杜松精油對(duì)樟子松松球殼孢菌抑菌活性分析

中圖分類號(hào)：S763.15文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-923X（2025）07-0164-10

Analysis of the antibacterial activity of juniper essential oil against the Sphaeropsis sapinea of Pinus sylvestris var. mongolica

MATeng，HEAomen，LIAOShixian，AierpaniAbulimiti，F(xiàn)USina，GUOJing，ZHOUBoru （Collegeoforestry，NortheastForestryUniversity，Harbin5oo4o，Heilongjiang，hina）

Abstract：【Objectie】TexpoeteitoryefctsadmechanissofplantessentialilsoSeropsisspinendproidinga novelandeco-friendlyapproachforcontroling thediseaseofiplodiatipblight.【Method】Themycelialgrowthate methodwassed toscreenthestyfjipealloouatsstalilsjidaeees microscopicobseatio，psiologicalandiohemicaltsting，teefetsofjuipereetaloilontemorpologyofatogenic fungalhyphaesporegeation，solublesubstanepeetratio，efeseeectiityndpathogenicityrefurthraald therebyevaluatingitsantibacterialactivitygainstSsapne.Resultheesultssoedtatamongtefourplanteentalilsth esentialilofjipradtestibitoryectotemyelialgrowtofSsapinenditalsodabroadatibacteralstru. significantly inhibitingS.sapinea growth withan inhibitionrateof 87.55% at 40mL/L .Spore germination was notably suppressed at concentrations above 5mL/L .Microscopic observations revealed that juniper essential oil caused mycelial shrinkage，rupture，and swelling.Further studies showed that after 12 hours of treatment， extracellular soluble protein levels in the EC₃₀ and EC₅₀ treated groups were4.36timesnd5.9tieshighertanthotrol，espectivelydcatingatjuipersetialoildsuptedtheinteityof pathogen’scellmembranestructure.Treatedmyceliaaccumulatedlrgeamountofreactiveoxygenspecies，andPIandFDAstaiing resultsndicatedthatjuniperessentialoilsignificantlyeducedthecellviabilityofSsapineaEnzyeactivityassysrevealedthat after9hoursoftreatment，teactivitiesofsuperoxidedismutase（SOD），peroxidase （POD）andcatalase（CAT）begatodcreasehe activities of endo ?β? -1，4-glucanase （EG）， polygalacturonase （PG），and pectin lyase （PL） gradually decreased and remained consistently lower than the control group.After 12 hours of treatment with EC₃₀ and EC₅₀ ，theenzyme activitieswere 65.54% and 76.51% （Plt; 0.05）， 62.8% and 79.2% and 82.62% and 92.55% lower than the control group，respectively. These results indicate that juniper essential oil significantly affects the stability of the enzyme system within S. sapinea，induces oxidative stress responses，and reduces itsinfectivity and pathogenicity.【Conclusion】Juniper essential oil effectively inhibits the growthof S. sapinea，disrupts itsstructure，and reducesits pathogenicity.Thisstudyprovidesatheoreticalbasis forthebiologicalcontrolofDiplodia tipblight.

words：jniperstialil;inussestrisamonglica;Dipldiatiplight;Serosisintibactaltii

樟子松Pinussylvestrisvar.mongholica是一種優(yōu)良的造林樹種，樹形美觀、材質(zhì)較好，在水土保持、防風(fēng)固沙、環(huán)境綠化及生態(tài)建設(shè)中至關(guān)重要。在樟子松生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，易遭受松球殼孢菌Sphaeropsissapinea（異名：Diplodiasapinea）的侵染，引起枯梢病，導(dǎo)致樹勢(shì)衰弱。由于該病害是一種傳染性病害，必須加以防范[1。目前，樟子松枯梢病防治多為化學(xué)防治，雖能取得一定成效，但其破壞環(huán)境、對(duì)人體致癌及部分國(guó)家法律限制等影響且長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑易出現(xiàn)抗藥性菌株[2]。因此，迫切需要篩選開發(fā)安全、高效殺菌劑應(yīng)用于樟子松枯梢病防治。

