廣東省桐花樹葉尖枯病病原菌鑒定及拮抗細(xì)菌篩選

中圖分類號：S436.65 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2025）03-0139-12

桐花樹屬于紫金牛科 （Myrsinaceae）桐花樹屬（Aegicer），是常見的紅樹植物之一[1]。2000 年一2017年間我國紅樹林面積由約2.2萬 hm² 增長至3.4萬 hm^2[2-3] 。桐花樹是近年人工恢復(fù)紅樹林面積的主要栽種樹種之一。

目前，已報道且有癥狀描述的桐花樹病害有12種，分別是桐花樹葉斑病，已鑒定的病原為鏈格孢屬（AIternariasp.）、茄葡霉柄菌（Stemphyliumsolani）和菌核青霉（Penicilliumsclerotiorum）。

不同病原菌引起的葉斑病癥狀不相同。茄葡霉柄菌引起的葉斑病，初期葉片上出現(xiàn)圓形或近圓形帶有明顯黃色暈圈的黃褐色小斑，隨后病斑逐漸擴(kuò)大成近圓形或橢圓形大斑，嚴(yán)重的可擴(kuò)展整個葉片，后期病葉枯黃、掉落[4；菌核青霉引起的葉斑病癥狀為小而多的凹陷病斑，病斑周圍無暈圈[5。桐花樹灰斑病，病原菌為互隔交鏈孢（AIternariaalternate），受害葉片癥狀表現(xiàn)為黃色小點(diǎn)，病斑慢慢擴(kuò)大后呈圓形、橢圓形至不規(guī)則狀，病斑的顏色為褐色，后期多個病斑連片，造成整個葉片枯死掉落。桐花樹赤斑病，病原菌為棒狀擬盤多毛孢（Neop.clavispora），受害葉片主要癥狀為發(fā)病初期病斑為紅褐色，近圓形或不規(guī)則形小點(diǎn)，嚴(yán)重時，病斑融合成大病斑，使整個葉片成棕褐色、干枯凋亡。桐花樹煤污病，受害葉片主要癥狀為，發(fā)病初期是黑色的點(diǎn)狀物，慢慢的點(diǎn)狀物逐漸擴(kuò)展成圓形或不規(guī)則形菌斑，隨著菌斑的不斷擴(kuò)展，菌斑也逐漸變厚，在葉片上分布有一個或多個菌斑，病害發(fā)展到后期，整張葉片都被菌斑覆蓋，已鑒定的病原菌有，番荔枝煤炱菌[8]（Capnodiumanona）、杜莖山星盾炱（Asterinamaesae）、盾殼霉屬（Coniothyriumsp.）、散播煙霉（Fumagovagans）、球孢枝孢（Gladosporiumsphaerospermum）、蜒曲煙孢菌（Leptoxyphiumfumago）、火紅頭孢枝頂孢（Acremoniumrutilum）和柑橘灰色疣孢菌（Zasmidiumcitrigriseum）[6]

近年來，在廣東湛江紅樹林自然保護(hù)區(qū)，發(fā)現(xiàn)部分桐花樹葉片邊緣焦枯，局部林地發(fā)病株率平均為 51% （ n=100 ），病株發(fā)病葉片率平均為 38.4% 。在已經(jīng)報道的桐花樹葉部病害中，未見類似癥狀。為有效控制該病害的危害，明確病原菌種類是十分必要的。因此，本研究通過形態(tài)特征、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析以及致病性測定，明確在湛江市引起桐花樹葉片邊緣焦枯的致病因子，并進(jìn)行病原菌生物學(xué)特性研究和拮抗菌篩選，以期為該病害防治提供參考依據(jù)。

材料與方法

1.1 供試材料

桐花樹葉尖枯病樣品取自廣東省湛江紅樹林保護(hù)區(qū)（ 109.76^°E～114.93^°E ， 22.72^°N～22.76^°N ）。致病性測定所用桐花樹1年生植株均自珠海紅樹林苗木公司。生物學(xué)特性研究供試菌株-THJK1A3為本研究分離純化所得。生防菌平板拮抗試驗(yàn)供試菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存：阿氏腸桿菌79（Enterobacterasburiae）、泛菌B1N2-1（Pantoeaanthophila）、鞘氨醇單胞菌T3（Sphingomonasmelonis）、米氏假單胞菌T1（Pseudomonasoryzihabitans）。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院真菌研究室舒燦偉博士惠贈了解淀粉芽孢桿菌68（B.amyloliquefaciens）。

