油橄欖內(nèi)生真菌的分離鑒定及其抑菌活性研究

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2025）11-0277-08

油橄欖（OleaeuropaeaL.）屬于木樨科木樨欖屬的一種常綠喬木，主要適生區(qū)在地中海沿岸，包括希臘、意大利、西班牙、突尼斯等國(guó)都是重要生產(chǎn)地[1]。我國(guó)自20世紀(jì)60 年代引種成功后，主要在西北、西南發(fā)展種植，其中甘肅省隴南市的油橄欖種植面積和鮮果產(chǎn)量均居全國(guó)第—[2-4]。油橄欖也是一種木本油料樹種，用其鮮果直接榨取的橄欖油富含不飽和脂肪酸、角鯊烯、植物淄醇、酚類物質(zhì)和一些微量元素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等功效，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，被譽(yù)為“液體黃金”[5]。除此之外，油橄欖果實(shí)也可應(yīng)用于醫(yī)藥化工、食品保健等行業(yè)，具有極高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[6]。植物內(nèi)生真菌分布廣，種類多，在植物體內(nèi)普遍存在，但其不會(huì)造成宿主植物的感染發(fā)病癥狀，它與植物之間的關(guān)系經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化，對(duì)宿主植物的健康至關(guān)重要[7。目前已報(bào)道由內(nèi)生真菌產(chǎn)生的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物超過(guò)20000種，從中尋找具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等開發(fā)潛能的生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥開發(fā)、生物防治、研究對(duì)植物的誘導(dǎo)抗性方面，受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[8-10]。通過(guò)對(duì)油橄欖內(nèi)生真菌的分離與培養(yǎng)，可以獲得豐富的真菌資源，然后研究其次生代謝產(chǎn)物，期望能夠分離檢測(cè)到活性較好的化合物，從而為植物真菌資源的開發(fā)與利用提供依據(jù)和指導(dǎo)。

油橄欖內(nèi)生真菌研究主要集中在國(guó)外，研究人員通過(guò)多種方法對(duì)油橄欖不同部位中內(nèi)生真菌的多樣性進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)油橄欖內(nèi)生真菌種類和數(shù)量在不同的品種、季節(jié)、地理位置和植物部位間差別較大，其次生代謝產(chǎn)物在抗菌、抗腫瘤方面報(bào)道較多[1l-13]。Martins 等研究了油橄欖花與果實(shí)中內(nèi)生真菌在保護(hù)寄主植物免受炭疽病侵害時(shí)的潛在作用，并確定了對(duì)油橄欖炭疽病具有生物防治潛力的候選菌株，證明了油橄欖內(nèi)生真菌豐富度與炭疽病的發(fā)病率有關(guān)[14]。Malhadas等研究了3株從油橄欖葉片中分離得到的內(nèi)生真菌對(duì)大腸桿菌等病原菌的抑制作用，強(qiáng)調(diào)次生代謝產(chǎn)物中的揮發(fā)性成分3-甲基-1-丁醇和苯乙醇具有抗菌潛力[15]。Mady等從埃及采集到的油橄欖葉片中分離得到的內(nèi)生真菌產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum），其次生代謝產(chǎn)物吲哚生物堿被證明對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞的增殖具有良好的抑制作用[16]。Liarzi等從油橄欖中分離出1株內(nèi)生的炭球菌近似種Daldiniacf.concentrica，其次生代謝產(chǎn)物不僅有抑菌作用，而且對(duì)根結(jié)線蟲有殺滅作用[17]。李勇杰等分析了云南引種油橄欖嫩葉中抗氧化成分含量，但截至目前，國(guó)內(nèi)對(duì)本土油橄欖內(nèi)生真菌的研究尚是空白，對(duì)其次生代謝產(chǎn)物也未見(jiàn)報(bào)道[18]。本研究采用組織分離法分離油橄欖內(nèi)生真菌，測(cè)定其次生代謝產(chǎn)物的抗菌活性并對(duì)抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行粗提作高效液相色譜（HPLC）分析，從中篩選出具有抗菌活性的菌株，為油橄欖內(nèi)生真菌資源的下一步研究做基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試材料2023年10月初健康油橄欖枝條、根、葉片均采自甘肅省隴南市武都區(qū)兩水鎮(zhèn)大灣溝油橄欖種植基地。