近年來(lái)，植物精油作為植物源殺菌劑研究及應(yīng)用備受關(guān)注。植物精油是一類從植物葉、種子、花和根莖等部位提取的植物次生代謝產(chǎn)物。其具有廣譜抑菌性，毒性較小，綠色天然，無(wú)藥物殘留，可降解，對(duì)環(huán)境和動(dòng)物相對(duì)安全[3-4]。因此，其在抑菌抗菌上的作用越來(lái)越受關(guān)注，被認(rèn)為是最有潛力且更安全的綠色抗菌劑之一，已被廣泛研究作為化學(xué)農(nóng)藥的替代品[5]。據(jù)報(bào)道，一部分精油對(duì)抑制植物病原菌生長(zhǎng)及病害防控方面具備良好的應(yīng)用前景，如牛至、香茅、丁香精油三種植物精油對(duì)白色葡萄球菌Staphylococcusalbus、白色念珠菌Candidaalbicans、金黃色葡萄球菌S.aureus等5種常見病原微生物具有一定抑菌作用[。盧彩會(huì)等[報(bào)道，姜黃油對(duì)沙門氏菌Salmonella、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、蠟樣芽孢桿菌B.cereus及藤黃八疊球菌Sarcinalutea均有抑制效果。高原等[8研究發(fā)現(xiàn)丁香精油對(duì)金黃色葡萄球菌S.aureus和銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa具有明顯的抑制作用。Sarkhosh等[在體外施用不同濃度的百里香精油，發(fā)現(xiàn)其可有效抑制炭疽菌B.anthraci、鐮刀菌Fusarium和疫霉菌Phytophthorainfestans的菌絲體生長(zhǎng)。Lee等[o]研究發(fā)現(xiàn)肉桂精油可以高效抑制立枯絲核Rhizoctoniasolani的生長(zhǎng)；Khosravi等[]研究了部分植物精油對(duì)腐皮鐮孢菌 F. solani和尖孢鐮刀菌 F. oxysporum的抑菌活性，其研究表明牛至精油對(duì)兩種病原菌均能達(dá)到較好的抑制效果。Desam等[12]研究發(fā)現(xiàn)薄荷精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌以及酵母菌和真菌均具有顯著的抗菌活性。Sharma等[13]報(bào)道了丁香對(duì)番茄枯萎病菌抑菌效果呈濃度依賴性。

本研究擬通過(guò)室內(nèi)毒力測(cè)定篩選出對(duì)樟子松松球殼孢菌有明顯抑菌效果的植物精油，通過(guò)顯微鏡觀察，相關(guān)酶活性測(cè)定等方法，進(jìn)一步分析植物精油對(duì)病原菌菌絲形態(tài)、細(xì)胞膜完整性、防御酶活性以及致病力的影響，闡明植物精油對(duì)樟子松球殼孢菌的抑菌作用及機(jī)理。該研究結(jié)果將為利用植物精油作為植物源殺菌劑防治樟子松枯稍病提供一定的理論依據(jù)與新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

樟子松枯梢病松球殼孢菌（B2）分離自黑龍江省尚志市帽兒山樟子松防護(hù)林的病梢，取自東北林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室。植物病原真菌尖孢鐮刀菌（F.oxysporum2-3）、黑附球菌（Epicoccumnigrum5-3-4）、膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides6-1-1）、間座殼菌（Diaporthe15-2-4）、擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsisvismiae17-2-4）、細(xì)極鏈格孢菌（Alternariatenuissima18-1-1）、鏈格孢菌（A.alternataYK）均來(lái)自東北林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

杜松精油、雪松精油、甘松精油、絲柏精油均購(gòu)自江西億森源植物香料有限公司。過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠裂解酶（PL）、內(nèi)切 β -1-4葡聚糖酶（EG）試劑盒購(gòu)自蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 室內(nèi)毒力測(cè)定

1）供試含精油PDA平板的制備

本試驗(yàn)采用 10% 吐溫80為助溶劑。用移液槍準(zhǔn)確吸取適量植物精油與 10% 吐溫80按一定比例混合，使植物精油對(duì)供試菌終處理體積分?jǐn)?shù)分別為40、20、10、5、 2.5μL/mL 。振蕩均勻、倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，制備不同精油含量的PDA平板。無(wú)菌水為陰性對(duì)照。

