納米ZnO對層出鐮孢菌抑菌效果及轉錄組分析

中圖分類號：S182 ;S432.4^÷4 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）11-0091-08

層出鐮孢菌（Fusariumproliferatum）是重要的作物真菌病原，寄主廣泛，可引起我國重要糧食作物上的病害，如水稻穗腐病以及玉米鞘腐病等[1-2]，也可引起很多園藝植物病害，如香蕉冠腐病、甜瓜果腐病、冬棗果腐病等[3-5]。目前，層出鐮孢菌在美國、俄羅斯、印度等多國均有分布危害[6-8]。該病原物防控多依賴傳統(tǒng)化學農藥，尋找新型的替代性防控思路融入病害綜合防控體系非常重要。

納米材料由于其優(yōu)良特性在農業(yè)科技中的應用已受到廣泛關注，如用于植物保護、作物生長改良及土壤改良等，具有學科交叉屬性[9]。具體到植物病害防控領域，目前已有不少研究證明了包括氧化石墨烯、納米 TiO₂ 、納米 Ag 、納米 Cu 、納米CuO、納米 ZnO 及納米 MgO 在內的各類納米材料對各類植物病原物的抑制效果[10-11] O

納米 ZnO 作為眾多納米材料中的一員，是一種無機金屬氧化物納米材料，它不僅表現(xiàn)對植物病原物良好的直接抑菌效果，還表現(xiàn)出較好的植物抗病性誘導及促進作物生長的屬性，具有極好的應用潛力[12-13]。因此，納米 znO 在植物病害防控領域的價值于近5年受到許多植物病理學家的關注。納米z_nO 可能的核心抑菌方式目前普遍認為有3種[14-16]。第一，納米 znO 溶出的 Zn²⁺ 對細胞造成的影響。第二，納米 znO 表面產生的活性氧（ROS）對細胞造成的影響。第三，納米 znO 靜電吸附到細胞上后對其造成的機械性損傷。迄今，該材料已被證明可對許多真菌病原物表現(xiàn)良好的抑制效果，如引起果蔬灰霉病的灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、引起立枯病的立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）及包括層出鐮孢菌在內的幾種鐮孢菌等[17-20]。已有研究表明，納米 ZnO 可很好地抑制真菌菌絲生長[10-11] C不斷補充的抑菌評估及作用機制探究工作能更好地指導納米 ZnO 在植物病害防控中的應用。

高通量轉錄組測序技術能很好地揭示病原微生物響應抑菌材料脅迫的轉錄變化，利于進一步深入了解材料抑菌作用機制。近年，已有許多學者利用轉錄組測序技術分析了病原微生物對各類抑菌材料的轉錄響應。目前，納米 znO 處理植物真菌病原物后的轉錄組分析還非常少，僅有極其有限的報道[21]。該領域研究還需進一步針對不同類型的植物真菌病原物進行補充。

本研究旨在探究納米 znO 對層出鐮孢菌的抑菌效果及作用機制，研究首先評估了納米 znO 對層出鐮孢菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑制效果，隨后基于掃描電鏡觀察了納米 znO 對層出鐮孢菌細胞形態(tài)的影響，最后基于轉錄組測序評估了納米 znO 對層出鐮孢菌基因表達的影響。本研究的結果將進一步補充納米 znO 對植物真菌病原物的抑菌效果及機理，同時也可為層出鐮孢菌引起的植物病害綜合防控提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

本研究于2023年在遵義師范學院生物與農業(yè)科技學院開展。

供試菌株和納米材料：供試層出鐮孢菌菌株，由北京百歐博偉生物技術有限公司購買。供試納米 znO ，由清河縣鑫滬金屬材料有限公司購買，其粒徑在 50～100nm 間。

試驗儀器：SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司； YXQ-LS-50SII 全自動高壓滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SB-4200D超聲清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；血球計數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；尼康DS-Fi2光學顯微鏡，尼康精機（上海）有限公司;702超低溫冰箱，Thermo FisherScientific;SPX-250恒溫培養(yǎng)箱，上?；|試驗儀器設備有限公司。

