小麥條銹菌SNP分子標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S435、123 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-4330（2025）05-1219-07

0 引言

【研究意義】小麥?zhǔn)俏覈竺娣e種植的糧食作物之一，其病害防控效果直接影響小麥產(chǎn)量安全[1]。由條形柄銹菌小麥專化型Puccinia strifor-misf.sp.tritici引起的小麥條銹病是影響小麥產(chǎn)量的主要病害之一，傳播方向受氣流影響，最遠(yuǎn)可傳播 1700km ，借助降雨或晨露侵染小麥葉片，導(dǎo)致大規(guī)模的病害發(fā)生，流行年份可造成小麥 40% 的產(chǎn)量損失，甚至造成小麥絕收[2.3]。種植抗條銹病小麥品種是防控小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)有效的方法，但抗病品種的培育周期長、耗人力[4-5]。隨著小麥條銹菌新型致病小種的出現(xiàn)，一般抗病品種在3～5年就會(huì)喪失抗病性，導(dǎo)致條銹菌的大爆發(fā)[6]。因此，對小麥條銹菌群體進(jìn)行毒性鑒定、小種類型及遺傳結(jié)構(gòu)的研究尤為重要。通過對條銹菌流行區(qū)域進(jìn)行樣品采集，然后利用我國的19個(gè)鑒別寄主小麥品種對分離擴(kuò)繁后的菌株進(jìn)行生理小種鑒定，可以有效的明確流行區(qū)域條銹菌的流行小種的占比及毒性頻率，為抗病品種的選育與品種布局提供依據(jù)[7]。但是鑒別寄主實(shí)驗(yàn)的操作繁瑣、耗時(shí)長和室內(nèi)培養(yǎng)誤差大，且無法反應(yīng)條銹菌在田間的毒性、大區(qū)流行體系和遺傳結(jié)構(gòu)[8，利用分子標(biāo)記技術(shù)對條銹菌群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，可以快速揭示各群體之間的遺傳交流、群體分化及遺傳結(jié)構(gòu)差異。【前人研究進(jìn)展】隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（randomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單重復(fù)序列（simple sequencerepeat，

SSR）及單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（Single-NucleotidePolymorphism，SNP）等分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于小麥條銹菌的群體遺傳研究中[9]。早期的遺傳結(jié)構(gòu)研究中主要使用 PSR 探針[10]、 AFLP^[11] 及RAPD[12]分子標(biāo)記。隨著條銹菌高通量測序研究的普及，SSR分子標(biāo)記也隨之出現(xiàn)，擁有多態(tài)性高，數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，很快成為條銹菌群體遺傳分析的主要技術(shù)[13]。基于KASP 技術(shù)（kompetitive al-lelespecificPCR，KASP）的SNP標(biāo)記是一種新型的遺傳分析技術(shù)，擁有的多態(tài)性SNP位點(diǎn)遍及全基因組，可以快速，低成本的對SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型及遺傳分析。目前，僅有利用KASP-SNP技術(shù)對我國部分地區(qū)的小麥條銹菌群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行的研究[9，14]，現(xiàn)有的KASP－SNP引物較少，使用范圍存在局限性，針對不同地區(qū)的條銹菌群體需要重新篩選合適的KASP-SNP引物?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】SNP位點(diǎn)在全基因組上分布廣泛，可以從大量的SNP位點(diǎn)中挑選出多態(tài)性好，分布均勻的位點(diǎn)，并利用這些位點(diǎn)開發(fā)出高度特異性的KASP-SNP引物。該方法可以直接提取攜帶條銹菌的小麥葉片DNA進(jìn)行基因分型檢測，減少條銹菌分離、擴(kuò)繁等的步驟，降低試驗(yàn)時(shí)間及費(fèi)用。已有研究發(fā)現(xiàn)的KASP-SNP引物數(shù)量有限，無法滿足現(xiàn)有研究的需求?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選出多態(tài)性豐富及分布均勻的SNP位點(diǎn)，并開發(fā)成擴(kuò)增效果佳、特異性強(qiáng)的KASP-SNP引物，補(bǔ)充KASP技術(shù)在條銹菌遺傳分析研究的不足。

表1 采樣位置信息

Tab.1 Isolateslocationinformation

1 材料與方法

1.1材料

樣本：2023年5～7月從新疆伊犁河谷采集小麥條銹菌樣本，選取101個(gè)菌株進(jìn)行KASP-SNP基因分型試驗(yàn)。表1

設(shè)備：MatrixArrayer反應(yīng)板制備儀（成都瀚辰光翼）、MatrixCycler高通量水浴熱循環(huán)儀（成都瀚辰光翼）、MatrixScanner高速熒光掃描儀（瀚辰光翼）由新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果蔬研究所提供;NanoDrop610分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 小麥條銹菌KASP-SNP引物設(shè)計(jì)