2）菌絲生長(zhǎng)速率法

測(cè)定4種植物精油對(duì)樟子松枯梢病病原菌的抑制作用。用打孔器在培養(yǎng)4d的樟子松枯梢病菌落邊緣打取 5mm 直徑菌餅接種于含不同濃度精油的培養(yǎng)基中央，每組3次重復(fù)，倒置培養(yǎng)于 25°C 恒溫培養(yǎng)箱中，逐天觀察菌落生長(zhǎng)直徑，待對(duì)照組菌落長(zhǎng)滿整個(gè)平板后，采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑并計(jì)算各植物精油對(duì)病原菌菌絲的抑制率。

1.2.2 孢子萌發(fā)測(cè)定

孢子懸浮液制備：向培養(yǎng)7d松球殼孢菌培養(yǎng)基中加入適量無(wú)菌水，接種環(huán)刮取菌絲，滅菌紗布過(guò)濾除去菌絲，調(diào)整濾液為 1×10⁶mL 孢子懸浮液。

參照凹玻片法[1415]，將孢子懸浮液與含杜松精油PDB培養(yǎng)基等體積混合，得到杜松精油體積分?jǐn)?shù)為2.5、5、10、20、 40mL/L 孢子溶液，以含等量吐溫80的PDB孢子懸浮液為空白對(duì)照，25^°C 保濕培養(yǎng) ^10h 后在光學(xué)顯微鏡（ 10×40 ）下觀察分生孢子萌發(fā)情況。

1.2.3 病菌樣品的處理與取樣

打取4枚菌餅投入到 150mL PDB液體培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng) ^72h ，再向液體培養(yǎng)基中添加10mL 杜松精油與 10% 吐溫80的混合液，使培養(yǎng)基含藥體積分?jǐn)?shù)為 9.913mL/L （ EC₅₀ ）和 4.451mL/L 中 EC₃₀ ），對(duì)照組加入 10mL 的 10% 吐溫80。3、6、9、 12h 后收集菌絲樣本和上清液。過(guò)濾離心后獲得菌絲與上清液，菌絲用于POD、SOD、CAT活性測(cè)定，上清液用于 PL 、EG、PG活性測(cè)定。

1.2.4抑菌作用機(jī)理顯微觀察

1）體視顯微鏡觀察

參照1.2.1的方法，將含精油與無(wú)菌水陰性對(duì)照平板置于體視顯微鏡下，觀察杜松精油對(duì)松球殼孢菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

2）光學(xué)顯微鏡觀察

采用蓋玻片插片法。將 5mm 菌餅分別接種于含0和 9.913mL/L（EC₅₀） 杜松精油的PDA平板中，距離菌餅 1cm 處傾斜 45^° 插入滅菌蓋玻片， 25°C 恒溫倒置培養(yǎng)直至菌絲長(zhǎng)到蓋玻片三分之二以上，取出蓋玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)特征。

3）電子顯微鏡觀察

SEM樣品制備與觀察：按前文方法取出蓋玻片，參考吳禹萱[的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，將樣品粘在導(dǎo)電膠上噴金后使用電子顯微鏡觀察菌絲形態(tài)。

1.2.5 病原菌細(xì)胞膜完整性測(cè)定

1）可溶性蛋白含量測(cè)定

參考吳禹萱[的方法，計(jì)算各樣品的蛋白含量。

2）病原菌活性氧積累與細(xì)胞活性測(cè)定

利用DCFH-DA探針法以及二乙酸熒光素（FDA）和碘化丙啶（PI）熒光染色法對(duì)松球殼孢菌細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactiveoxygen species）積累情況及細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。從1.2.3獲取一定量健康菌絲，放入 2mL 離心管中，加入 1mL ， 0.85%NaCl 緩沖液，再加入杜松-吐溫80混合液，使其最終含藥體積分?jǐn)?shù)為 40μL/mL 。同時(shí)設(shè)置清水-吐溫80混合液作為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)， 25°C /180r/min 培養(yǎng) ^48h 后， 8000r/min 離心 5min 棄上清， 0.85%NaCl 清洗3次，再加入 0.85%NaCl 緩沖液 1mL ，獲得菌絲備用。