1.2 試驗(yàn)試劑

PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒（D205-01），Direct-Load StarMarker D2000（ M122-05），StarGreen核酸染料（E107-01）， 50× TAEDNAElectrophoresisBuffer（E102-50）購自北京康潤生物技術(shù)有限責(zé)任公司； 10% 次氯酸鈉、無水乙醇、 75% 乙醇購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；注射器、 NH₄NO₃ 、尿素、丙氨酸、賴氨酸、乳糖、瓊脂粉、培養(yǎng)皿等常用試劑及其他生物學(xué)試驗(yàn)耗材購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；本試驗(yàn)所用PCR擴(kuò)增引物合成和核酸測序由北京擎科生物科技有限公司完成。擴(kuò)增上下游引物序列如表1所示。根據(jù)《植病研究方法》[9]和《植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[10]制備試驗(yàn)所需培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 林間病害癥狀觀察和病樣采集 2019年5月一2023年5月，調(diào)查了廣東省湛江市和惠

州市等紅樹林保護(hù)區(qū)的桐花樹病害的發(fā)生狀況和癥 狀特點(diǎn)。對于特定病害的發(fā)病林，隨機(jī)選取100 株紅樹植物，統(tǒng)計(jì)發(fā)病株率和病葉率，觀察記錄葉

片上不同發(fā)病時期病斑的特點(diǎn)。采集典型的發(fā)病葉片，裝入采樣袋中，注明采集時間、采集地點(diǎn)、寄主名稱和采集人。

式中： γ 為發(fā)病株率， n 為發(fā)病植株數(shù)， N 為調(diào)查植株數(shù)。

式中： ψ 為病株病葉率，W為病株發(fā)病葉片數(shù)，W為發(fā)病植株總?cè)~片數(shù)。

1.3.2病原菌的分離與純化取典型病斑組織塊（ 5mm×5mm ）表面消毒后，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行組織分離與病原菌純化，并統(tǒng)計(jì)不同形態(tài)分離物的分離頻率。

1.3.3病原菌的致病性測定將分離純化后的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上， 28^°C 恒溫培養(yǎng)。使用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整分生孢子濃度在 10⁶ 個 ?mL^-1 。選取健康且生長一致的植株作為接種材料。接種時，使用浸有 75% 酒精的無菌脫脂棉球輕輕擦拭植株葉片后，用浸有滅菌水的無菌脫脂棉球擦洗3次，再使用滅菌接種針刺傷接種葉片。接種方法：吸取 5μL 的分生孢子懸浮液（ 10⁶ 個 ?mL^-1 ）接種于葉片刺傷點(diǎn)，以等量無菌水接種為對照。每個處理接種 5～6 個葉片，重復(fù)3次。接種期間觀察葉片的發(fā)病情況，對發(fā)病葉片拍照記錄。使用1.2.2中的織組分離法對發(fā)病葉片進(jìn)行再分離和鑒定，若分離得到的菌株與接種菌株一致即可確定為病原菌。1.3.4病原菌鑒定在 28^°C 黑暗培養(yǎng)，觀察菌落特征（菌落的顏色、質(zhì)地、高度、邊緣、表面紋飾、菌絲的疏密程度和氣生性），使用CanonPowerShotA640相機(jī)拍照記錄。待菌落產(chǎn)孢后，觀察分生孢子、分生孢子梗、產(chǎn)孢細(xì)胞和子囊等結(jié)構(gòu)，再隨機(jī)選取100個分生孢子測量孢子大小。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[12]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

使用ITS1/4，Bt2a/Bt2b和TEF1＼～728F/TEF1＼～986R共3對引物（引物序列見表1），擴(kuò)增桐花樹葉尖枯病病原菌菌株的ITS、TUB2和TEF1基因序列。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系均為 50μL ，其中 2x PCRMasterMix25μL、上下游引物各2μL、DNA模板2μL， ddH₂O 補(bǔ)足至 50μL ，PCR反應(yīng)程序見表2。對測序序列進(jìn)行同源性比較，使用TBtools3.0軟件下載同源性較高的模式菌株和已發(fā)表鑒定的菌株作為參考序列（表3）。使用MEGA.11中的ClustalW對序列進(jìn)行比對，使用Phylosuite.6中的Gblocks 和 Sequens concatenate 對序列進(jìn)行剪切和連接，利用MEGA.11軟件的尋找最優(yōu)模型，使用最大簡約法（Maximumparsimony）進(jìn)行1000次bootstrapes重復(fù)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹所用序列登錄號如表3。

