2株蟲生真菌菌株的鑒定及對(duì)木毒蛾的致病力

DOI：10.12403/j.1001-1498.20240303

中圖分類號(hào)：S763.306.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2025）03-0151-11

木毒蛾（LymantriaxylinaSwinhoe）屬鱗翅目（Lepidoptera）毒蛾亞科（Lymantriinae）毒蛾屬（Lymantria），又稱木麻黃毒蛾、相思樹舞毒蛾、黑角舞毒蛾等[1，主要分布于福建、廣東、中國(guó)臺(tái)灣等地[2]。木毒蛾食性雜，寄主植物多樣。隨著20世紀(jì)70年代以來(lái)我國(guó)東南沿海防護(hù)林樹種木麻黃純林面積日益擴(kuò)大，木毒蛾逐漸轉(zhuǎn)移到木麻黃上進(jìn)行危害，其幼蟲取食木麻黃小枝，輕則影響林木正常生長(zhǎng)，重則導(dǎo)致整株甚至成片林木枯死，嚴(yán)重影響木麻黃防護(hù)林的生態(tài)效益[3]。目前木毒蛾的防治主要以化學(xué)防治和病毒制劑為主[4-5]。由于化學(xué)農(nóng)藥施用容易導(dǎo)致木毒蛾抗藥性增加、藥性殘留和環(huán)境污染等問題，而病毒的應(yīng)用需要活體培養(yǎng)，毒源有限，為此，探索新的防治資源已成為生產(chǎn)上的迫切需求。蟲生真菌作為一種生物殺蟲劑在自然界中廣泛存在，具有應(yīng)用期長(zhǎng)、寄主范圍廣、害蟲不易產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境友好型等優(yōu)點(diǎn)[7-8]，在農(nóng)林害蟲生物防治中扮演著重要角色。目前世界上已記載的蟲生真菌資源涵蓋了100屬1000余種，在我國(guó)已報(bào)道的多達(dá)40屬400余種[9]，其中較早被人們發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)的真菌類殺蟲劑有白僵菌（Beauveria）和綠僵菌（Metarhizium）[10]，一些學(xué)者也曾嘗試將其用于木毒蛾的防治，并獲得了一定的成效[11]。然而，長(zhǎng)期使用單一的殺菌資源可能會(huì)導(dǎo)致木毒蛾種群中產(chǎn)生抗性基因，減少殺菌劑的有效性。因此，持續(xù)探索潛在蟲生真菌資源對(duì)我國(guó)沿海防護(hù)林害蟲生物防治和維持生態(tài)平衡具有重要意義。

環(huán)鏈蟲草（Cordycepscateniannulata），亦稱環(huán)鏈棒束孢（Isariacateniannulata）或環(huán)鏈擬青霉（Paecilomycescateniannulatus）[12]，因早期的真菌分類鑒定多基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)描述，致其分類地位一直存在較大爭(zhēng)議[13]。環(huán)鏈蟲草最初被歸屬于擬青霉屬（Penicillium）[14]，直至2005年Luangsa-Ard等[15]通過運(yùn)用rDNA-ITS和 β -tubulin基因進(jìn)行分析將其重新劃歸棒束孢屬（Isaria）。近年來(lái)，隨著多基因系統(tǒng)進(jìn)化分析逐漸成為分類學(xué)研究的重要手段[16]，Sung等[17]運(yùn)用核糖體大小亞基（nrSSU和nrLSU）、轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子（TEF）、RNA聚合酶Ⅱ第一和第二亞基（RPB1和RPB2）等5個(gè)基因位點(diǎn)將蟲生真菌基本劃分為麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲草科（Cordycipitaceae）和線蟲草科（Ophiocordycipitaceae）3個(gè)科后，Kepler等[18]在此基礎(chǔ)上根據(jù)\"一菌一名”（One FungusOneName）原則又將部分棒束孢屬真菌重新組合至蟲草屬（Cordyceps）。至此，環(huán)鏈蟲草現(xiàn)歸屬于肉座菌目（Hypocreales）蟲草科蟲草屬。