1.2方法

1.2.1納米 znO 對層出鐮孢菌菌絲生長的影響試驗采用含毒培養(yǎng)基法，供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基。設置3006009001 2001 500μg/mL 共5個納米 znO 供試濃度處理組，以不含納米 znO 作為對照處理組，每個處理設置4個重復。含毒培養(yǎng)基具體制備方法如下：首先將特定質量的納米 znO 粉末稱量好后混入蒸餾水并在 40kHz 條件下進行 5min 超聲處理。之后將超聲處理后的納米 znO 混合液混入液態(tài)的PDA培養(yǎng)基中做10倍稀釋以達到相應供試濃度，對照處理則混入等體積蒸餾水?；旌虾蟮腜DA培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后倒入直徑為 9cm 的無菌培養(yǎng)皿制成含毒平板，每皿倒入 10mL 培養(yǎng)基。待充分冷卻凝固后，利用打孔器制備直徑 6mm 5d 菌齡的層出鐮孢菌菌餅并接種于平板中間。接種后置于 25°C 恒溫培養(yǎng)箱內進行黑暗培養(yǎng)。待對照處理菌落長至培養(yǎng)Ⅲ2/3時，利用十字交叉法進行菌落直徑測量并計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率的計算方法如下：菌絲生長抑制率 σ=σ （對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑 ×100% 。

1.2.2納米 znO 對層出鐮孢菌分生孢子萌發(fā)的影響試驗設置 300_?600?900.12001 500|μg/mL 共5個納米 ZnO 供試濃度處理組，以不含納米 znO 作為對照處理組，每個處理設置4個重復，每個重復觀察3個玻片。試驗供試分生孢子濃度為 1× 10⁶ 個孢子 ^′mL 。分生孢子洗脫于培養(yǎng)5d的平板，洗脫的孢子懸浮液采用紗布過濾并用血球計數(shù)板調整濃度。試驗將經(jīng)過超聲處理后的納米 znO 混合液滅菌后與分生孢子懸浮液按照 1：1 體積比充分混合為相應供試濃度。每張玻片上移取 20μL 混合液并置于高濕條件下于 25°C 恒溫培養(yǎng)箱內黑暗培養(yǎng) 24h 。隨后利用光學顯微鏡觀察統(tǒng)計分生孢子萌發(fā)情況。統(tǒng)計時每個玻片觀察5個視野，每個視野觀察20個分生孢子。最后計算分生孢子的萌發(fā)率及分生孢子萌發(fā)抑制率。分生孢子萌發(fā)抑制率的計算方法如下：分生孢子萌發(fā)抑制率 Σ=Σ （對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率 ×100% 。1.2.3納米 znO 對層出鐮孢菌細胞形態(tài)的影響試驗共設置2個處理組，分別是 1000μg/mL 的納米znO 處理及無納米材料的對照處理。試驗采用“1.2.1”節(jié)描述的方法制備含毒培養(yǎng)基及層出鐮孢菌菌餅。在接種菌餅之前，將近似培養(yǎng)基大小的滅菌玻璃紙鋪于含毒培養(yǎng)基上，再將菌餅接種于玻璃紙上，以便后續(xù)取樣觀察。 25°C 恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7d進行取樣。樣品用 2.5% 戊二醛固定 ^4h 以上并送至遵義醫(yī)科大學電鏡室進行后續(xù)材料處理及觀察。

1.2.4 轉錄組分析

1.2.4.1樣本的制備及取樣試驗設置2個處理組，分別是濃度 1000μg/mL 的納米 znO 處理及無納米材料的對照處理，每個處理設置3個生物學重復，每個重復利用25血培養(yǎng)物進行混樣。試驗采用“1.2.1”節(jié)描述的含毒培養(yǎng)基的方法進行材料處理及人工接種。培養(yǎng)基上放置玻璃紙便于后續(xù)取樣。25^°C 恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)11d進行取樣。取樣后生物樣本置于液氮中速凍并于 -80°C 保存。之后材料送至北京諾禾致源進行轉錄組測序分析。