Bai等以PST-78為參考基因組，對14個(gè)小麥條銹菌基因組進(jìn)行序列比對，篩選出209個(gè)SNP位點(diǎn)，用于小麥條銹菌致病基因的基因定位[15]。對209個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選，選取最小等位基因頻率 gt;0.4 、檢測率為 100% 、染色體上均勻分布的SNP位點(diǎn)，共篩選出40個(gè)SNP位點(diǎn)，使用IGV軟件查找40個(gè)SNP位點(diǎn)在PST-78小種基因組上的位置，并截取40個(gè)SNP位點(diǎn)的前后各 60bp 的序列，用在線網(wǎng)站（https：//www.primer3plus.com/）進(jìn)行KASP-SNP引物設(shè)計(jì)。

1.2.2 條銹菌基因組DNA提取及SNP基因分型

利用CTAB法提取小麥條銹菌基因組DNA^[16] ，將提取后晾干的 DNA 溶于 1×TE 緩存液，使用NanoDrop610分光光度計(jì)檢測DNA的濃度和質(zhì)量， 0D₂₆₀ nm/OD₂₈₀ nm介于 1.8～2.0 ，并稀釋至 50ng/μL 。每對引物96個(gè)反應(yīng)體系配置：2×KASP mix 170μL ;正向引物 F10.51μL ，正向引物 F2 0.51μL ，反向引物 1.36μL;96 個(gè)樣品的混合試劑量為 172.38μL ，將混合試劑均勻填加到96個(gè)反應(yīng)孔中后，再向每個(gè)反應(yīng)孔中加入DNA模板 1μL ；平均每個(gè)反應(yīng)體系為 2.8μL_? （2號(hào)PCR反應(yīng)程序： 95^°C 預(yù)變性 10min 95°C 變性20s， 61^°C （ -0.6C /循環(huán)）退火45s，10個(gè)循環(huán)；95^°C 變性 20s，55^qC 退火 ^45s，35 個(gè)循環(huán)。由瀚辰光翼的MatrixCycler高通量水浴熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.3 KASP-SNP引物多態(tài)性檢測及遺傳結(jié)構(gòu)

將101個(gè)條銹菌樣本的KASP-SNP基因分型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成二元基因型數(shù)據(jù)矩陣，使用POW-ERMARKER3.25軟件計(jì)算基因多樣性（Genedi-versity，GD）指數(shù)、多態(tài)性信息含量（Polymorphicinformationcontent，PIC）指數(shù)。為檢測所開發(fā)的KASP-SNP引物是否能夠進(jìn)行有效的遺傳結(jié)構(gòu)分析，利用過STRUCTURE2.3軟件實(shí)現(xiàn)，參數(shù)K的范圍為 2～10 ，經(jīng)過15次重復(fù)運(yùn)算后由STRUCTUREHARVESTER在線顯示其最佳數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 KASP-SNP分子標(biāo)記基因分型效果

研究表明，引物設(shè)計(jì)完成后在兩條上游引物的 5^′ 分布添加熒光標(biāo)簽，即F1：GAAGGTGAC-CAAGTTCATGCT（FAM接頭）和F2：GAAGGTCG-GAGTCAACGGATT（HEX接頭）。18對KASP-SNP引物對所選取的101個(gè)條銹菌基因分型。PS1-PS18引物均可以將不同的基因型顯著的區(qū)分開，其中大部引物可以檢測出2種基因型，PS5、PS8和PS12等可以檢測出3種基因型。所開發(fā)的KASP-SNP引物可以穩(wěn)定擴(kuò)增出SNP位點(diǎn)的不同基因型，可用于后期遺傳結(jié)構(gòu)的分析。圖1

圖118對KASP-SNP分子標(biāo)記引物的基因分型

Fig. 1 Genotyping of 18 pairs of KASP -SNP molecular marker primers

2.2 KASP-SNP分子標(biāo)記的多態(tài)性檢驗(yàn)

研究表明，基因多樣性指數(shù)在 0.174～0.469 5，其中SP16的基因多樣性指數(shù)最低，SP12的基因多樣性指數(shù)最高，平均值為0.3325。多態(tài)性含量指數(shù)為 0.162 4～0.359 3 ，同樣為SP16的多態(tài)性含量指數(shù)最低，SP12的多態(tài)性含量指數(shù)最高，平均值為0.2735。與SSR引物的多態(tài)性相比，設(shè)計(jì)的18對KASP-SNP分子標(biāo)記引物的多態(tài)性均高于SSR引物。表2

2.3 KASP-SNP分子標(biāo)記的遺傳結(jié)構(gòu)

研究表明，條銹菌的春麥群體與冬小麥群體在遺傳結(jié)構(gòu)上存在一定的差異。其中春小麥群體以綠色類群為主，而冬小麥群體中大部分為紅色類群。所開發(fā)的KASP-SNP分子標(biāo)記引物可以有效的區(qū)分小麥條銹菌群體之間的遺傳結(jié)構(gòu)差異。表3，圖2

