園林小菊黑斑病菌菌絲懸浮液接種體系優(yōu)化 和抗病種質(zhì)篩選

中圖分類號： S436.8⁺1 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）11-0099-06

菊花（Chrysanthemummorifolium）為菊科菊屬多年生宿根花卉，世界四大切花之一，具有較高的觀賞價值和藥用價值[1-2]。園林小菊為菊花中的一類小花型品種類群，其植株分枝多而著花繁密，花朵色彩艷麗，廣泛應用于盆栽、園林造景和大地藝術[3]。由鏈格孢菌（Alternaria alternata）侵染引起的黑斑病是園林小菊生產(chǎn)中最常見的病害，在整個生長期均可發(fā)生，在適溫（ 25～27^°C ）、高濕環(huán)境中發(fā)病更為嚴重，每年7、8月是黑斑病發(fā)病的高峰期[4-5]。發(fā)病時葉片出現(xiàn)黑褐色斑點，外圍有黃色暈圈，一般從植株下部葉片開始，然后向上蔓延，嚴重時導致整株葉片發(fā)病[6]。研究表明，菊花黑斑病可通過帶病落葉、土壤及腳芽傳播，傳播范圍極廣[7]。目前進行抗病性育種是防治園林小菊黑斑病最根源、最有效的手段。

建立精準快速鑒定黑斑病抗性的技術體系以篩選出抗病親本材料是園林小菊黑斑病抗性育種的關鍵。在其他作物上已有相關病害抗性鑒定技術體系的研究。張彪等研究發(fā)現(xiàn)，在 28°C，12h- ^12h 光一暗交替的條件下，用灰斑病菌（Cercosporasojina）菌絲塊接種抗感大豆的離體葉片，菌斑面積明顯不同[8]。常有宏等在對梨黑斑病接種方法的研究中發(fā)現(xiàn)，用孢子懸浮液或菌絲液涂抹在葉面上的接種方法相比于菌絲塊接種的發(fā)病時間更早，且發(fā)病癥狀更明顯[9]。臧憲朋等將核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）菌絲懸浮液的濃度調(diào)至吸光度 D_600nm 為1.0～2.0 ，用空壓機噴霧接種到油菜植株，每株接種約 2.5mL ，保濕 48h ，研究結(jié)果顯示該方法適用于油菜苗期菌核病的抗病性評價[10]

目前，關于菊花黑斑病的研究主要集中在抗性品種篩選、鑒定方法、防治方法等方面[11-14]，然而其抗性鑒定評價體系尚不健全。本研究采用鏈格孢菌（Alternariaalternata）菌絲懸浮液接種的方法，對不同菌株的致病力進行鑒定，利用最佳菌株進行不同接種用量和接種方法的試驗比較，并引用黑斑病抗病模型把人工接種鑒定結(jié)果與田間病害調(diào)查結(jié)果相結(jié)合，對現(xiàn)有的11份園林小菊種質(zhì)進行抗病性評價，以期優(yōu)化建立園林小菊苗期黑斑病快速、準確鑒定的菌絲接種體系，為菊花抗病種質(zhì)篩選提供技術支撐。

1材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2022年6—10月在南京農(nóng)業(yè)大學白馬教學科研基地進行。供試的鏈格孢菌（Alternariaalternata）菌株CJ31、CJ37、CJ3、F20，均由南京農(nóng)業(yè)大學菊花遺傳育種實驗室從滁菊和福白菊黑斑病病株中分離并保存。供試的11份園林小菊種質(zhì)（靈峰白、靈峰黃、靈峰錦、靈巖淡黃、靈巖鮭、靈溪橙、溱湖白、金陵紅荷、鐘山楚薇、鐘山奶黃、鐘山文秀）來源于中國菊花種質(zhì)資源保存中心。

