百山祖國家公園南方紅豆杉天然居群遺傳多樣性和交配系統(tǒng)分析

中圖分類號：S722.5 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2025）03-0051-09

錢江源-百山祖國家公園百山祖園區(qū)地處浙江龍泉、慶元和景寧三縣（市）交界處，是中國17個具有全球意義的生物多樣性保護重要地區(qū)之_[1-2]。百山祖園區(qū)內(nèi)擁有種類豐富的紅豆杉科（Taxaceae）植物，包括國家I級保護野生植物紅豆杉（Taxuswallichianavar.chinensis （Pilger）Florin）和南方紅豆杉（Taxuswallichianavar.mairei（Leméeamp; H.Lév.）L.K.Fuamp;Nan Li）[3]。根據(jù)《龍泉市第二次全國重點保護野生植物資源調(diào)查成果報告》（2015—2016），南方紅豆杉主要分布于鳳陽山及周圍較低海拔的山地或村落附近，其中百山祖國家公園核心區(qū)僅保有100余株。加強南方紅豆杉的遺傳保育和種群恢復迫在眉睫，也是錢江源-百山祖國家公園百山祖園區(qū)建設的重要內(nèi)容。

簡單重復序列（Simple sequencerepeat，SSR）是非常成熟的DNA分子遺傳標記技術(shù)，具有重復性高、穩(wěn)定性強、多態(tài)性豐富和共顯性強等特點，廣泛應用于植物遺傳研究中[4，目前已在紅豆杉屬植物如南方紅豆杉[5、東北紅豆杉（TaxuscuspidataSieboldamp;Zucc.）[的遺傳多樣性研究中廣泛應用。南方紅豆杉地理分布跨度較大，在我國主要集中分布于天目山西麓、大巴山南麓、武夷山脈和南嶺山等地[5。已有研究表明，南方紅豆杉天然居群維持較高的遺傳多樣性，居群間遺傳分化不明顯[5，7-8]。程蓓蓓[選取全國范圍內(nèi)5種紅豆杉屬（包括變種）典型分布區(qū)的植物樣本，發(fā)現(xiàn)紅豆杉屬植物居群內(nèi)的遺傳變異大于居群間的，而且整體具有較高水平的遺傳多樣性。雌雄異株的交配系統(tǒng)一直被認為其物種更易滅絕[10-11]。南方紅豆杉均為雌雄異株，異花授粉，其大、小孢子及雌雄配子體均發(fā)育正常[12]，但生殖周期較長且以雄配子體形式過冬，在冬季的異常氣候下雄配子很難恢復自身活力[13]。此外，人為干擾及生境片段化引起的居群變小、空間隔離加大導致生境片段化和島嶼化，這往往會引起嚴重的遺傳漂變、近交和有害突變積累增加，最終加劇物種滅絕[14]。生境片斷化可能會擾亂植物傳粉系統(tǒng)，干擾生殖機制的正常運轉(zhuǎn)，進而引起有效生殖能力的下降。同時，生境破碎化后山體和林分對小居群傳粉的阻斷增強，居群繁殖能力也會受到?jīng)_擊[15-17]

百山祖園區(qū)雖然擁有豐富的紅豆杉屬野生植物資源，但很多資源面臨植物競爭和極端氣候等多重威脅，對其遺傳多樣性及影響因子研究不足，會影響其科學的遺傳保育和利用，也會影響國家公園的原真性。本工作擬研究百山祖園區(qū)南方紅豆杉主要天然居群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，選擇關(guān)鍵居群研究其交配系統(tǒng)，以期闡明百山祖園區(qū)南方紅豆杉的瀕危原因，進而為適度人工干擾促進其居群恢復提供理論依據(jù)和技術(shù)指導。

材料和方法

1.1 材料來源及樣品采集

本研究主要分析位于浙江省龍泉市百山祖園區(qū)鳳陽山保護區(qū)及周邊村落的南方紅豆杉天然居群。

2022年11月，對南方紅豆杉天然居群成年母株或古樹采集新鮮葉片（圖1）。50株以下的天然居群，采集所有的成年母株或古樹葉片作為樣本；50 株以上的居群，則選取分布均勻，有一定間隔距離的50株葉片作為樣本。采集的5個天然居群共115個樣品（表1）。本研究選擇的5個天然居群ZJLQ1～ZJLQ5均分布在海拔 700m 以上，5個天然居群采樣地間隔 5000m 以上，地帶性植被為常綠及落葉闊葉林，居群內(nèi)主要伴生樹種為杉木（Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook）、甜赭（Castanopsis eyrei （Champ.） Tutch）、毛竹（Phyllostachys edulis（Carriére）J.Houzeau）、楓香（Liquidambarformosana Hance）等。