1.2.4.2RNA的提取、cDNA文庫構建、質檢及測序樣本RNA采用CTAB（CetyltrimethylammoniumBromide）法進行提取。提取之后利用Agilent2100bioanalyzer進行RNA總量及完整性測定以進行質控。cDNA文庫構建時，首先利用Oligo（dT）磁珠富集mRNA，之后在FragmentationBuffer中用二價陽離子隨機打斷mRNA，以NEB（NewEnglandBiolabs）普通建庫方式進行建庫。建庫完成后，對文庫進行定量和質檢，最后進行Illumina上機測序。1.2.4.3轉錄組數(shù)據(jù)分析測序完成后首先進行測序數(shù)據(jù)質控，之后利用HISAT2軟件將序列比對到參考基因組，隨后利用featureCounts軟件進行基因表達的定量分析。定量分析后使用DESeq2軟件進行基因的差異表達分析，最后利用clusterProfiler軟件進行差異基因基于基因本體數(shù)據(jù)庫（geneontology，GO）及京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）的富集分析。

1.2.5數(shù)據(jù)分析“1.2.1\"節(jié)及“1.2.2\"節(jié)中試驗的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用統(tǒng)計分析軟件Statistix10.0。處理間的差異采用方差分析（LSD測試）進行檢驗，所有差異顯著性在 α=0.05 水平進行評估。

2 結果與分析

2.1納米 znO 對層出鐮孢菌菌絲生長的影響

由表1和圖1可知，納米 znO 各供試濃度處理下的菌落直徑均顯著低于對照，表明納米 znO 對層出鐮孢菌的菌絲生長有明顯抑制作用（ Plt;0.05） 。在試驗的供試濃度范圍內，納米 znO 對層出鐮孢菌菌絲的抑制率隨濃度升高而增強，其菌絲生長抑制率在 39.28%～80.43% 之間。

2.2納米 ZnO 對層出鐮孢菌分生孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，納米 ZnO 各供試濃度處理下的分生孢子萌發(fā)率均顯著低于對照，表明納米 znO 對層出鐮孢菌的分生孢子萌發(fā)也同樣有明顯的抑制作用（ Plt;0.05， 。在試驗的供試濃度范圍內，納米znO 對層出鐮孢菌分生孢子萌發(fā)的抑制率也同樣有隨濃度升高而升高的趨勢，孢子萌發(fā)抑制率在51.62%～72.16% 之間。2.3納米 znO 對層出鐮孢菌細胞形態(tài)的影響由圖2可知，掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)納米 znO 處理的層出鐮孢菌視野表層菌絲稀疏，菌絲量與對照相比有明顯減少（圖2-A、圖2-B）。納米 znO 處理組的視野表層菌絲相比對照表現(xiàn)出明顯的形態(tài)畸變，菌絲變細（圖2-C、圖2-D）。納米 znO 處理下的分生孢子形態(tài)與對照處理中的橢圓形相比有差異，許多孢子形態(tài)有往更圓的形態(tài)轉變的趨勢（圖2-C、圖2-D）。

2.4層出鐮孢菌響應納米 znO 的轉錄組分析

2.4.1測序數(shù)據(jù)質控及參考基因組比對由測序結果（表3）可知，納米 znO 處理和對照的原始序列均值分別是43516116及45229694，過濾后序列均值分別是40535927和43323887。所有樣本Q20值在97 7.20%～98 12% 之間，Q30 值在92.51%～94.65% 之間，GC含量在 51.81% ～52.88% 之間。參考基因組的比對率在 64.95% ～73.68% 之間。

A、B為對照以及納米ZnO處理中菌絲的生長情況，比例尺 =200μm C、D為對照以及納米ZnO處理中菌絲（箭頭）及分生孢子（三角形）形態(tài)，比例尺

2.4.2差異表達基因統(tǒng)計納米 znO 處理和對照一共檢測出7614個共同表達基因，有532個基因僅在對照組中表達，有358個基因僅在納米 ZnO 處理中表達（圖3-A）。2個處理一共檢測出1271個差異表達基因，其中，納米 znO 處理相比對照有683個基因表達上調，588個基因表達下調（圖3-B）。

2.4.3差異表達基因的GO功能富集分析GO 功能富集一共分為生物過程、分子功能及細胞組成三大部分。富集分析結果以 α=0.05 作為顯著性富集的閾值。由表4可知，對于納米 zno 處理中差異上調表達基因進行的GO功能富集分析中，在生物過程部分發(fā)現(xiàn)了12個顯著富集的條目，其中，脂質代謝過程、有機磷酸酯分解代謝過程、細胞脂質代謝過程、磷脂代謝過程及離子運輸富集顯著性排名前5。脂質代謝過程等4個條自有10個以上的基因富集。生物過程部分有許多與細胞膜結構相關的條目。