環(huán)鏈蟲草寄主昆蟲范圍廣，其能在逆境中通過提高抗性基因的表達(dá)量以維持其良好生長(zhǎng)和較強(qiáng)的殺蟲活性[19-20]，是一種非常具有生防潛力的蟲生真菌[21]。早在80年代初，梁宗琦等[22]就從罹病的鞘翅目（Coleoptera）成蟲和褐帶長(zhǎng)卷蛾（Homonacoffearia）蛹繭上分離出環(huán)鏈蟲草。之后各國(guó)學(xué)者做了大量的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)鏈蟲草在防治松墨天牛（Monochamusalternatus）幼蟲[23]、小菜蛾（Plutellaxylostella）[24]、二斑葉螨（Tetranychusurticae）[25]、柑桔全爪螨（Panonychus citri）[26]、線蟲（Panagrellus redivivus）[27]、蚜蟲（Myzuspersicae）[28]、柳杉雷癭蚊（Resseliella odai）[29]和煙草粉斑螟（Ephestiaelutella）[30]等眾多農(nóng)林害蟲中表現(xiàn)出有較強(qiáng)的生防潛力，其分生孢子、菌絲提取物以及代謝過程中產(chǎn)生的酶類、毒素類及抗生素類等多種活性物質(zhì)對(duì)害蟲均具有顯著的殺傷效果[31-32]。研究還發(fā)現(xiàn)環(huán)鏈蟲草不僅是天然闊葉林和人工針葉林中蟲生真菌的優(yōu)勢(shì)種之一[33]，同時(shí)也廣泛分布于多種綜合性森林生態(tài)系統(tǒng)[34-35]。盡管前人已對(duì)環(huán)鏈蟲草進(jìn)行了較多的研究，但未見利用其來(lái)防治木毒蛾的報(bào)道。

鑒于此，本研究在鑒定出分離自橙帶藍(lán)尺蛾（Milioniabasalis）蛹的2株蟲生真菌為環(huán)鏈蟲草的基礎(chǔ)上，采用噴霧接種法測(cè)定環(huán)鏈蟲草對(duì)3齡木毒蛾幼蟲的致病力，并對(duì)其液體發(fā)酵條件進(jìn)行了初步的優(yōu)化，以期為利用環(huán)鏈蟲草防治林業(yè)害蟲提供理論依據(jù)，為木毒蛾綜合防控和化學(xué)農(nóng)藥減量減施提供綠色環(huán)保的生態(tài)防控策略。

材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx：于2023年5月，在福建省泉州市惠安縣赤湖林場(chǎng)木麻黃植株上采集木毒蛾幼蟲，將幼蟲放入養(yǎng)蟲盒（半徑為 4cm ，高度為 15cm 10頭·盒-1）內(nèi)，置于溫度 25±1°C ，相對(duì)濕度為80%±5% 的條件下并用新鮮木麻黃枝葉飼養(yǎng)直到化蛹、羽化、產(chǎn)卵。待卵孵化后，用木麻黃嫩葉喂養(yǎng)，挑選健康的、大小基本一致的3齡幼蟲用于室內(nèi)致病力測(cè)定。