在處理好的菌絲中分別加入 0.5mL 的0.001μg/mL DCFH-DA試劑、 20μL 的 5mg/mL 二乙酸熒光素（FDA）試劑和 1μL 的 1mg/mL 碘化丙啶（PI）試劑。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，室溫避光孵育 30min ，每隔 5min 搖勻1次，使試劑與細(xì)胞充分接觸。之后用 0.85%NaCl 洗滌 2～3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA和染色劑。將菌絲置于載玻片上，利用熒光正置顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧積累與細(xì)胞活性情況，活性氧最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為500和 525nm ，F(xiàn)DA最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488和 530nm 。PI最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為535和 615nm 。

1.2.6病原菌抗氧化酶活力及致病力測(cè)定

按1.2.3的方法處理取樣，測(cè)定POD、SOD、CAT、PG、PL、EG活性，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行酶活測(cè)定，各處理重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel2021軟件和SPSS27.0軟件對(duì)取得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析，用鄧肯顯著性分析方法進(jìn)行單因素方差分析。使用Origin2022軟件進(jìn)行圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.1.14種植物精油對(duì)松球殼孢菌絲生長(zhǎng)的抑制

十字交叉法橫向和縱向測(cè)量菌絲的生長(zhǎng)直徑，重復(fù)3次取平均值代入公式計(jì)算，得出菌絲生長(zhǎng)抑制率。杜松精油對(duì)病原菌有明顯的抑制效果，且隨著杜松精油濃度的增加抑制作用逐漸升高（圖1），在 40mL/L 時(shí)抑菌率為 87.55% ；絲柏精油對(duì)病原菌的抑菌作用次之，在 40mL/L 時(shí)抑菌率為58.36% ；甘松和雪松精油在該濃度范圍內(nèi)對(duì)病原菌抑菌效果較差，在 40mL/L 時(shí)抑菌率僅分別為30.06% 和 27.49% 。

2.1.2杜松精油的廣譜抑菌活性

測(cè)定杜松精油對(duì)8種病原真菌的抑菌譜以及生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明杜松精油對(duì)8種病原真菌均有抑制效果，且呈濃度依賴性，其中對(duì)黑附球菌、間座殼菌、擬盤多毛孢菌和鏈格孢菌的生長(zhǎng)抑制率分別為 93.60% 、 92.94% ！ 92.35% 和 94.13% （表1），顯著高于其他病原菌。對(duì)8種病原菌的生長(zhǎng)抑制率均達(dá)到了 70% 以上，充分表明杜松精油具有廣譜的抑菌活性。

2.2 杜松精油對(duì)松球殼孢菌孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果表明，不同濃度杜松精油處理下孢子萌發(fā)率具有顯著差異性（ ），杜松精油處理后松球殼孢菌孢子萌發(fā)率顯著低于對(duì)照組（圖2）。當(dāng)杜松精油體積分?jǐn)?shù)為 2.5mL/L 時(shí)，萌發(fā)率為 29.84% ，比對(duì)照組降低 69.60% ；在體積分?jǐn)?shù)40mL/L 時(shí)，萌發(fā)率最小，為 1.29% ，比對(duì)照組降低 98.68% 。由此表明，杜松精油能有效抑制病菌孢子的萌發(fā)。延展性（圖3A），杜松精油抑制了松球殼孢菌落的正常生長(zhǎng)。

2.3.2 光學(xué)顯微鏡觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察杜松精油對(duì)松球殼孢菌絲形態(tài)的影響，結(jié)果顯示：對(duì)照組菌絲體生長(zhǎng)良好，菌絲飽滿光滑，自然伸展。處理組菌絲形態(tài)差異明顯，菌絲體生長(zhǎng)狀態(tài)差，局部膨大，表面粗糙，斷裂，畸形，細(xì)胞內(nèi)含物外滲，菌絲表面有穿孔，甚至存在部分菌絲消融（圖3B），杜松精油導(dǎo)致菌絲形態(tài)發(fā)生了變化。