1.4 菌落生長速率測定

以不同培養(yǎng)基、溫度、pH、光照、碳源和氮源為變量，將直徑為 5mm 的菌餅接種于供試培養(yǎng)基平板（ 9cm ）的中央，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，研究不同培養(yǎng)條件對代表菌株THJK1A3菌落生長速率的影響。供試培養(yǎng)基分別為查氏培養(yǎng)基（CA），玉米瓊脂培養(yǎng)基（CMM）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA）、水瓊脂培養(yǎng)基（WA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；供試溫度分別是5、10、15、20、25、28、30、35和 40^°C 共9個溫度梯度；用 1mol?L^-1 的NaCI和 1mol?L^-1 的NaOH調(diào)節(jié)pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、

11.0、12.0共9個梯度；光照條件設(shè)置全光照、全黑暗和光暗交替（ 12h 光照 112h 黑暗）3個處理；將查氏培養(yǎng)基中的蔗糖用等量替換的方法換成葡萄糖、山梨醇、甘露醇、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉或乳糖，制成不同碳源培養(yǎng)基，以不含碳源培養(yǎng)基作為對照；將查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉用等量替換的方法換成賴氨酸、甘氨酸、硝酸銨、蛋白陳、牛肉膏、酵母粉或尿素，制成不同氮源培養(yǎng)基，以不含氮源培養(yǎng)基作為對照。試驗(yàn)中除不同溫度對菌落生長速率的影響外，其余培養(yǎng)條件均為 25°C 、光暗交替（ 12h 光照 112h 黑暗）；除不同培養(yǎng)基和碳氮源對菌落生長速率的影響外，其余供試培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基。試驗(yàn)中接種所用菌塊直徑均為 5min ，每個處理重復(fù)3次。從第5d開始觀察培養(yǎng)基中菌落的生長情況，采用\"十字交叉法\"測量菌落平均直徑，直到對照長滿9cm培養(yǎng)皿結(jié)束，按照公式3計(jì)算其菌落生長速率：

式中， G 為菌落生長速率， D 為處理菌落直徑/cm， t 為培養(yǎng)時間/d。

1.5 生防細(xì)菌的篩選

將本課題組前期篩選到5株具有生防潛力的細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中 28^°C ，280rpm過夜培養(yǎng)。打取各病原菌菌餅（ 6mm ）接種于PDA培養(yǎng)基中央，在其四周 2.0cm 處滴 2μι 細(xì)菌菌液，以單獨(dú)接種病原菌為空白對照，在 28°C 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，待對照組長滿全血后，使用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算菌落平均生長直徑，并做好記錄[14]。拍照并記錄抑菌效果。每個處理4次重復(fù)。

式中： R 為菌落抑制率， d 為對照菌落直徑/cm， D 為處理菌落直徑/cm。

1.6 數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析方法

使用SPSSStatistics22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析（One-WayAnova）計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，采用鄧肯氏新復(fù)極差法（Duncan's newmultiple rangetest，DMRT）進(jìn)行多重比較，在 plt;0.05 水平上進(jìn)行分析處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 桐花樹葉尖枯病林間發(fā)病癥狀

桐花樹葉尖枯病發(fā)病株率平均為 51% （ n= 100），病株發(fā)病葉片率平均為 38.4% 。桐花樹葉尖枯病發(fā)病初期葉尖部褪綠，失水后變?yōu)榛液稚?，病健交界明顯，發(fā)病部位稍凹陷，焦枯變褐，后期病斑由尖部邊緣向葉面蔓延，葉片干枯卷曲，最終導(dǎo)致葉片脫落（圖1）。桐花樹葉尖部發(fā)病的癥狀未見報道。

2.2 桐花樹葉尖枯病病原菌分離與致病性測定

對桐花葉尖枯病典型發(fā)病葉片進(jìn)行組織分離，純化后獲得26個分離菌株，均為真菌。根據(jù)形態(tài)特征初步將其分為4類真菌，分別編號THJK1、THJK2、THJK3和THJK4。其中THJK1，分離頻率達(dá)到 80.76% ，為優(yōu)勢菌。