供試菌株：菌株CcQZ-02、CcQZ-03分離自橙帶藍(lán)尺蛾蛹，采集地為福建泉州，經(jīng)分離純化后，目前將其保存于森林保護(hù)研究所。

儀器和試劑：SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱，江蘇正基儀器有限公司；RXM-258A智能人工氣候箱，寧波江南儀器廠；OSE-GP-03梯度PCR儀，天根生化科技（北京）有限公司；QuantStudioTM6Flex水平電泳槽，北京市六一儀器廠；AxioScopeA1生物顯微鏡，德國(guó)卡爾蔡司公司。真菌DNA抽提試劑盒（HPFungalDNAKit，OMEGA），廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司； 2x EasyTaq PCRSuperMix，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；瓊脂糖，北京擎科生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：蒸餾水 1000mL 、葡萄糖 20g 、馬鈴薯 200g 、瓊脂 15 9 ；察氏液體培養(yǎng)基： NaNO₃ （204號(hào) 3g 、 FeSO₄0.01g 、KCI 0.5g 、 07H₂OO.5g 、蔗糖 30g 、蒸餾水 1000mL ；合成低營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基： KH₂PO₄0.2g 、 KCl0.2g 、KNO₃ 1g、 MgSO₄?7H₂O 0.5g 、葡萄糖 0.2g 、蒸餾水 1000mL ；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基：蛋白陳 10g 、葡萄糖 40g 、蒸餾水 1000mL ；碳源：蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油；氮源：硝酸鈉、酵母浸膏、蛋白肺、蠶蛹粉、牛肉浸膏。以上培養(yǎng)基的pH值均控制在7.0，高壓滅菌鍋 121°C 滅菌 15min 。

1.2 方法

1.2.1菌株形態(tài)學(xué)及觀察鑒定將供試菌株采用點(diǎn)接法[3接種至PDA平板中央，每處理重復(fù)6次，封口后置于溫度為 25±1°C 、相對(duì)濕度為80%±5% 的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，定期觀察記錄菌落顏色、形態(tài)、菌絲疏密程度等形態(tài)特征。14d后挑取少量菌絲制成玻片并在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、孢子梗及分生孢子等形態(tài)，參照梁宗琦的檢索表進(jìn)行菌株的初步鑒定[37]

1.2.2菌株的分子鑒定將待鑒定的菌株接種于PDA平板上，于 25±1°C 、相對(duì)濕度為 80%±5% 的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)14d后挑取菌絲塊，加液氮進(jìn)行充分研磨，參照李煥宇等[38CTAB法提取菌株的總DNA。以基因組DNA為模板，利用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/ITS4（ 5^′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3^′ ）[39]、LR5（5'-ATCCTGAGGGAAACTTC- 3^′ ）/LR0R（5'-GTACCCGCTGAACTTAAGC-3'）[40]、EF1-526F（5'-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT- .3^′ ）/EF1-1567R（5-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3'）[41]分別擴(kuò)增rDNA-ITS、LSU和EF1-α的序列，所有使用引物均委托上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（ 50μL） ：上下游引物（ 10μmol?L^-1 ）各1μL、DNA模板2μL、 2× EasyTaq PCR SuperMix 25 μL、dd H₂O21 μL。反應(yīng)條件： 94°C 預(yù)變性 3min ； 94°C 變性30s ， 55°C （ITS序列） 149° （LSU序列） / 54^°C （TEF序列）退火 30s ， 72^°C 延伸 45s ，共35個(gè)循環(huán)；最后 72^°C 延伸 10min ， 4% 保存[42]。反應(yīng)產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所獲得的序列在NCBI中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，從GenBank下載同源性較高的ITS、LSU和TEF基因序列（表1）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。通過PhyloSuite軟件中ConcatenateSequence選項(xiàng)將3個(gè)單基因序列合并成1個(gè)基因序列，應(yīng)用MEGAX以最大似然法（MaximumLikelihood，ML）[43]構(gòu)建多基因聯(lián)合進(jìn)化樹，booststrap檢驗(yàn)值 ≥50% ，1000次重復(fù)，分析其分類地位。

1.2.3菌株的產(chǎn)孢和生長(zhǎng)速率測(cè)定將PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)的菌，用滅菌牙簽挑取直徑為