1.1.2供試植物病原菌桉樹青枯病菌Ralstoniasolanacearum（ ）、番茄瘡痂病菌Xanthomonasvesicatoria （G^-） 、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis（ G⁺ ）和溶血葡萄球菌Staphylococcushaemolyticus （G⁺） ，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院植物和微生物健康實(shí)驗(yàn)室提供。成團(tuán)泛菌Pantoeaagglomerans（G^- ）和黃單胞桿菌Xanthomonasarboricola（ G^- ）由甘肅省隴南市經(jīng)濟(jì)林研究院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.3主要試劑乙酸乙酯（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；石油醚（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；GF254薄層層析硅膠板（青島海洋化工有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT）生物顯色劑（Amresco公司）；硫酸鏈霉素（Sigma公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離和純化將油橄欖枝條、根、葉片分別用清水洗凈，內(nèi)生真菌的分離純化采用 Shan 等的方法[19]。將枝條和根去除表皮，分成約 0.5cm×0.5cm×0.5cm 大小的塊段，將葉片葉脈周圍部分切為 0.5cm×0.5cm 片狀。取第3次漂洗的無(wú)菌水 2mL 涂布于PDA培養(yǎng)基中，并在相同條件下培養(yǎng)作為對(duì)照，若沒(méi)有真菌生長(zhǎng)，說(shuō)明消毒徹底。

1.2.2內(nèi)生真菌的鑒定 形態(tài)學(xué)的鑒定主要是觀察菌絲特征和菌落形態(tài)。

分子生物學(xué)的鑒定具體方法如下：將保種的內(nèi)生真菌接種到PDA培養(yǎng)基活化后再接種至含有20mL 液體培養(yǎng)基（PDB）的三角瓶（規(guī)格 50mL ））中，后放置在 28°C 搖床上以 150min 振蕩 6～ 7d 。將菌絲球加入液氮研磨至粉末狀。采取北京擎科生物科技股份有限公司植物DNA提取試劑盒（TSINGKE）提取真菌DNA。然后使用通用引物ITS1/ITS4（ITS1 .5^′ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3^′;ITS4;5^′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC- ?3^′ 擴(kuò)增真菌ITS序列，擴(kuò)增體系為 50μL ：ITS1和ITS4各2μL，1×TSE101 金牌mix 45μL 、DNA模板 1μL 完成后放人PCR儀。擴(kuò)增程序?yàn)椋?98°C3min ： 個(gè)循環(huán)； 72^°C 延伸 5min ， -4^°C 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技股份有限公司（成都）完成測(cè)序。在NCBI采用Blast檢索比對(duì)，使用MAFTTversion7處理下載的相似性較高的序列和其近緣屬的序列，用MEGA7.0.26軟件采用最大似然法（maximumlikelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrapmethod中重復(fù)抽樣次數(shù)設(shè)置為1O0O，模式為Kimura2-parametermodel。模式菌株用粗體表示。

1.2.3油橄欖內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的制備將菌株活化后，接種于 50mL 的三角瓶中，每瓶裝20mL PDB液體培養(yǎng)基，在 25°C.160r/min 下培養(yǎng)7d，每種真菌培養(yǎng)3瓶。培養(yǎng)完成后，每罐大米培養(yǎng)基接種1瓶菌液，重復(fù)3次，共發(fā)酵3個(gè)月。發(fā)酵完成后用乙酸乙酯浸泡發(fā)酵產(chǎn)物3次，每次 7d 。發(fā)酵液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，將粗提物放置到干凈的西林瓶中 4^°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4抗細(xì)菌活性的測(cè)定通過(guò)TLC-MTT-生物自顯影法測(cè)定其抗細(xì)菌活性[20]。用點(diǎn)樣毛細(xì)管（內(nèi)徑 0.5mm ）均勻輕點(diǎn)在薄層板上，少量多次，每個(gè)點(diǎn)擴(kuò)散直徑不要超過(guò) 5mm 。展開劑為石油醚：乙酸乙酯 δ=6：1 （體積比）?？咕钚詸z測(cè)時(shí)陽(yáng)性對(duì)照為 0.2mg/mL 硫酸鏈霉素，點(diǎn)于點(diǎn)樣板最右端。然后將供試細(xì)菌使用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于溫度為 28^°C 、速度為 160r/min 的恒溫振蕩搖床中搖培 ^12h 。在加熱至融化的LB半固體培養(yǎng)基（瓊脂質(zhì)量濃度為 5g/L 中加入菌液，搖晃均勻；將菌液混合液快速倒至薄層板上，輕振使其表面保持薄厚均勻。將該板放人加入適量無(wú)菌水并鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中 25^°C 保濕培養(yǎng)， ^12h 后向薄層板噴適量 5mg/mL MTT溶液。通過(guò)計(jì)算抗菌斑點(diǎn)的遷移率 （R_f） ，對(duì)樣品中抗菌物質(zhì)的數(shù)量和極性進(jìn)行初步估算，然后根據(jù)抑菌斑點(diǎn)的直徑判斷抑菌能力的強(qiáng)弱。遷移率 （R_f） 計(jì)算公式如下：