2.3 桐花樹葉尖枯病病原菌菌株THJK1A3形態(tài) 特征

28^°C 條件下該菌在PDA培養(yǎng)基上生長速度較快，3d即可長滿培養(yǎng)基，培養(yǎng)基正面氣生菌絲初期為白色（圖3a），隨后變成灰色（圖3c），背面初期白色（圖3b），隨后菌落中心變?yōu)楹谏▓D3d）。菌絲有隔，厚垣孢子鏈狀（圖3e＼～h）。該菌在SNA培養(yǎng)基、紫外誘導(dǎo)和SNA + 滅菌松針培養(yǎng)基等多種誘導(dǎo)條件下均不產(chǎn)孢，僅當(dāng)菌絲接種到桐花樹葉片上才觀察到分生孢子。分生孢子橢圓形至梭形，薄壁半透明（圖 31～m ），大小為（ 15.19～ 19.66） × （4.59＼～6.07） μm （ n=100 ）。根據(jù)形態(tài)特征初步將桐花樹葉尖枯病病原菌鑒定為新殼梭孢屬（Neofusicoccumsp.）。

2.4 桐花樹葉尖枯病病原菌分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

選取病原菌THJK1的3個菌株（THJK1A3、THJK1A9和THJK1A16）進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)鑒定，擴(kuò)增其ITS、TUB2和TEF1基因序列（圖4），并

注：該菌在SNA培養(yǎng)基，紫外誘導(dǎo)和SNA + 滅菌松針培養(yǎng)基等多種誘導(dǎo)條件下均不產(chǎn)孢，僅當(dāng)菌絲塊接到桐花樹葉片上才觀察到分生孢子；（a-b）PDA培養(yǎng)基 28^°C 培養(yǎng)3d菌落形態(tài)（a：菌落正面；b：菌落背面）；（ c～d ）PDA培養(yǎng)基 28‰ 培養(yǎng)5d菌落形態(tài)（c：菌落正面；d：菌落背面）；（ e～h ）厚垣孢子；（ i～m ）分生孢子；Scalebar =10μm

圖4桐花樹葉尖枯病病原菌各菌株的PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.4Electrophoresis of PCR amplification products of various strains of Aegiceras corniculatum leaf blight pathogen

將上述基因序列提交至NCBI，獲得Genbank登錄號（表3），同源性比對發(fā)現(xiàn)菌株THJK1A3、THJK1A9和THJK1A16擴(kuò)增的基因序列均與新殼梭孢菌的相似性最高，下載該屬模式菌株和已發(fā)表鑒定的23個菌株序列，以Botryospharriadothidea和B.corticis為外群，構(gòu)建ITS、TUB2和TEF1單基因和多基因聯(lián)合進(jìn)化樹。結(jié)果表明病原菌菌株THJK1A3、 THJK1A9和THJK1A16與N.ribis聚在同一個分支，節(jié)點(diǎn)自展支持率為99% （圖5）。根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，最終將桐花樹尖枯病病原菌鑒定為新殼梭孢菌（N.ribis）。

2.5 新殼梭孢菌生物學(xué)特性

2.5.1非營養(yǎng)因子對新殼梭孢菌生長的影響新殼梭孢菌可在 10～35°C 的環(huán)境中生長， 5°C 和40^°C 條件下菌絲不能生長。最適生長溫度為25°C 、 28°C 和 30°C ，菌落平均直徑分別為75.83±1.05mm 、 77.68±1.85mm 和 75.94± 1.97mm ，三者之間無顯著差異。其次是 20^°C ，菌落平均直徑為 69.08±8.85mm 。但該菌的適宜生長溫度范圍較窄，溫度低于 20°C 或高于 30^°C 時，菌絲生長顯著受到抑制（圖6a）。不同光照條件下菌絲生長速率無顯著差異（圖6b）。新殼梭孢菌對pH適應(yīng)范圍較廣，在pH值為 4～12 條件下均能正常生長，pH值為 4～11 時菌落平均直徑無顯著差異，pH值為4時，平均菌落直徑達(dá)到最大為 82.36±1.04mm ，pH值為12時菌絲生長顯著受到抑制，菌落平均直徑僅為 42.38±2.12mm （圖6c）。