5min 打孔器打取的菌絲塊接種至新的PDA培養(yǎng)基中央，置于 25±1°C 、相對(duì)濕度為 80%±5% 的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，每隔1d采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每處理重復(fù)6次，連續(xù)測(cè)定 15d 。15d后采用直徑為 13mm 的打孔器獲取菌塊，放置于裝有 10mL0.05% Tween-80溶液的三角瓶中，充分振蕩后采用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子數(shù)，計(jì)算產(chǎn)孢量，每菌株重復(fù)3次。

式中，SR為菌株產(chǎn)孢量/（個(gè) cm^-2 ），TSC為孢子總數(shù)，DR為稀釋倍數(shù)，PA為打孔器面積[44]

1.2.4菌株對(duì)木毒蛾的致病力測(cè)定 將PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)14d后的CcQZ-02、CcQZ-03菌株分生孢子用接種環(huán)刮至 100mL 的三角瓶中，加入 10mL 0.05% Tween-80溶液，采用磁力攪拌器攪拌20min ，確保孢子完全分散均勻后，通過雙層無(wú)菌紗布進(jìn)行過濾，將純孢子懸浮液采用血球計(jì)數(shù)板在電子顯微鏡下計(jì)數(shù)，并記錄初始濃度，將不同菌株孢子液分別配制成 1.0×10⁸ 孢子 mL^-1 的終濃度。采用噴霧法將孢子懸浮液均勻噴至木毒蛾幼蟲上，以 0.05% Tween-80溶液為對(duì)照，轉(zhuǎn)至養(yǎng)蟲盒中以新鮮木麻黃葉喂養(yǎng)，每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)10頭幼蟲。每天定時(shí)觀察并記錄昆蟲死亡情況，連續(xù)觀察15d，計(jì)算累計(jì)死亡率、累計(jì)校正死亡率。1.2.5菌株的液體發(fā)酵條件優(yōu)化培養(yǎng)基：將配制好的察氏、沙氏葡萄糖和合成低營(yíng)養(yǎng)的液體培養(yǎng)基裝入 20mL 的三角瓶中，每瓶接入 1mL 的孢子懸液（濃度為 1×10⁷ 孢子 ?_mL^-1 ），每處理重復(fù)3次。置于 25±1°C 恒溫?fù)u床內(nèi) 150rpm?min^-1 振蕩培養(yǎng) 120h ，培養(yǎng)后的菌絲懸液真空抽濾，于65^°C 烘箱烘干至質(zhì)量恒定，用電子天平稱量，計(jì)算菌絲干質(zhì)量[45]

碳氮源：以察氏液體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用等質(zhì)量含碳量5種碳源（蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和甘油）分別替換其中的蔗糖成分，等質(zhì)量含氮量5種氮源（硝酸鈉、酵母浸膏、蛋白肺、蠶蛹粉、牛肉浸膏）分別替換其中的硝酸鈉成分。將 1mL 的孢子懸液（濃度為 1×10⁷ 孢子 ?mL^-1 ）分別接種至含不同碳源和氮源的液體培養(yǎng)基中，每處理重復(fù)3次，方法參照培養(yǎng)基測(cè)定碳氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016、SPSS 22.0 和 Graphpadprism9.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及圖表制作；采用單因素和Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析和多重比較（ a=0.05 ；采用Probit方法計(jì)算半數(shù)致死時(shí)間 LT₅₀ 值及相應(yīng)的致病力回歸方程，計(jì)算公式如下：

式中 r_d 為累計(jì)死亡率， N_d 為處理死亡總蟲口數(shù)， N 為處理總蟲口數(shù)， r_ad 為累計(jì)校正死亡率，r_dt 為處理組累計(jì)死亡率， r_dck 為對(duì)照組累計(jì)亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)鏈蟲草CcQZ-02和CcQZ-03菌株形態(tài)學(xué)描述及分子鑒定