2.3 杜松精油對(duì)松球殼孢菌落及菌絲形態(tài)的影響 2.3.3 掃描電鏡觀察

2.3.1 體視顯微鏡觀察

體視顯微鏡下觀察杜松精油對(duì)松球殼孢菌落形態(tài)的影響，結(jié)果顯示，對(duì)照組菌落前端呈放射狀且菌絲濃密蓬松、粗細(xì)均勻，伸展性良好，尖端呈細(xì)絲狀，處理組菌落前端菌絲皺縮變粗，無(wú)通過(guò)SEM掃描電子顯微鏡觀察經(jīng)杜松精油處理后松球殼孢菌絲形態(tài)，結(jié)果表明：對(duì)照組菌絲粗壯，健康飽滿，粗細(xì)均勻，表面光滑，菌絲自然伸展，呈現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。處理組菌絲表面粗糙布滿褶皺，粗細(xì)不均勻，且出現(xiàn)皺縮、斷裂、畸形（圖3C），杜松精油處理使菌絲形態(tài)異常，從而達(dá)到抑菌效果。

A：體視顯微鏡下對(duì)菌落形態(tài)的影響；B：光學(xué)顯微鏡下對(duì)菌絲形態(tài)的影響

（a：膨大；b：斷裂；c：畸形；d：穿孔；e：內(nèi)含物外滲；f：菌絲消融）； C：電子顯微鏡下對(duì)菌絲形態(tài)的影響（a：畸形；b：斷裂；c：皺縮） A：Effect of stereoscopic microscope on colony morphology;B：Effect optical microscopyonmycelial morphology（a：Expansion;b：Fracture; c：Malformation;d：Perforation;e：Extravasationof contents;f：Mycelial ablation ）; C： Effect of electron microscopy on mycelial morphology （a：Malformation;b：Fracture;c：Wrinkle）

2.4 杜松精油對(duì)球殼孢菌細(xì)胞膜完整性的影響

2.4.1 細(xì)胞外可溶性蛋白含量變化

通過(guò)測(cè)定細(xì)胞外可溶性蛋白含量，判斷杜松精油對(duì)樟子松松球殼孢菌細(xì)胞膜通透性的影響，結(jié)果顯示：杜松精油 EC₃₀ 和 EC₅₀ 處理的病菌胞外可溶性蛋白含量逐漸上升，且顯著高于對(duì)照組（ ），在培養(yǎng) ^12h 時(shí)， EC₃₀ 和 EC₅₀ 處理的病菌胞外可溶性蛋白含量分別是對(duì)照組的4.36倍和5.90倍， EC₅₀ 是 EC₃₀ 的1.35倍。杜松精油對(duì)病菌細(xì)胞膜造成了破壞，導(dǎo)致細(xì)胞可溶性物質(zhì)外滲，病菌細(xì)胞完整性遭到破壞（圖4）。

2.4.2杜松精油對(duì)松球殼孢菌細(xì)胞內(nèi)活性氧積累與細(xì)胞活性的影響

活性氧（ROS）參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，如果機(jī)體過(guò)量地產(chǎn)生活性氧會(huì)對(duì)機(jī)體細(xì)胞膜造成損害，甚至造成生物體死亡。通過(guò)活性氧測(cè)定結(jié)果表明：經(jīng) 40μL/mL 杜松精油處理后，菌絲出現(xiàn)明顯的綠色熒光，表明細(xì)胞膜被損傷，積累了一定量的ROS（圖5）。PI與FDA染色結(jié)果表明：經(jīng)40μL/mL 杜松精油處理后菌絲出現(xiàn)大面積紅色熒光以及極少量綠色熒光，說(shuō)明精油處理后導(dǎo)致病菌細(xì)胞活性降低甚至出現(xiàn)死亡（圖6）。