2.5.2營養(yǎng)因子對新殼梭孢菌生長的影響在供試的8種不同碳源中，菌絲生長都較為稀疏。最適碳源為葡萄糖，平均菌落直徑為 63.75±5.16mm 其次為可溶性淀粉，平均菌落直徑為 58.15± 5.32mm （圖7a）。供試的7種不同氮源中，利用率最高的是硝酸銨和蛋白肺，平均菌落直徑為70.90±1.77mm 和 70.68±1.13mm ，二者之間無顯著差異，其次為賴氨酸，平均菌落直徑是66.68±3.38mm ，利用率最低的為含尿素的培養(yǎng)基，菌絲幾乎不生長（圖7b）。最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，菌落平均直徑為 82.35±0.96mm （圖7c）。

2.6 生防細(xì)菌對新殼梭孢菌的抑制效果

本文對課題組前期篩選的5株具有生防潛力細(xì)菌進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)（圖8）。在 28^°C ，培養(yǎng)2d后，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌菌株68對菌株THJK1A3的菌絲生長抑制率達(dá)到 68.71%±2.56% （表4）。

3 討論

3.1 桐花樹葉尖枯病癥狀

桐花樹葉部病害多為葉片中央出現(xiàn)病斑，本文發(fā)現(xiàn)的桐花樹葉尖枯病癥狀為葉尖邊緣焦枯變褐，這一癥狀尚未有學(xué)者報道。為探究其發(fā)病原因，我們首先是現(xiàn)場挖根，根部生長正常，未發(fā)現(xiàn)壞死現(xiàn)象；然后考慮到可能是缺水引起，可是桐花

3.2 新殼梭孢菌的鑒定及其所引起的植物病害

在桐花樹葉尖枯病病原菌株THJK1A3的形態(tài)學(xué)鑒定中，本文嘗試了SNA培養(yǎng)基、紫外光照射和 SNA+ 滅菌松針培養(yǎng)基等誘導(dǎo)桐花樹尖枯病病原菌產(chǎn)孢，都只觀察到厚垣孢子，并未觀察到分生孢子。當(dāng)把該菌接到桐花樹葉片上，可以觀察到分生孢子。根據(jù)病原菌的菌落和孢子形態(tài)，鑒定為新

殼梭孢屬。在此基礎(chǔ)上，選用ITS、TUB2和TEF1基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，將桐花樹葉尖枯病病原菌鑒定為新殼梭孢菌。

新殼梭孢菌是一種重要的植物病原真菌，主要引起熱帶和亞熱作物葉片病害。在馬來西亞，新殼梭孢菌可引起橡膠葉枯病[15-16]，引起蘋果和草莓采后儲藏腐爛和藍(lán)莓莖枯病[17-18]，在國內(nèi)有報道可引起楊樹潰瘍病[19]。本文中新殼梭孢菌引起的桐花樹葉尖枯病為國內(nèi)外首次報道。

對新殼梭孢菌的生物學(xué)特性研究目前暫未見報道，因此該屬代表菌種小新殼梭孢菌（Neofusicoccumparvum）進(jìn)行比較分析。本研究中該菌的的最適生長溫度為 25～30^°C ，這與多位學(xué)者分別分離自核桃枝枯病、裂葉喜林芋葉斑病和油桐黑斑病的小新殼梭孢菌的研究結(jié)果一致[20-22]，但是本文中的新殼梭孢菌在溫度低于20^°C 和高于 30^°C 時顯著抑制菌絲生長，這與以上學(xué)者研究結(jié)果不同，可能是本文中的新殼梭孢菌寄主在海邊，晝夜溫差小，而導(dǎo)致該菌的適宜生長溫度范圍較窄。本文中新殼梭孢菌對pH適應(yīng)范圍較廣，最適pH值為 4～11 ，這與吳松等[23]分離自樟樹潰瘍病的小新殼梭孢最適pH為7結(jié)果不同，這可能是由于本文中新殼梭孢菌的寄主植物生長在長期水淹狀態(tài)下，會產(chǎn)生硫酸根離子導(dǎo)致周圍環(huán)境偏酸性[24]