在ZJLQ2、ZJLQ3和ZJLQ4居群中分別選取5個南方紅豆杉母株單株采種用于居群遺傳交配系統(tǒng)分析。分單株采集的種子（即半同胞家系）經(jīng)兩冬一夏的濕沙層積處理于2023年春播種培育容器苗，2023年8月每個家系隨機選取30株幼苗用于遺傳交配系統(tǒng)分析（因ZJLQ4有1個母株僅有4株子代幼苗，數(shù)量不足故本研究不予考慮，ZJLQ4居群僅以4個母株為代表開展交配系統(tǒng)分析）。

1.2 DNA提取及PCR擴增

采用改良CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒（Aidlab，中國北京）進行南方紅豆杉新鮮葉片DNA的提取，具體步驟參照試劑盒說明書。利用超微量分光光度計（NanoDrop-2000，Thermo，美國）檢測DNA樣品的濃度和純度。本研究在前人研究基礎上選用了12對條帶清晰、穩(wěn)定性較好和多態(tài)性強的SSR引物用于PCR擴增（S4、S5、S7、S10、S13、S14、S16、S17、S19、S20、S22和S23）[18-19]（表2）。PCR擴增體系和擴增程序參考羅芊芊[5的研究。采用全自動核酸蛋白分析儀（Qsep100，Bioptic，中國臺灣）進行檢測和基因分型[20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1遺傳多樣性分析利用Excel2016對數(shù)據(jù)進行記錄與分析。采用GenAlex6.5軟件[21]計算各SSR位點的遺傳參數(shù)及Cervus2.0軟件[22]獲得微衛(wèi)星位點的多態(tài)性信息含量（ P_lC ）和哈迪溫伯格平衡檢驗結(jié)果（HW）；運用軟件FSTAT2.9.3計算居群的近交系數(shù)（ F_is） 、HP-Rare1.1軟件計算等位基因豐富度（ A_R ）和私有等位基因豐富度（ （P_A） [23]

1.3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析利用Structure2.3.3軟件[24]對南方紅豆杉樣本進行分類，通過公式ΔK=m（1L（K+1）-2L（K）+L（K-1）∣）/s[L（K）] 計算△K值[25]，推測最佳聚類組群數(shù)目，確定群體遺傳結(jié)構(gòu)；利用Powermarker3.25軟件[26]和iTOL（https：//tol.embl.de/）[27]構(gòu)建 Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 交配系統(tǒng)分析 使用MLTR3.4軟件對南方紅豆杉交配系統(tǒng)參數(shù)進行估算[28]。在系統(tǒng)中采用最大期望值法，經(jīng)過1000次重復取樣，對多位點異交率 （t_m） 、單位點異交率 （t_s） 、雙親近交系數(shù)（ C_tm-ts） 、父本多位點相關(guān)性（ ?r_p（m）） 、父本單位點相關(guān)性（ r_p（s） ）和有效花粉供體數(shù)（ N_ep=11 r_p（m） ）等參數(shù)進行估算。其中 C_tm-ts 是對雙親近交水平的估計，數(shù)值越大表明親本之間的親緣關(guān)系越近，父本相關(guān)性 （r_p） 則指的是兩個異交子代是全同胞的比例[29]

2 結(jié)果與分析

2.1 南方紅豆杉天然居群的遺傳多樣性分析

通過對12個多態(tài)性SSR位點進行遺傳參數(shù)分析（表3），發(fā)現(xiàn)12對引物的等位基因數(shù)（ N_a ）為 3～13 ，平均為6.23。所有位點的有效等位基因（ N_e ）數(shù)為 1.72～8.50 ，平均值為3.99。多態(tài)信息含量（ P_∣C ）為 0.45～0.93 ，平均值為0.71，表明SSR位點的多態(tài)性高。Shannon's多樣性指數(shù)（I）變幅為 0.67～2.21 ，平均值為1.35，近交系數(shù)（ F_is ）的變幅為 -0.60～1.00 ，平均值為0.62，且多數(shù)位點（除S10之外）的近交系數(shù)（ F_is ）大于0，表明SSR位點存在雜合子缺失。此外，各位點基因流（ N_m ）變幅為 0.70～6.71 ，平均值為2.75，表明整體的基因流處于高水平。