遷移率 展開劑前沿與點(diǎn)樣處之間的距離 斑點(diǎn)與點(diǎn)樣處之間的距離

1.2.5次生代謝產(chǎn)物的HPLC分析將內(nèi)生真菌粗提物取少量至干凈西林瓶中，用氮吹儀吹干稱重并用色譜甲醇溶解，將粗提物濃度控制在 10mg/mL 左右，用 0.22mm 濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì)。試驗(yàn)使用色譜乙腈-水反相色譜梯度洗脫，內(nèi)生真菌粗提物洗脫梯度如下： 0～1min 使用 30% 色譜乙腈梯度洗脫， 1～16min 色譜乙腈濃度由 30% 線性遞增至100% ， 16～21min 使用 100% 色譜乙腈進(jìn)行等度洗脫， 21～22min 色譜乙腈由 100% 線性遞減至 30% ，22～29min 使用 30% 色譜乙腈對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡[每1L流動(dòng)相中均需加人 0.1mL 三氟乙酸（TFA）]，柱溫頭 40°C ；流速 1mL/min ；進(jìn)樣量10mL ;采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器（DAD）進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 油橄欖內(nèi)生真菌的分離和鑒定結(jié)果

共分離到15株真菌，其中從油橄欖枝條中分離 到5株，根內(nèi)分離到6株，葉片內(nèi)4株。通過(guò)觀察菌 落形態(tài)，合并后得到13株具有明顯差異的內(nèi)生真 菌，分別命名為 Oef-1～Oef-13 （圖1）。

不規(guī)則，呈淺綠色。除 Oef-11 和 Oef-13 ，其他內(nèi)生真生長(zhǎng)速度較快，尤其Oef-8生長(zhǎng)最快。Oef-11和Oef-13菌絲致密，生長(zhǎng)緩慢，Oef-13在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生黃色色素，將整個(gè)培養(yǎng)基染成黃色。

結(jié)合分子鑒定，將ITS序列提交至NCBI，獲得登錄號(hào)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見(jiàn)圖2。13株內(nèi)生真菌分屬于9個(gè)不同的屬，分別是鐮刀菌屬（Fusarium）頂孢霉屬（Acrocalymma）指狀叢赤殼屬（Dactylonectria）、卡納霉屬（Canariomyces）、間座殼屬（Diaporthe）、鏈格孢屬（Alternaria）、亞隔孢殼屬（Didymella）、光黑殼屬（Preussia）殼格孢屬（Camarosporium）。最終鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2油橄欖內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的抗細(xì)菌活性如表2所示，除 和Oef-12外，其余菌株均有一定的抑菌活性，大多對(duì)桉樹青枯病菌抑制效果最好。其中9株真菌可對(duì)青枯病菌產(chǎn)生抑菌活性， 存在 R_f 值為 0.00～0.12，0.35～ 0.40和 0.49～0.51 的3種極性的抗青枯病菌成分； Oef-2 存在 R_f 值為 0.00～0.20 和 0.32～0.44 的抗青枯病菌成分，最大抑菌圈直徑大于 10mm ：_0ef-9 存在 R_f 值為 0.00～0.15 的抗青枯病菌成分，且抑菌圈直徑大于 10mm;Oef-4，Oef-5 Oef-6.0ef-7.0ef-8 均在不止1個(gè)極性范圍測(cè)定出抗青枯病菌活性成分。此外， Oef-2 和Oef-9對(duì)其他4種供試細(xì)菌中均表現(xiàn)出抑制活性， Oef-9 對(duì)枯草芽孢桿菌和溶血葡萄球菌的抑制活性均強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照，其抑菌斑直徑大于 10mm 。多數(shù)內(nèi)生真菌粗提物抑菌斑的 R_f 在 0～0.20 之間，說(shuō)明具有抑菌活性的物質(zhì)極性較大。