1.2病原菌活化及菌絲懸浮液制備

將菌株接種至PDA培養(yǎng)基活化， 28^°C 培養(yǎng)7d后用滅菌打孔器沿PDA培養(yǎng)基邊緣打取直徑為

5mm 大小的36枚菌塊置于 200mL PDB培養(yǎng)基中，在 28^°C 搖床上以 200r/min 振蕩培養(yǎng) 24h 。在超凈工作臺內(nèi)用前端剪口的藍槍頭將菌球吸出，放進 1.5mL 離心管中。每個離心管放2個菌球和1個鋼珠，將菌球全部裝入離心管中后置于高通量組織研磨儀內(nèi)， 50Hz?120s 振碎菌絲。研磨后，將菌絲勻漿全部倒人 500mL PDB培養(yǎng)基中，在 28^°C 搖床上以 200r/min 繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 48h ，制成菌絲懸浮液，濃度調(diào)至吸光度 D_600nm=1.0 備用。

1.3黑斑病菌菌絲懸浮液接種抗性鑒定方法的建立

1.3.1不同菌株的致病力比較以苗齡 33d 左右的靈溪橙離體葉片為接種對象，采集植株頂部向下第2～3張完全展開并且無病蟲害和損傷的成熟葉片。采集的葉片首先用 75% 乙醇沖洗 10s ，隨后用無菌水沖洗3遍，每遍 3s ，用無菌濾紙擦干表面水分，葉柄處包裹上1層蘸有無菌水的濕潤滅菌脫脂棉。在外徑 90mm 的無菌圓形培養(yǎng)皿中平鋪放入無菌濾紙，加入 15mL 無菌水。隨后將處理好的葉片放入培養(yǎng)皿中，避開葉片主脈用 2mL 注射器針頭在葉片同一位置輕輕扎3～5個小孔，創(chuàng)傷面積盡量保持一致。在接種過程中，每次吸取菌絲懸浮液前先輕輕搖晃，保證均勻性，隨后吸取 2mL 菌絲懸浮液置于濾紙上過濾，用鑷子或毛筆將菌絲聚集成團，避開葉脈涂抹于離體葉片背面刺傷處，同時在對照葉片背面刺傷處均勻涂布等量的無菌水。在28^°C 、相對濕度 70%～80% 、12 h—12h光—暗交替的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7d后觀察發(fā)病情況并拍照記錄。每個處理接種10張葉片，重復3次。

1.3.2不同菌絲懸浮液接種用量的致病效果比較

基于已篩選出的最佳菌株，以11份苗齡為33d左右的園林小菊種質(zhì)為材料進行活體接種，將菌絲接種于植株第3或第4張真葉背面，設置濃度為D_600nm=1.0 的 0.1，2.0，4.0mL3 個菌絲懸浮液接種量的處理。葉片處理及接種方法同“1.3.1”節(jié)，葉片接種完成后套上3號自封袋，自封袋與葉片背面留有縫隙。對照葉片背面刺傷處涂布等量的無菌水并套上自封袋。在 28^°C 、相對濕度為 70% ～80% .12h-12h 光一暗交替的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個品種每個處理接種5株，重復2次，接種7d后摘取自封袋，觀察發(fā)病情況并拍照記錄。

1.3.3活體接種和離體接種的鑒定方法比較在確定最佳菌株和接種量的基礎上，比較相同接種體系下苗齡為 33d 的11份園林小菊種質(zhì)離體接種和活體接種的抗性鑒定情況。離體葉片處理方法及培養(yǎng)條件同\"1.3.1\"節(jié)，接種7d后，記錄發(fā)病情況。每個品種接種10張葉片，重復3次。

1.4 田間植株發(fā)病率調(diào)查

在盛花期采用五點取樣法對園林小菊田間自然發(fā)病情況進行調(diào)查。每個品種每點各取2株長勢一致的植株，每株在其內(nèi)外側(cè)分別取一分枝，在分枝的上、中、下部隨機各取3張葉片進行統(tǒng)計，每個品種共調(diào)查180張葉片，統(tǒng)計發(fā)病率。

1.5病情統(tǒng)計與抗病模型

病害分級標準和鑒定標準參考許高娟等關于菊花鏈格孢屬真菌病害分級標準[15并根據(jù)實際情況適當調(diào)整。黑斑病病情分級標準為：0級，葉片健康無病害；0.5級，葉片黃化或有1～2個零星小斑點；1級，病斑面積占比 ?10% ；2級， 10% lt;病斑面積占比 ?25% ；3級， 25% lt;病斑面積占比 ?50% ;4級， 50% lt;病斑面積占比 ?75% ；5級，病斑面積占比 gt;75% 。根據(jù)葉片的病害程度及數(shù)量，計算發(fā)病率和病情指數(shù)（DSI）。