南方紅豆杉5個天然居群的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示（表4），平均等位基因數(shù)（ N_a ）為6.23，平均有效等位基因數(shù)（ N_e ）為3.99，平均觀測雜合度（ H_o ）和期望雜合度（ H_e ）分別為0.27和0.64.說明各居群的整體遺傳多樣性水平較高。其中 ZJLQ2的遺傳多樣性水平最高（ ， N_e= 5.22， H₀=0.27 ， H_e=0.71 ， 1=1.63 ， A₁₈=6.55 ， P_A= 0.81），ZJLQ1的遺傳多樣性水平最低（ ，N_e=2.77 ， H=0.22 ， H_e=0.51 ， /=1.01 ， A_R=4.25 ，P_A=0.87 ），ZJLQ4的遺傳多樣性水平與ZJLQ1相近，兩者的居群大小相近，遺傳多樣性較低可能與居群較小有關(guān)。5個天然居群的觀測雜合度（ H_o ）均小于期望雜合度（ H_e ）。近交系數(shù)（ F_is ）平均值為0.60，固定系數(shù)（ F ）平均值為0.62，均大于0，兩者綜合表明各居群內(nèi)存在近交現(xiàn)象，出現(xiàn)一定程度的雜合子缺失。

2.2 南方紅豆杉天然居群的遺傳結(jié)構(gòu)分析

115份南方紅豆杉天然居群樣本的最優(yōu)亞群數(shù)量如圖2所示：當 k=4 時， ΔK 最大，表明南方紅豆杉天然居群115份樣本被劃分為4個亞群。當k=4 時南方紅豆杉各亞群的樣本數(shù)量（圖2B）。

Structure聚類分析圖和Q值結(jié)果（表5）顯示亞群I包括25個樣本，主要來源于ZJLQ2、

ZJLQ3和ZJLQ5；亞群Ⅱ包括16個樣本，其中ZJLQ1的12個樣本均屬于亞群Ⅱ；亞群Ⅲ的南方紅豆杉46份樣本來自于除ZJLQ1外的其他4個天然居群，且ZJLQ3、ZJLQ4和ZJLQ5貢獻了86.96% 的樣本；亞群V中絕大多數(shù)樣本僅來源于ZJLQ2居群（ 82.14% ）。此外，4個亞群中 83.48% 的樣本 Q 值均大于0.8，這表明南方紅豆杉各居群的遺傳結(jié)構(gòu)較強，不同天然居群的南方紅豆杉間存在較小程度的基因滲人現(xiàn)象，世代間遺傳信息保守程度較高（表5）。

對115個樣本進行NJ進化樹分析（圖3），發(fā)現(xiàn)根據(jù)遺傳距離差異同樣將南方紅豆杉樣本分成4個亞群，與居群遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致，說明居群遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果是可靠的。

2.3 南方紅豆杉天然居群的交配系統(tǒng)

對南方紅豆杉ZJLQ2、ZJLQ3和ZJLQ4共3個天然居群的子代進行遺傳多樣性和交配系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)3個天然居群的子代均具有較高的遺傳多樣性水平，且高于親本的遺傳多樣性水平（表4、6），這為利用子代來擴大現(xiàn)有居群的方案提供了可能。對3個居群的遺傳交配系統(tǒng)參數(shù)進行估算（表7），結(jié)果表明3個居群的多位點異交率（ t_m ）均為1.00或趨近于1.00，平均單位點異交率（ t_s ）為0.92，平均雙親近交系數(shù)（ C_tm-ts） 為0.07±0.02，說明雙親間近交水平較低。rp（s）\"rp（m）為-0.26lt;0，表明父母本間不存在明顯的近親關(guān)系。此外，南方紅豆杉中有效花粉供體數(shù)（ ）僅為1.71，說明父本存在較高一致性，交配時父本來源有限。