3.3 生防菌的篩選

隨著人們生態(tài)意識的增強(qiáng)，急需開展對紅樹植物病害的生物防治制劑。解淀粉芽孢桿菌分布于土壤和植物組織中，生長繁殖快，且具有芽孢結(jié)構(gòu)可以適應(yīng)各種極端環(huán)境，廣泛應(yīng)用于防治病原菌、動物生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等[25-26]。已有報道解淀粉芽孢桿菌對西瓜枯萎病、棗黑斑病和黃瓜灰霉病等多種病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用[27-29]，但對紅樹植物病害的防治未見學(xué)者報道。本文通過對課題組前期分離的5株具有生防潛力的細(xì)菌進(jìn)行平板拮抗試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌菌株68對從紅樹植物葉部病害分離的新殼梭孢菌抑制率是 68.71%±2.56% 68解淀粉芽孢桿菌菌株具有防治紅樹植物病害的優(yōu)良生防菌潛力。但該菌在紅樹植物中的定殖和林間防治效果仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4結(jié)論

首次報道新殼梭孢菌（Neofusicoccumribis）是引起廣東省湛江市桐花樹葉尖枯病的致病菌。該菌最適生長溫度 25～30°C ，對pH適應(yīng)范圍較廣，在PDA培養(yǎng)基、碳源為蔗糖和可溶性淀粉、氮源為牛肉膏和酵母粉和黑暗條件下有利于菌絲生長。首次發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌68對菌株THJK1A3的拮抗效果較好。

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139.

ldentification of Neofusicoccum ribis Causing Leaf Tip Blight on Aegiceras corniculatum and Screening of Its Antagonistic Bacteria in Guangdong Province

YUAN Yong-qiang1， JI Wen-xia1，MI Ren-jun2， ZHOU Shun1，MA Hai-bin3，LIU Song-song1， LI Zhi-guang1，WANG Fu-sheng1， RAO Xue-qin1，WAQAR Ahmed'，WANG Xin-rong1 （1.CollegeofPlantProtection，South ChinaAgricultural UniversityGuangdongProvinceKeyLaboratoryofMicrobialSignals andDisease Control，Guangzhou510642，Guangdong，China;2.ForestryBureauofChenxiCounty，Huaihua419500， Hunan， China;3.Research Institute of Tropical Forestry， Chinese Academy of Forestry， Guangzhou510642，Guangdong，China）

Abstract： [Objective]To identify the pathogen causing tip blight on Aegiceras corniculatum in Zhanjiang City，Guangdong Province，China.Thestudyinvolveselucidatingthebiologicaland molecularcharacteristicsof thepathogenandscreening forantagonistic bacteria，aiming toprovideabasisfor diseasepreventionand control.[Methods] Isolationand purification of the pathogen were carried out using infected tissuesamplesand single spores.The isolated fungal strainswere identified throughmorphological observations and phylogenetic analysis of concatenated gene sequences， including ITS， TEF-1a and TUB2. Biologicalcharacteristicssuchasgrowthrate，colony diameter，and growth morphology indiferentenvironmental conditions wereassessed.Pathogenicitywasconfirmed byartificial inoculationondetached leaves ofA.corniculatum.Antagonistic bacteria were screened using dual cultureassays to identifypotential candidates for controlling leaf tip blight.[[Results]The isolated fungi displayed rapid growth on PDA medium at 28^°C ，fully covering the Petri dish within3 days.The aerial mycelium initially appeared whiteamd later turnedgray，while theunderside transitioned fromwhite toa black center.Microscopic observationrevealedseptate hyphae forming thick-walled，sporechain-likestructures.Theconidiawereovaltospindleshaped， thin-walled，semi-transparent， and measured（ （15.19～19.66）×（4.59～6.07）μm（n=100） .Morphological characteristics and phylogenetic analysis identified the strain as N. ribis.Artificial inoculation with theisolatecaused symptoms identical to those observed innaturally infected leaves.The optimal growth temperature for the N. ribis strain THJK1A3 was 28^°C ，with a narrow growth range; hyphal growth was significantly inhibited below 20^°C or above 30^°C .The optimal pH condition was determined to be 4. Finally，Bacillusamyloliquefaciens 68demonstrateda 68.71±2.56% inhibition of the hyphal growth of strain THJK1A3，suggesting itspotential asa promising biocontrol agent for practical application.[Conclusion] Thecausative agent of tip blight inA.corniculatum in Zhanjiang City，Guangdong Province， China，was identifiedasN.ribisstrainTHJK1A3.AdditionalyB.amyloliquefaciens68demonstratedstrongantagonisticactivityagainstTHJK1A3，making ita promising candidate for the biological control of this disease.

Keywords：Aegiceras corniculatum tip blight; pathogen identification; phylogeneticanalysis; biologica control; antagonistic bacteria

（責(zé)任編輯：崔貝）