2.1.1形態(tài)學(xué)鑒定將2株菌株置于PDA培養(yǎng)基 25±1°C 、相對(duì)濕度為 80%±5% 的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)14d后，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察（圖1），2菌株均在培養(yǎng)6d后開始產(chǎn)孢。CcQZ-02菌株菌落為致密絨毛狀圓形，正面白色，背面淡黃色，匍匐于培養(yǎng)基上，邊緣扁平規(guī)則，中心凹陷；菌絲有分隔、分支，呈長(zhǎng)管狀排列緊密；分生孢子梗上單生或聚集成束（2～4個(gè)分支），瓶梗基部呈橢圓形膨大（2. 0～4.3）μm×（1.0-3.2）μm ，其上部逐漸變細(xì)長(zhǎng) （2.5～3.8）μm×（0.5～1.1）μm ；分生孢子光滑、透明、圓形或橢圓形 （1.6-3.1）μm× （1.3-2.2）upmum ，呈環(huán)狀排列。CcQZ-03菌株菌落為絨狀圓形，正反面均為白色，中間隆起，邊緣規(guī)則；菌絲與 C_CQZ-02 菌株相似；分生孢子梗（1～4個(gè)分支），瓶梗呈棒形或倒棒形 （2.1～9.8）μm× （1.2～2.3）μm ，頸部向上逐漸變細(xì) （1.9～3.7）μm× （0.3～1.0）μm ；分生孢子光滑、透明、橢圓形或梭形 （1.4～3.2） μμν∝（1.0～2.2）μm ，多排列成環(huán)狀鏈。

2.1.2分子鑒定系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示（圖2）：菌株CcQZ-02與 Cordycepscateniannulata HKAS102451聚類在同一個(gè)小的分支上，支持率達(dá)98% ；菌株CcQZ-03與C.cateniannulataHMAS287264和C.cateniannulataRCEF3440聚為同一分支，支持率為 97% 。綜合上述形態(tài)特征和rDNA-ITS、LSU及TEF序列分析結(jié)果，鑒定菌株CcQZ-02和CcQZ-03為環(huán)鏈蟲草。

2.2 環(huán)鏈蟲草CcQZ-02和CcQZ-03菌株的產(chǎn)孢和生長(zhǎng)速率測(cè)定

2株環(huán)鏈蟲草菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)孢情況（表2、圖3），菌株CcQZ-02和CcQZ-03在PDA平板培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速率分別為 3.36±0.01mm?d^-1 和 3.09±0.01mm?d^-1 ；培養(yǎng)15d時(shí)，菌株CcQZ-02的產(chǎn)孢量顯著高于菌株CcQZ-03，為 2.06× 10⁸ 個(gè) cm^-2 。

2.3 環(huán)鏈蟲草CcQZ-02和CcQZ-03菌株對(duì)木毒 蛾幼蟲的致病力

菌株CcQZ-02（圖4b＼～d）和CcQZ-03（圖4e＼～g）均能有效侵染木毒蛾幼蟲。接種后2d，木毒蛾幼蟲表現(xiàn)出行動(dòng)遲緩、進(jìn)食和糞便排泄減少的癥狀；接種后3d，木毒蛾幼蟲體表顏色發(fā)黑，開始出現(xiàn)少量死亡（圖4b、e）；接種后4d，木毒蛾幼蟲口器、足間以及節(jié)間膜等處長(zhǎng)出少量白色菌絲（圖4c、f）；接種后5d，木毒蛾幼蟲被菌絲包裹死亡（圖4d、g），并產(chǎn)生大量分生孢子。

2株環(huán)鏈蟲草菌株對(duì)木毒蛾幼蟲均表現(xiàn)出較高的致病性，且試蟲累計(jì)校正死亡率隨接種時(shí)間的推移而上升（圖5），CcQZ-02菌株對(duì)試蟲的致病力較 CcQZ-03 菌株強(qiáng)，15d后其校正累計(jì)死亡率為77.17%±1.41% ；2菌株處理的相關(guān)系數(shù)r值都在0.900以上，即試蟲死亡率和時(shí)間之間存在顯著