由表5可知，在分子功能部分發(fā)現(xiàn)了32個顯著富集的條目，其中，作用在酯鍵的水解酶活性、主動跨膜轉運蛋白活性、ATP酶活性、跨膜轉運蛋白活性及轉運蛋白活性富集顯著性排名前5。作用在酯鍵的水解酶活性等17個條目有10個以上的基因富集。分子功能部分有多個與跨膜物質運輸相關的條目。未發(fā)現(xiàn)顯著富集的細胞組成的條目。

由表6可知，對于納米 znO 處理中差異下調表達基因進行的GO功能富集分析中，在分子功能部分發(fā)現(xiàn)了20個顯著富集的條目，其中，跨膜轉運蛋白活性、轉運蛋白活性、黃素腺嘌呤二核苷酸結合、單加氧酶活性及聯(lián)合分子氧作用在單供體的氧化還原酶活性富集顯著性排名前5（表6）。跨膜轉運蛋白活性等11個條自有10個以上的基因富集。分子功能部分有多個與氧化還原酶活性相關的條目。

未發(fā)現(xiàn)顯著富集的生物過程以及細胞組成的條目。值得一提的是，跨膜轉運蛋白活性、轉運蛋白活性及聯(lián)合分子氧及2個氧原子作用在單供體的氧化還原酶活性3個條目也出現(xiàn)在差異上調表達基因的GO功能富集分析中。

2.4.4差異表達基因的KEGG通路富集分析對于納米 ZnO 處理中差異上調表達基因進行的分析中，13條顯著富集的通路中，ABC轉運蛋白、氮代謝、精氨酸和脯氨酸代謝 ??β-? 丙氨酸代謝及類固醇生物合成富集顯著性排名前5（表7）。ABC轉運蛋白以及精氨酸和脯氨酸代謝2條通路有10個以上的基因富集。有多個與各類氨基酸代謝相關的通路。對于納米 znO 處理中差異下調表達基因進行的分析中，7條顯著富集的通路，其中，過氧化物酶體、淀粉和蔗糖代謝、脂肪酸分解、脂肪酸代謝以及氮代謝富集顯著性排名前5（表8）。過氧化物酶體通路有10個以上的基因富集。有多個與能量代謝相關的通路。值得一提的是，脂肪酸分解及泛酸鹽和輔酶A生物合成這2條顯著富集的通路也出現(xiàn)在差異上調表達基因的KEGG通路富集分析中。

3討論

本研究表明，納米ZnO對層出鐮孢菌菌絲生長有較強的抑制作用，這與前人基于各類納米 znO 在幾種鐮孢菌上觀察到的結果[18-20]一致。本試驗中最高可達 80.43% 的菌絲生長抑制率。此外，納米znO 對層出鐮孢菌分生孢子的萌發(fā)具有顯著抑制作用，最高可達 72.16% 的分生孢子萌發(fā)抑制率。在進一步的掃描電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)，納米 ZnO 處理可明顯減少視野表層菌絲的生長量，同時表層菌絲出現(xiàn)形態(tài)變細畸變，這可能也從細胞層面部分解釋了宏觀上納米 znO 處理中菌落直徑顯著降低的原因。前人的研究也表明，納米 znO 可引起真菌病原物的菌絲細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)畸變[22-24]。電鏡觀察也同時發(fā)現(xiàn)，納米 ZnO 可引起分生孢子的形變，許多孢子形態(tài)有往更圓的形態(tài)轉變的趨勢，表明該材料可能通過影響分生孢子的正常發(fā)育進而影響其萌發(fā)率。Elshafie等也觀察到了納米 znO 對植物真菌病原物柑橘鏈格孢（Alternariacitri）分生孢子形態(tài)的影響[23]