發(fā)病率 ：∑（病害級別×該級病葉數(shù)） ×100 DSI= 。最高病害級別 × 調(diào)查總?cè)~數(shù)

抗病性標準為：免疫（I）， DSI=0 ;高抗（HR），0

參照馬燕等建立的月季黑斑病抗病模型[16]進行抗病性評價： W=f×D×N×100 （ H?100cm 或W=0.8×f×D×N×100（Hlt;100cm） 。其中： W 表示抗病評價綜合值 _;f 表示栽培地系數(shù)； D 為葉片感病面積百分比； N 為田間調(diào)查植株發(fā)病率 ?^H 為植株高度。

對模型公式進行優(yōu)化，綜合活體狀態(tài)下田間自然發(fā)病率和人工接種的病情指數(shù)建立抗病模型，用活體接種病情指數(shù) D_iff 替代原公式中葉片感病面積百分比 D ，由于園林小菊植株高度均小于 100cm 且種植地排水良好 （f=1） ），故公式最終優(yōu)化為 W= 0.8×D_☉/?×N_? 。根據(jù)抗病綜合值 W 確定抗病等級 L W=0，L=1（I） ·020，L=6（HS） 。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel2021進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用SPSS26進行Duncan's法差異顯著性分析（ α=0.05 ），用Origin2021軟件進行線性回歸分析及圖像繪制，采用ImageJ計算病斑面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致病力鑒定

采用離體葉片接種方法測定了CJ31、CJ37、CJ3、F20這4種菌株的致病力。結(jié)果表明，4種菌株均能引起葉片發(fā)病，接種菌株CJ31、CJ37、CJ3、F20的病情指數(shù)分別為80.56、63.89、48.61、68.05，菌株CJ31的致病力最強（圖1）。接種不同菌株的葉片出現(xiàn)不同程度的病癥（圖2），接種菌株CJ31的離體葉片發(fā)病癥狀最明顯，病斑周圍有淡黃色暈圈，其他3種菌株接種后的病斑面積較小，發(fā)病程度較弱。因此，菌株CJ31的致病力最強，在短時間能夠出現(xiàn)明顯的病癥，能實現(xiàn)快速有效的抗病性鑒定。

2.2菌絲懸浮液接種用量的確定

采用菌株CJ31進行活體接種，比較菌絲懸浮液液濃度為 D_600nm=1 的不同接種量的致病效果。結(jié)果表明，3個菌絲懸浮液接種量均能引起植株發(fā)病，平均發(fā)病率在 80. 00%～95. 45% 之間（表1）。2.0mL 接種量下11個品種之間的病情指數(shù)相比于0.1，4.0mL 的差異更明顯（圖3）。此外，抗病等級占比統(tǒng)計結(jié)果（圖4）顯示， 0.1mL 接種量下主要表現(xiàn)為抗病或中抗，而 4.0mL 接種量下主要表現(xiàn)為感病至高感。只有在接種 2.0mL 菌絲懸浮液時，11份種質(zhì)在各抗病等級上有較均勻的分布，抗病、中抗、感病、高感品種的占比分別為 9.09% .18.18% ！36.36% （204號 ，36.36% 。綜上，采用 2.0mL 的菌絲懸浮液接種量能區(qū)分不同品種之間的抗病性，適用于園林小菊苗期黑斑病的抗性鑒定。

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同處理間在0.05水平上差異顯著。表2同。

2.3活體接種和離體接種抗性鑒定比較

在相同的接種體系下，11份園林小菊種質(zhì)苗期活體接種和離體接種的抗性鑒定結(jié)果如表2所示，活體接種的病情指數(shù)在 25.00～84.17 之間，離體接種的病情指數(shù)在 38.89～95.83 之間，均未發(fā)現(xiàn)免疫和高抗品種，各抗性等級的代表品種在2種接種方法下的發(fā)病癥狀見圖5。11份園林小菊苗期活體接種和離體接種的病情指數(shù)線性相關分析結(jié)果顯示線性相關系數(shù) r 為0.76，呈極顯著相關（圖6），說明苗期活體接種和離體接種的抗性鑒定結(jié)果比較一致，因此活體接種和離體接種這2種接種方式均可用于園林小菊苗期黑斑病抗性鑒定。

