×10¹⁰ 個(gè)/g，孢子數(shù)量十分豐富，豐富的孢子數(shù)量對(duì)于制曲過程中種曲的添加量具有重要意義。ATM12種曲的平均孢子萌發(fā)率達(dá)到 87.64% ，萌發(fā)率相對(duì)較好，有利于后期成曲制作時(shí)降低種曲的添加量。

由圖5可知，通過對(duì)突變菌株ATM12與米曲霉滬釀3.042對(duì)比發(fā)現(xiàn)，ATM12與米曲霉滬釀3.042在菌落形態(tài)和菌絲上存在明顯差異，ATM12在米曲汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d時(shí)，菌絲呈白色，無孢子產(chǎn)生，菌絲短，培養(yǎng)4d時(shí)，菌落菌絲豐富，表面緊密，整體菌絲短，孢子稠密，菌落中央呈黃綠色，中間菌絲長(zhǎng)，ATM12菌落呈圓形。米曲霉滬釀3.042菌落在米曲汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d時(shí)，菌絲呈白色，菌絲豐富，出現(xiàn)少量孢子，培養(yǎng)4d時(shí)，菌落菌絲豐富且長(zhǎng)，呈黃綠色，孢子稠密，邊緣呈白色絨毛狀。在顯微結(jié)構(gòu)上，ATM12和米曲霉滬釀3.042在孢子形態(tài)和大小上比較接近，無明顯差異。

在制曲過程中，米曲霉滬釀3.042由于菌絲較長(zhǎng)且十分豐富，導(dǎo)致黃豆大曲出現(xiàn)明顯的結(jié)板現(xiàn)象，結(jié)板后，不利于曲體的控溫及各種酶系的產(chǎn)生，ATM12的菌絲相對(duì)較短，在大曲制曲過程中，相對(duì)較短的菌絲不易使黃豆成曲結(jié)板，成曲曲體疏松，利于曲體的控溫和散熱，對(duì)于成曲后制備醬醪的品控有重要意義。ATM12所制備的醬醪整體偏疏松，有利于醬醪通氣，提升發(fā)酵效率。

在醬油生產(chǎn)過程中，蛋白酶活力對(duì)醬油產(chǎn)品品質(zhì)有重要影響。由圖7可知，經(jīng)測(cè)定，ATM12的酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力分別為 569，1 146U/g ，總酶活為 1715U/g ，米曲霉滬釀3.042的酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力分別為 357，1567U/g ，總酶活為 1924U/g 在中性蛋白酶活力方面，米曲霉滬釀3.042較ATM12提高了 36.7% ，在酸性蛋白酶活力方面，米曲霉滬釀3.042較ATM12降低了 37.2% ，從總酶活上來看，ATM12突變菌株低于米曲霉滬釀3.042，但是ATM12的酸性蛋白酶活力明顯高于米曲霉滬釀3.042，可以用于高鹽稀態(tài)發(fā)酵pH偏酸性的醬醪。

3結(jié)論

該項(xiàng)目組前期對(duì)SICC保藏的醬油釀造米曲霉菌株進(jìn)行了篩選，選出一株性能優(yōu)良的米曲霉菌株CM5，以此菌株為出發(fā)菌株，通過ARTP誘變手段對(duì)米曲霉進(jìn)行低溫篩選，獲得了在低溫條件下生長(zhǎng)狀況良好、產(chǎn)蛋白酶活力高的米曲霉突變菌株ATM12，該菌株產(chǎn)生的孢子數(shù)量多、孢子萌發(fā)率高，適用于種曲的制作。該菌株與傳統(tǒng)釀造用米曲霉滬釀3.042相比，菌株ATM12菌絲較短，孢子豐富，成曲曲體松散，利于大曲品控，成曲總酶活雖然低于米曲霉滬釀3.042，但是在酸性蛋白酶活力上有明顯優(yōu)勢(shì)。綜上所述，該研究結(jié)果對(duì)于醬油發(fā)酵工藝中低溫制曲以及高鹽稀態(tài)發(fā)酵pH偏酸性的醬醪有積極意義。

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