本研究在進一步的轉錄組GO功能富集分析中發(fā)現(xiàn)，納米 zno 處理差異上調表達的基因大量顯著富集在與跨膜物質運輸相關的各類條目中，如跨膜轉運蛋白活性以及離子運輸?shù)龋@可能進一步印證了納米 znO 的 Zn²⁺ 溶出的抑菌方式。從納米 znO 中溶出的 Zn²⁺ 通過跨膜物質運輸進入到真菌細胞內部，之后進一步發(fā)揮其對細胞的毒性作用。Ghamari等通過轉錄組分析也發(fā)現(xiàn)許多跨膜轉運蛋白相關基因會在稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）受到納米 znO 處理后顯著上調表達[21]。此外，差異上調表達的基因還顯著富集到GO條目偶聯(lián)跨膜物質運動的ATP酶活性及KEGG通路ABC轉運蛋白。ABC轉運蛋白參與細胞有毒物質外排，說明層出鐮孢菌在受到納米 znO 的外在脅迫后可能也在積極地通過轉運蛋白進行細胞內解毒。許多研究報道了抑菌物質可誘導微生物ABC轉運蛋白相關基因表達上調[25-27]。不過，前人也觀察到了納米 ZnO處理引起丁香假單胞桿菌煙草致病變種（Pseudomonassyringaepv.tabaci）大量ABC轉運蛋白相關基因的表達下調，可能說明不同病原物響應機制的差異[16]

許多學者認為納米ZnO會影響微生物的細胞膜結構，近年的研究也報道了納米 znO 對植物病原細菌細胞膜的破壞及伴隨的細胞內容物泄漏[16，28-30]。本研究轉錄組分析結果同樣支持了納米 znO 對植物病原真菌細胞膜結構的影響。首先，差異上調表達的基因富集在脂質代謝過程、磷脂代謝過程、作用在酯鍵的水解酶活性還有磷脂酶活性等GO條目及脂肪酸分解KEGG通路。這可能說明納米 znO 影響了細胞膜以磷脂為代表的脂質細胞結構。其次，GO功能富集分析中發(fā)現(xiàn)納米 znO 處理差異下調表達的基因同樣大量顯著富集在跨膜轉運蛋白活性這個條目中，說明層出鐮孢菌的部分跨膜轉運蛋白的活性受到納米 znO 顯著影響。近年基于納米復合物抑菌材料 g-C₃N₄@Zn0 對辣椒疫霉（Phytophthoracapsici）進行的差異轉錄組分析中也觀察到了差異下調表達基因顯著富集到轉運蛋白活性條目[31]。值得一提的是，差異上調表達基因富集到的羧肽酶活性及金屬肽酶活性等各類肽酶相關GO條目可能也說明膜蛋白受到納米 ZnO 影響。有意思的是，GO功能富集分析還發(fā)現(xiàn)上調表達的差異基因富集在糖蛋白生物合成過程這個條目，下調表達的差異基因富集在作用于糖苷鍵的水解酶活性這個條目。KEGG通路富集分析也發(fā)現(xiàn)了上調表達的差異基因富集在類固醇生物合成通路。這可能說明層出鐮孢菌在受到納米 znO 脅迫造成的膜損傷后在同步進行一定的膜修復。類似的膜修復機制也在前人基于納米抑菌材料進行的轉錄組分析中提出[21，32]

GO功能富集分析還發(fā)現(xiàn)納米 znO 處理差異下調表達的許多基因富集在多個與氧化還原酶活性相關的條目中，說明納米 z_nO 會影響層出鐮孢菌部分氧化還原酶活性，進而可能影響該菌多種重要生命過程。相似結果同樣在納米 znO 處理稻瘟病菌的差異轉錄組分析中觀察到[2I]。此外，差異表達基因還顯著富集在黃素腺嘌呤二核昔酸結合、淀粉和蔗糖代謝、乙醛酸和二甲酸代謝、泛酸和輔酶A的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝 β- 丙氨酸代謝以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝等GO條目或者KEGG通路中，這提示了納米 znO 對能量代謝以及氨基酸代謝的影響。

4結論

本研究證明了納米 znO 對層出鐮孢菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)顯著的抑制效果。進一步從細胞形態(tài)層面明確了納米 znO 對菌絲和孢子形態(tài)和發(fā)展產生的影響。最后基于轉錄組測序技術從基因表達層面發(fā)現(xiàn)了該材料會影響層出鐮孢菌跨膜物質運輸、細胞膜結構、氧化還原酶活性及能量和氨基酸代謝。這為后續(xù)進一步深人研究納米ZnO對植物真菌病原物的抑菌分子機制及該材料在真菌病害防控中的應用提供了理論參考。

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