2.5 杜松精油對(duì)松球殼孢菌抗氧化酶活力及致病性的影響

2.5.1 杜松精油對(duì)松球殼孢菌抗氧化酶活力的影響

SOD、POD和CAT這3種酶在生物體內(nèi)扮演著至關(guān)重要的角色，它們共同構(gòu)成了生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要部分，保護(hù)細(xì)胞和組織免受自由基和活性氧的損傷，維持生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細(xì)胞的正常功能。松球殼孢菌SOD、POD、CAT酶活力的測(cè)定結(jié)果表明：杜松精油處理后松球殼孢菌SOD活力在 ^12h 內(nèi)表現(xiàn)出先降低后升高再降低的趨勢(shì)，且在 6h 時(shí)最低值分別為 EC₅₀ 16.24U/g 和 EC₃₀ ， 40.39U/g ，活力分別比對(duì)照降低了 71.14% 和 28.23% 。 ^9h 時(shí) EC₃₀ 達(dá)到最高值為92.86U/g ，顯著高于對(duì)照組（ Plt;0.05 ），為對(duì)照組的2.75倍，經(jīng) EC₅₀ 處理的SOD活力在 ^12h 內(nèi)均低于對(duì)照組，可能是該濃度處理使松球殼孢菌防御力顯著下降（圖7A）。經(jīng)杜松精油處理的松球殼孢菌POD和CAT活力在 12h 內(nèi)均高于對(duì)照組，且 ^9h 后活力均開始呈下降趨勢(shì)， EC₅₀ 處理的POD和CAT活力在 ^9h 分別達(dá)到最高值33.75和371.21μmoL?min^-1?g^-1） ，顯著高于對(duì)照組（ Plt; 0.05），分別是對(duì)照組的1.27和7.02倍（圖7B、C）。

2.5.2杜松精油對(duì)松球殼孢菌致病相關(guān)酶活性的影響

植物細(xì)胞壁是抵御病原菌入侵的主要屏障。病原菌通過(guò)分泌一系列的細(xì)胞壁降解酶降解寄主植物的細(xì)胞壁，以突破屏障入侵寄主植物。病菌在侵入寄主時(shí)會(huì)分泌EG、PG、PL等來(lái)降解植物細(xì)胞壁，使植物組織浸解，導(dǎo)致原生質(zhì)體死亡，以利于其入侵感染[7]。經(jīng) EC₃₀ 和 EC₅₀ 杜松精油處理后松球殼孢菌的（EG、PG、PL）活力均顯著低于對(duì)照組（ Plt;0.05 ），且具有濃度依賴性，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)活性逐漸降低，在 ^12h 時(shí)，杜松 EC₃₀ ， EC₅₀ 處理后EG活性分別降低 65.54% 和 76.51% （圖8A）；杜松 EC₃₀ 、 EC₅₀ 處理后PG活性分別降低 62.8% 和 79.2% （圖8B）；杜松 EC₃₀ 一 EC₅₀ 處理后PL活性分別降低 82.62% 和92.55% （圖8C）。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，安全高效的樟子松枯梢病防治手段（如生防菌、植物提取物等）備受關(guān)注。陳潔等人的研究表明，點(diǎn)柄乳牛肝能夠提高樟子松對(duì)枯梢病的抗性[18]。鄧勛等[19]指出木霉能夠抑制病原菌的生長(zhǎng)，破壞病原菌主要防御酶的酶活性。大量研究表明，杜松等精油具有抑菌能力，且對(duì)多種病原菌具有抑制作用，本試驗(yàn)結(jié)果顯示杜松精油對(duì)松球殼孢菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制效果，經(jīng)杜松精油處理后，病原菌菌絲生長(zhǎng)速率明顯降低且出現(xiàn)皺縮、斷裂、畸形和內(nèi)容物外溢，這與前人的研究結(jié)果“杜松精油具有抑菌能力，且對(duì)多種病原菌具有抑制作用”是相一致的 [20-21]。