2.3油橄欖內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物HPLC分析

真菌次生代謝產(chǎn)物具有多元生物活性，因此，能產(chǎn)生豐富次生代謝產(chǎn)物的資源真菌，更具拮抗病原菌的潛能。本研究首先將13株內(nèi)生真菌進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的HPLC化學(xué)篩選。根據(jù)高效液相色譜圖結(jié)果（圖3）顯示，13株內(nèi)生真菌的粗提物中的次生代謝產(chǎn)物種類（紫外吸收峰個(gè)數(shù)）都較為豐富，主要以大中等極性物質(zhì)為主，其中 2～15min 內(nèi)的中大極性化合物的含量在總粗提物中含量的占比最高， 20min 以后有較少的小極性物質(zhì)，13株菌的粗提中的次生代謝產(chǎn)物大部分分布（保留時(shí)間）相同，但含量（紫外吸收相對(duì)高度）存在較大差異。

3結(jié)論與討論

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于油橄欖內(nèi)生真菌的記錄，大概從油橄欖中分離出245株內(nèi)生真菌，鑒定到種的只有116株，其中以子囊菌居多[12]。這些研究主要圍繞油橄欖主產(chǎn)區(qū)地中海地區(qū)國(guó)家展開，對(duì)我國(guó)油橄欖內(nèi)生真菌的研究尚是空白。本研究從我國(guó)甘肅隴南地區(qū)的油橄欖枝條、果實(shí)和葉片中分離得到13株內(nèi)生真菌，從不同的植物部位分離到的內(nèi)生真菌存在差異。這些內(nèi)生真菌都屬于子囊菌門，而研究發(fā)現(xiàn)子囊菌門真菌在由植物分離到的內(nèi)生真菌中占比最多[21]。大量研究表明，包括內(nèi)生真菌的植物微生物組的組成受到植物組織特異性的顯著影響，這可能源于宿主提供的營(yíng)養(yǎng)類型和細(xì)胞微環(huán)境的差異[22]。例如，水稻根內(nèi)部、根表面和根瘤層的微生物的比較組學(xué)分析揭示了顯著的生物多樣性差異，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了對(duì)植物不同部位內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)功能進(jìn)行系統(tǒng)性分析的必要性，特別是通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，為下一步研究提供了思路[23]

此外，季節(jié)性變化對(duì)于植物內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)具有深遠(yuǎn)的影響，植物內(nèi)生真菌群落的組成與植物生理活動(dòng)的季節(jié)性變化以及環(huán)境因子的季節(jié)性波動(dòng)直接相關(guān)[24]。長(zhǎng)期觀測(cè)研究表明，內(nèi)生真菌的群落組成不是靜態(tài)的，而是隨著季節(jié)和植物生長(zhǎng)周期而變化[25]。這些變化可能會(huì)影響植物的適應(yīng)性和生長(zhǎng)表現(xiàn)，因此，深入理解植物內(nèi)生真菌群落季節(jié)性變化對(duì)于預(yù)測(cè)植物對(duì)全球生態(tài)系統(tǒng)功能的影響至關(guān)重要。同時(shí)或許有些真菌只能在油橄欖體內(nèi)存活，不能在人工配制的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，從而影響到分離出內(nèi)生真菌的種類。

此次分離得到的13株內(nèi)生真菌中有鐮刀菌屬、間座殼屬和鏈格孢屬等真菌，在其他植物中多為植物病原菌，如 F .oxysporum能引起多種植物的枯萎病和根腐病，A.alternata可以引起核桃黑斑病和其他病害，D.novem 可對(duì)大豆造成毀滅[26-29]。某些真菌物種在不同環(huán)境條件或宿主生理狀態(tài)下，可以表現(xiàn)為病原體或是促進(jìn)宿主生長(zhǎng)的內(nèi)生真菌，這種現(xiàn)象的分子機(jī)制仍然不完全清楚，但可能涉及宿主免疫系統(tǒng)的激活與抑制、真菌致病因子的表達(dá)調(diào)控，以及環(huán)境壓力對(duì)宿主和病原體互作的影響。研究這種復(fù)雜的相互作用對(duì)于開發(fā)新的農(nóng)業(yè)管理策略，以提高作物產(chǎn)量和抗病性具有重要意義。