3 討論

3.1 南方紅豆杉天然居群的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性可直接反映物種對環(huán)境的適應性及其改造潛力。南方紅豆杉是典型的風媒花傳粉針葉樹種，物種層面（ H_e=0.64 ）和居群層面（ H_o= 0.33， H_e=0.47 ）的遺傳多樣性均處于中等偏上水平[9，30]。在本研究中，利用12對SSR多態(tài)性引物分析發(fā)現(xiàn)百山祖國家公園5個南方紅豆杉天然居群同樣表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，這可能是因為南方紅豆杉在浙江省內(nèi)曾有廣泛分布，具有豐富的遺傳物質(zhì)基礎，即使經(jīng)歷了生境破壞和基因流受阻等生存危機，幸存的南方紅豆杉同樣保留了祖先居群的大部分遺傳變異[5，20]，使得其天然居群的遺傳多樣性一直處于較高水平。5個天然居群中ZJLQ2的遺傳多樣性水平最高（ ， N_e=5.22 ， H_o= 0.27， H_e=0.71 ， 1=1.63 ， A₁₈=6.55 ， P_A=0.81 ），ZJLQ2的樣本主要來源于周山頭村和庵邊村，該居群分布范圍最廣，樣本數(shù)量最多，可以最大限度地減少遺傳漂變和其他因素的影響[31]，以維持高水平的遺傳多樣性。

物種的遺傳多樣性越高，對環(huán)境變化的適應能力也就越強[32]。然而，生境片段化或島嶼化是南方紅豆杉目前面臨的主要問題，被地理環(huán)境隔離的天然小居群隨著繁殖世代推移，出現(xiàn)了更加明顯的遺傳漂變和近交衰退[13]，進而導致后代純合度的增加和雜合性的降低，減弱居群的繁殖和生存能力[33]。本研究中ZJLQ1僅有12個樣本，遺傳多樣性水平小于包含42個樣本的ZJLQ2，ZJLQ1小居群的生境片段化使得其居群內(nèi)樣本更容易出現(xiàn)近交和雜合子缺失，進而降低了遺傳多樣性水平。此外，南方紅豆杉為雌雄異株，雌雄花花期不完全同步，這引起花期相近的個體接受花粉的可選擇性較低，出現(xiàn)近交繁殖現(xiàn)象[34-35]。天然小居群近交繁殖多代后，居群內(nèi)個體親緣關(guān)系更近，最終導致個體不育甚至滅絕[13]

3.2 南方紅豆杉天然居群的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

Structure群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和NJ聚類分析可以直觀地反映出樣本間的遺傳背景和基因交流情況。本研究的Structure群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和聚類分析呈現(xiàn)出一致的結(jié)果，即南方紅豆杉115個樣本被清晰地分成4個亞群，其中亞群Ⅱ和亞群V的來源相對單一，幾乎全部樣本均來源于單一居群，其他兩個亞群并沒有表現(xiàn)出明顯的來源單一性（表5，圖3）。羅芊芊5在對5個省份南方紅豆杉的遺傳結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)18個居群被聚為4類，且聚類結(jié)果與天然居群的地理位置無顯著的相關(guān)性，這與本研究結(jié)果一致。本研究天然居群樣本均在海拔 700～1600m 的山中采集，高海拔復雜的地勢環(huán)境通?？梢酝ㄟ^抑制花粉和種子的傳播，進而對植物居群間的基因流動形成天然的地理障礙。早期南方紅豆杉分布面積廣泛，基因交流頻繁，后因人為干擾導致居群數(shù)量急劇減少，目前多呈斑塊狀分布。本研究選取的采樣點多分布于山區(qū)，一方面伴生樹種豐富，其果實會吸引鳥類，顯著提高南方紅豆杉種子的傳播效率[36；另一方面山區(qū)多湍急溪流，也會一定程度上擴大南方紅豆杉種子的傳播范圍[5，這些外界因素的影響導致部分亞群的聚類結(jié)果與地理距離呈現(xiàn)不一致性。

3.3 南方紅豆杉交配系統(tǒng)分析

交配系統(tǒng)可以控制配子體在親子代之間傳遞，被認為是影響植物居群遺傳結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素[37]。多位點異交率（ t_m ）和單位點異交率（ t_s ）之間的比較可以用來指示除自交外的近親交配。除自交外，單位點異交率（ t_s ）也會受到近親繁殖的影響。因此，當出現(xiàn)近親交配時，單位點異交率 （Δt_s） 會低于多位點異交率（ t_m ）[38]。南方紅豆杉天然居群的多位點異交率（ t_m=0.99 ）和單位點異交率（ t_s= 0.92）均處于較高水平，說明存在高度異交，近交指數(shù)（ C_tm-ts=0.07 ）說明雙親間僅存在較低的近交水平。3個南方紅豆杉居群間的異交水平無明顯差異，雌雄異株和異花授粉的特性是其高度異交的主要原因，但花期不遇導致的傳粉受精受阻也會對異交水平產(chǎn)生影響[28]。雖然南方紅豆杉以異交為主，但在漫長的進化過程中，雌雄生殖結(jié)構(gòu)可能會融合形成兩性植株[13]，因此也會存在極少數(shù)的雌雄同株或孤雌生殖的植株[34，39]，進而產(chǎn)生異交率的差異。