2.4園林小菊抗黑斑病能力綜合評價

根據(jù)優(yōu)化后的黑斑病抗病模型，綜合活體接種和田間發(fā)病調(diào)查結(jié)果，計算11個園林小菊品種的抗病綜合值，結(jié)果如表3所示。靈峰黃的抗病綜合值為5.11，表現(xiàn)為抗??；靈巖淡黃、靈峰錦和鐘山文秀這3份種質(zhì)的綜合抗性為中抗；金陵紅荷、鐘山奶黃、靈巖鮭、靈峰白、山楚薇、靈溪橙和溱湖白這7份種質(zhì)表現(xiàn)為高感。因此優(yōu)化的抗病模型能區(qū)分

3討論

建立抗性鑒定方法以篩選抗病種質(zhì)是推進遺傳育種工作的重要手段[17-20]。菌絲接種法是不同作物葉部病害抗性鑒定常用的一種方法[21-24]，其致病效果受菌株致病力和接種量的影響。本研究前期對4種菌株的致病力進行測定，篩選出致病力較強的菌株CJ31用于接種鑒定以提高接種鑒定效率[25-26]。此外本研究發(fā)現(xiàn)病情指數(shù)隨著菌絲接種量的增加而增大，這與彭鐵成等的研究結(jié)果[27]一致。在菌絲懸浮液濃度為 D_600nm=1 時，接種0.1mL 的發(fā)病情況較弱，可能是因為活體植株代謝旺盛，體內(nèi)產(chǎn)生活性氧等物質(zhì)能迅速把致病毒素清除[28-30]；當菌絲懸浮液為 4.0mL 時，大部分品種表現(xiàn)出嚴重病癥，同樣也無法區(qū)分不同種質(zhì)的抗病性；接種量為 2.0mL 時，品種的發(fā)病情況有差異，最能區(qū)分出不同品種的抗性。在接種方法方面，徐成翠等對番茄灰葉斑病抗性鑒定方法的研究發(fā)現(xiàn)苗期活體接種結(jié)果和離體接種結(jié)果的相關系數(shù)達到0.91，而離體接種后的病情指數(shù)比苗期活體接種平均增高 1.3%^[31] 。在本研究中，11份園林小菊活體接種和離體接種的抗性結(jié)果同樣顯示這2種接種方法的一致性較高，但離體接種的發(fā)病程度更嚴重，可能與葉片在離體狀態(tài)下對病菌的防御抵抗能力下降有關。

目前關于抗病種質(zhì)篩選方面的研究大多只關注田間調(diào)查結(jié)果或人工接種鑒定結(jié)果，少有把2種方法的結(jié)果結(jié)合起來。已有的報道中，馬燕和馮慧等探索建立的黑斑病抗病等級模型[16.32]，把田間病害調(diào)查結(jié)果與離體葉片鑒定結(jié)果相結(jié)合的辦法對月季黑斑病抗性進行了評價，避免了單一方法鑒定的不準確性。本研究引入了黑斑病抗病等級模型并進行優(yōu)化，綜合田間自然發(fā)病情況和活體接種結(jié)果，對不同品種抗黑斑病的綜合能力值進行比較，發(fā)現(xiàn)品種之間的抗病性差異較顯著，最終篩選出1份抗病品種、3份中抗品種和7份高感品種，評價具有全面性和可靠性，能客觀反映品種的真實抗性水平。

4結(jié)論

本研究建立了CJ31菌株接種， 2.0mL 菌絲懸浮液接種量（ D_600nm=1 ）的園林小菊苗期菌絲懸浮液接種抗性鑒定體系，同時發(fā)現(xiàn)苗期活體接種和離體接種均適用于黑斑病抗病性鑒定，研究結(jié)果為園林小菊抗黑斑病種質(zhì)的篩選提供了技術支撐。此外，本研究鑒定出抗病品種靈峰黃可用于后續(xù)園林小菊黑斑病抗性品種改良的親本材料和黑斑病抗病機制的研究。

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