許多內(nèi)生真菌通過(guò)產(chǎn)生抗微生物化合物或誘導(dǎo)宿主植物的防御機(jī)制來(lái)參與植物的生物防御過(guò)程，增加植物抵抗環(huán)境脅迫的能力。這些真菌代謝物不僅可以對(duì)抗植物病原體，也有可能對(duì)抗害蟲。理解這些化合物的生物合成途徑和作用機(jī)制對(duì)于生物防御策略的開發(fā)有著重要的應(yīng)用前景[7.30]。本研究中菌株Oef-2和Oef-9表現(xiàn)出較好的抑菌活性，與Oef-2相似度最高的菌株為A.walkeri，而Zeng等從水稻中分離出同屬真菌游動(dòng)頂孢霉（A.vagum），發(fā)現(xiàn)該菌不僅能提高水稻產(chǎn)量，還能誘導(dǎo)水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性，而本研究首次發(fā)現(xiàn)菌株Oef-2對(duì)多種病原細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，可對(duì)該屬真菌的抑菌潛能進(jìn)行深入挖掘[31]。與Oef-9相似度最高的菌株為A.alternata，該菌雖然可引起植物葉斑病，但Malhadas等從健康油橄欖葉片中分離出該菌，對(duì)其他病原菌也有很好的抑制效果，可能這2株真菌參與了油橄欖生物防御過(guò)程，還有待于進(jìn)一步研究[15，32]。 _0ef-5 和 Oef -6在生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)不同，抑菌活性也稍有不同，鑒定結(jié)果均與座囊菌綱真菌Dothideomycetessp.（KU059942）相似度最高，可能由種間差異引起。此次供試細(xì)菌中的 P agglomerans 和 X. arboricola都為核桃黑斑病的病原菌[33]

內(nèi)生真菌廣泛存在于植物體內(nèi)，目前已經(jīng)從內(nèi)生真菌的次生代謝物中分離得到的黃酮類、萜類、甾體類、酚類等活性物質(zhì)，表現(xiàn)出抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種活性[34-36]。鏈格孢屬和鐮刀菌屬是2個(gè)重要的能產(chǎn)生毒素的真菌類群，真菌毒素除了可應(yīng)用于致病性研究，對(duì)抗病品種的誘導(dǎo)、開發(fā)新型除草劑等也有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，莖生殼二孢（Ascochytacaulina）與其自身產(chǎn)生的3種毒素的混合物共同使用時(shí)可以提高對(duì)藜的防治效果[37]。此外有研究表明，鐮刀菌可誘導(dǎo)三七合成皂昔，還可產(chǎn)生生物堿類等物質(zhì)[38]。為了尋找次生代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)量高、構(gòu)類型豐富、活性較好的真菌菌株，不能僅依賴傳統(tǒng)的活性篩選方法[39]。因此本研究除對(duì)分離得到的13株內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)外，還對(duì)其進(jìn)行乙酸乙酯冷浸提取，采用HPLC對(duì)13株植物真菌提取物進(jìn)行化學(xué)篩選。分析其譜圖中各代謝產(chǎn)物的紫外吸收、吸收強(qiáng)度和保留時(shí)間發(fā)現(xiàn)，13個(gè)菌株的次生代謝產(chǎn)物極性大都較為適中，其中Oef-3的次生代謝產(chǎn)物種類最為豐富且含量高，Oef-1、Oef-6、Oef-9 和Oef-13的次生代謝產(chǎn)物較為豐富且含量相對(duì)較多，剩余菌株的次生代謝產(chǎn)物都較為平均，因此結(jié)合抗菌試驗(yàn)結(jié)果，選擇Oef-9進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

系統(tǒng)性地研究?jī)?nèi)生真菌及其與宿主植物的相互作用對(duì)于理解生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性、生態(tài)功能以及對(duì)環(huán)境變化的影響極其重要；此外，對(duì)于開發(fā)可持續(xù)的農(nóng)林業(yè)發(fā)展策略、保護(hù)生物多樣性以及應(yīng)對(duì)全球氣候變化具有直接的應(yīng)用價(jià)值。今后的研究中，可以充分考慮內(nèi)生真菌具備促進(jìn)生長(zhǎng)和增強(qiáng)抗逆性的作用，通過(guò)開發(fā)植物內(nèi)生真菌的豐富資源，可以提取到具有天然抗菌特性的活性成分，探討內(nèi)生真菌的生理生態(tài)功能，為真菌源農(nóng)藥的研發(fā)開辟一條新路，從而推進(jìn)對(duì)這類真菌的深層次探索。

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