南方紅豆杉3個居群的父本相關(guān)性和有效花粉供體數(shù)（ N_ep ）差別較大，其中有效花粉供體數(shù)均小于2，說明在所分析的世代中，南方紅豆杉天然交配時父本來源有限，向后代有效提供花粉的父本不足，這可能與以下因素相關(guān)：（1）種子收集時當年開花的植物很少，且該物種的居群密度較低。開花植物少和居群密度低被認為與花粉多樣性降低密切相關(guān)；（2）母本采樣數(shù)量有限。由于每年結(jié)實的植株較少，本研究在每個居群內(nèi)僅選擇 4～5 個母本進行交配系統(tǒng)分析，這可能會導致有限數(shù)量的樣本之間的交配概率增加。（3）母本采樣位置的海拔高度及周邊父本的分布距離也可能會導致個別父本的授粉概率增加。

4結(jié)論

南方紅豆杉屬于高度異交樹種，本研究的5個天然居群的遺傳多樣性水平較高，遺傳變異豐富。5個天然居群聚類成4個亞群，但個體聚類結(jié)果與地理位置不具備一致性。ZJLQ2，ZJLQ3和ZJLQ4的子代遺傳多樣性和異交率均較高，存在近交現(xiàn)象但近交水平較低。因此，對于異交率高、遺傳多樣性豐富、子代遺傳多樣性保持較高的百山祖國家公園南方紅豆杉天然居群，應通過人促擴大居群進行有效的就地保護，保障現(xiàn)存種群的自然更新和擴張。

致謝：

感謝王斌副研究員和黃盛怡對本研究取樣和數(shù)據(jù)分析中提供的幫助，特此致謝！

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Genetic Diversity and Mating System Analysis of Taxus wallichiana var. mairei Natural Populations in Baishanzu National Park

CAO Sen1， JI Jing-yong2，SHENbin2，XIAO Ji-jun2，LIU Sheng-long3 LIULing-juan3，ZHOUZhi-chun1

（1.KeyLaboratoryofTreeBreeding，InstituteofSubtropicalForestry，ChineseAcademyofForestryHangzhou11400， Zhejiang，China;2.LongquanForestryResearch Insitute，Longquan323799，Zhejiang，China;3.LongquanPreserve Centerof Qianjiangyuan-Baishanzu National Park，Longquan323799，Zhejiang，China）

Abstract：[Objective]This study aims toaddressthe insuffcient researchon the genetic diversity of Taxus wallichiana var.mairei in the Baishanzu region， where the outcrossng level of parent plants remains unclear.By examining the genetic diversityand mating system，the studyseeks to elucidatethe genetic mating patterns and diversity diferences among various natural populations in Baishanzu.These finds wil provide foundationaldatafor further researchand scientificconservationeforts.[Methods]A totalof 115 individuals from five natural populations in Baishanzu National Park were analyzed using 12 pairs of SSR polymorphic primers toassess geneticdiversity，genetic structure，and mating system.[Results]Allpopulationsmaintained high genetic diversity，with ZJLQ2 showing the highest diversity.Inbreeding was indicatedbypositive F_is and F values.Genetic structure analysis revealed four subgroups without geographic consistency.High outcrossing rates （0.99）wereobserved，though parental relatednesssuggestedmoderate inbreeding （C_tm-ts=0.07） and limited effective pollen donors （N_ep）=1.71} ）.[Conclusion]T.wallichiana isa highlyoutcrossed species with rich genetic diversityacross populations.Efectiveinsitu conservation is recommendedtosupport natural regenerationandexpansion，providinga theoretical basisforunderstanding endangerment and informing conservation efforts.

Keywords： Taxus wallichiana; natural population; SSR; genetic diversity; mating system

（責任編輯：張研）