殺菌劑對(duì)真菌的作用位點(diǎn)比較多，包括細(xì)胞壁、質(zhì)膜、分泌因子、氨基酸生物合成、信號(hào)組分等，其中細(xì)胞膜對(duì)真菌生長(zhǎng)發(fā)育有著不可或缺的作用。當(dāng)細(xì)胞膜受損傷后通透性變大，無(wú)法進(jìn)行選擇運(yùn)送細(xì)胞內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)含物外泄，菌絲體無(wú)法獲得所需的正常營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，代謝途徑紊亂，最終迫使菌體死亡[22]。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，細(xì)胞膜是杜松精油對(duì)松球殼孢菌的作用位點(diǎn)之一。FDA本身不能發(fā)出熒光，能夠自由穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜，被活細(xì)胞原生質(zhì)體酯酶分解形成熒光素，熒光素不能自由通過(guò)活細(xì)胞，被積累于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光，死細(xì)胞不能分解FDA，故無(wú)法產(chǎn)生綠色熒光，PI作為一種細(xì)胞核熒光染色劑，由于其不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜卻能透過(guò)凋亡中晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染的特點(diǎn)[23]，可以利用其及FDA區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞。本研究采用FDA、PI試劑對(duì)病菌菌絲體染色，杜松精油處理組菌絲細(xì)胞大部分呈紅色熒光，少數(shù)為綠色熒光，說(shuō)明經(jīng)杜松精油處理后的病菌菌絲體細(xì)胞膜的完整性受到破壞。蛋白質(zhì)是真菌重要的組成部分，是維持菌絲生命活動(dòng)的基礎(chǔ)物質(zhì)[24]，也是生物細(xì)胞內(nèi)重要組成成分，本試驗(yàn)中可溶性蛋白質(zhì)含量下降可能是由于菌絲體合成代謝出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致無(wú)法維持正常的生理功能。

氧化脅迫能夠用來(lái)表述生物細(xì)胞內(nèi)的各種有害過(guò)程，這些有害過(guò)程是由活性氧（ROS）的積累和抗氧化酶活性防御之間不平衡導(dǎo)致的[25]。高濃度的ROS[單態(tài)氧（ ¹O₂ ）、超氧化物 O₂^- ）、過(guò)氧化氫（ ...H₂O₂. ）]和羥基自由基（-OH）能夠誘導(dǎo)細(xì)胞在氧化脅迫下死亡。為減輕其影響，細(xì)胞會(huì)進(jìn)化出提高超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶等抗氧化酶的活性等復(fù)雜反應(yīng)及機(jī)制[2]。DCFH-DA探針法發(fā)現(xiàn)杜松精油能夠?qū)е虏≡鶵OS的積累。SOD、POD和CAT活性升高可有效清除過(guò)量的活性氧自由基，減輕其對(duì)生物細(xì)胞膜的傷害。SOD、POD的 EC₃₀ ， EC₅₀ 呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)且 EC₅₀ 組低于 EC₃₀ 組，CAT的EC₃₀ 、 EC₅₀ 的活性隨時(shí)間推移逐漸降低，可能是杜松精油處理激活了病菌細(xì)胞內(nèi)防御酶活力，以增強(qiáng)細(xì)胞清除活性氧能力，防止細(xì)胞損傷，但隨著細(xì)胞膜被破壞，活性達(dá)到峰值后逐漸降低，抵抗能力減弱。

植物細(xì)胞壁是植物應(yīng)對(duì)侵染及外界脅迫的第一道屏障，其具備提供機(jī)械強(qiáng)度和硬度的能力。病原真菌需要通過(guò)分泌一系列細(xì)胞壁水解酶來(lái)降解植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，以達(dá)到入侵植物的目的[27]。多聚半乳糖醛酸酶廣泛分布于真菌中，其能夠降解寄主植物細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸區(qū)域，引起原生質(zhì)體死亡[28]。果膠裂解酶在病原體中充當(dāng)毒力因子，其主要通過(guò) β. 消除反應(yīng)裂解果膠酸，使植物細(xì)胞壁和組織軟化和分解[29]。內(nèi)切 β -1-4葡聚糖酶是細(xì)胞壁水解酶的一種，能夠與內(nèi)切葡聚糖酶及葡萄糖苷酶進(jìn)行協(xié)同使植物纖維素被降解。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)杜松精油能夠讓EG、PG、PL顯著下降，具有濃度依賴性，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)活性逐漸降低，這可能是導(dǎo)致病原菌致病力下降的原因。

綜上所述，杜松精油能顯著抑制松球殼孢菌菌絲生長(zhǎng)，造成菌絲形態(tài)畸形斷裂，破壞病菌細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞內(nèi)含物外泄，抑制細(xì)胞內(nèi)能量物質(zhì)的合成代謝，影響病原菌抗氧化酶活性，導(dǎo)致ROS氧化脅迫，最終降低病原菌致病力，從而達(dá)到抑菌目的。該研究將為樟子松枯梢病的綠色防治奠定一種理論基礎(chǔ)。

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[本文編校：吳毅]