表2 18對KASP-SNP分子標(biāo)記引物信息

Tab.2 Informationof18pairsofKASP-SNP

續(xù)表2 18對KASP-SNP分子標(biāo)記引物信息 Tab.2 Informationof18pairsofKASP-SNP

表318對KASP-SNP分子標(biāo)記引物多態(tài)性指數(shù)

Tab.3 Polymorphismindexof18pairsof KASP-SNPmolecularmarkerprimers

3討論

3.1小麥條銹菌是遠(yuǎn)距離傳播的氣傳病害，通過解析條銹菌的遺傳結(jié)構(gòu)、基因交流，有助于明確條銹菌的傳播路線和起源進(jìn)化[17]。目前條銹菌群體遺傳結(jié)構(gòu)研究的主流方法是通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)來完成，與SSR分子標(biāo)記技術(shù)相比，KASP-SNP分子標(biāo)記可通過條銹菌基因組上大量的SNP位點(diǎn)來開發(fā)，引物數(shù)量遠(yuǎn)高于SSR引物，并且可以篩選出高度特異性的引物，可直接從攜帶病菌的葉片上提取DNA進(jìn)行基因分型試驗(yàn)。

3.2通過對條銹菌進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，可以揭示各條銹菌群體間的遺傳差異，將各群體劃分為不同的類群。有研究通過SSR分子標(biāo)記對我國甘肅[18]、四川[19]、云南和貴州[20]等省的條銹菌進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，由于不同的小麥種植區(qū)用有不同的地形、氣候等環(huán)境條件，使得不同地區(qū)的條銹菌群體在遺傳結(jié)構(gòu)上存在一定差異。研究所開的18對KASP-SNP分子標(biāo)記引物對春小麥和冬小麥的條銹菌群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)春小麥和冬小麥的條銹菌群體在遺傳結(jié)構(gòu)上存在較大差異，能顯著劃分春小麥和冬小麥的條銹菌群體。

3.3孟巖等8開發(fā)了43對KASP-SNP分子標(biāo)記，并與13對SSR引物的多態(tài)性指數(shù)進(jìn)行對比，基因多樣性指數(shù)與多態(tài)性含量指數(shù)均高于SSR引物。將試驗(yàn)所開發(fā)的18對KASP-SNP引物與孟巖[8]研究中的13 對 SSR 引物就進(jìn)行比較，KASP-SNP引物的多態(tài)性指數(shù)也高于SSR引物。因此，遺傳結(jié)構(gòu)和引物多態(tài)性分析的結(jié)果一致表明所開發(fā)的KASP-SNP引物對遺傳結(jié)構(gòu)研究的有效性。使其能夠有效的對新疆小麥條銹菌群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)研究。

4結(jié)論

春小麥群體 冬小麥群體選取基因組上分布均勻、多態(tài)性豐富的SNP位點(diǎn)，并開發(fā)出18對分型效果佳、擴(kuò)增穩(wěn)定和多態(tài)性豐富的KASP-SNP引物，引物多態(tài)性指數(shù)和遺傳結(jié)構(gòu)檢驗(yàn)均能滿足小麥條銹菌的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析。

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Development of SNP molecular markers applied to genetic structure analysis of wheat stripe rust fungus

LAI Hailin1， LI Jin² ， SHEN Yuyang2，DE Feifei2， YANG Hong3，LI Guangkuo2，LI Yue1，GAO Haifeng2

（1. Xinjiang Key Laboratory for Ecological Adaptation and Evolution of Extreme Environment Biology， College of Life Sciences， Xinjiang Agricultural University，Urumqi 83Oo52，China; 2.Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crop in Northwestern Oasis ， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China; 3. Colege of Agronomy，Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China）

Abstract：【Objective】 This project aims to develop new KASP -SNP primers to reveal the diffrences in genetic structure among Puccinia striformis f.sp.trititc populations in diferent endemic regions.【Methods】 On the basis of existing SNP loci，we screened SNP loci with suballele frequency gt;0.4 and designed KASPSNP primers to analyze the genetic structure and primer polymorphisms of spring and winter wheat Pucinia striformis f.sp.trititc in the Ili River Valley.【Results】Eighteen pairs of KASP-SNP primers with stable amplification and obvious genotyping effect were finallyselected，there were certain geneticdiffrences between the spring and winter wheat stripe rust populations in the Ii River Valley，and the polymorphic information content index of the18 pairs of primers averaged O.273，5，and the gene diversity index averaged 0.332， 5，which was higher than the SSR average diversity index.【Conclusion】 The 18 pairs of KASP-SNP primers developed in this study are rich in polymorphism andcan be used to analyze the population genetic structure of Puccinia striformis f. sp. trititc.

Key words：wheat stripe rust； SNP molecular marker;genetic structure; KASP technique