圖4木毒蛾幼蟲的侵染狀

Fig.4Infection of Lymantria xylina larvae

的線性關(guān)系（表3），經(jīng) 1.0×10⁸ 孢子 ?mL^-1 孢子懸浮液處理15d后，CcQZ-02和CcQZ-03菌株的半致死時(shí)間 LT₅₀ 分別為6.88d和 8.34d 。

2.4 環(huán)鏈蟲草CcQZ-02和CcQZ-03菌株的液體發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

2株環(huán)鏈蟲草菌株在3種液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 120h 后生長(zhǎng)差異顯著（ plt;0.05） （圖6）。其中，察氏液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最佳，CcQZ-02和CcQZ-03菌株菌絲干質(zhì)量分別為13.71和10.76mg?mL^-1 ，其次是沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，生長(zhǎng)最慢的是在合成低營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，顯然它不適合環(huán)鏈蟲草生長(zhǎng)。

（2）碳氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng) 120h 后，2株環(huán)鏈蟲草菌株在供試的5種碳源培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，存在顯著差異（ plt; 0.05）（圖7左）。除葡萄糖外，菌株CcQZ-02在其它碳源培養(yǎng)基中的菌絲干質(zhì)量均大于菌株

培養(yǎng) 120h 時(shí)，2株環(huán)鏈蟲草菌株對(duì)各種氮源的利用程度不同，存在顯著差異（ plt;0.05 ）（圖7右）。菌株 CcQZ-03 在不同氮源培養(yǎng)基中的菌絲干質(zhì)量均小于菌株CcQZ-02；在以牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基中，菌株CcQZ-02菌絲干質(zhì)量最大，為 14.88mg?mL^-1 ，其次是蠶蛹粉，以牛肉浸膏為氮源的顯著高于以硝酸鈉、酵母浸膏和蛋白陳為氮源的培養(yǎng)基；菌株 CcQZ-03 在以牛肉浸膏和酵母浸膏為氮源的培養(yǎng)基中菌絲干質(zhì)量顯著高于以蠶蛹粉、蛋白肺和硝酸鈉的為氮源的培養(yǎng)基，其中在以牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基中菌絲干質(zhì)量最大，為 9.83mg?mL^-1 0

3 討論

環(huán)鏈蟲草是蟲草屬中重要的蟲生病原真菌，其與常見種粉質(zhì)蟲草和玫煙色蟲草同屬于近緣種[46]早期種間區(qū)分主要基于它們的分生孢子、分生孢子梗以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征[47]。然而，僅憑傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征難以準(zhǔn)確區(qū)分眾多種下形態(tài)近似的變種和亞種子[13]，近年來(lái)，分子標(biāo)記鑒定法以其能夠快速、有效、精準(zhǔn)的鑒定病原真菌菌株而備受研究者青睞[17]。本研究對(duì)CcQZ-02和CcQZ-03菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其符合蟲草屬環(huán)鏈蟲草的特征，同時(shí)，為保證鑒定準(zhǔn)確性和可靠性，本研究進(jìn)一步對(duì)2株菌的rDNA-ITS、LSU和TEF序列進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)定，并通過結(jié)合這3種序列聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)菌株CcQZ-02、CcQZ-03均為環(huán)鏈蟲草。

環(huán)鏈蟲草作為一種廣泛使用的生物殺蟲劑，可以侵染多種害蟲[48]，在害蟲防治領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。已知環(huán)鏈蟲草對(duì)菜青蟲有較強(qiáng)的致病性[49]，其對(duì)煙粉虱和螨類等小型害蟲的致死率也較高[50-51]；許忠順等[52]采用浸漬法將環(huán)鏈蟲草菌株接種到斜紋夜蛾2齡幼蟲體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)幼蟲的致死率為 78.21% ，半致死時(shí)間 LT₅₀ 值為1.08d；王定鋒等[53]曾報(bào)道在 1.0×10⁸ 孢子 mL^-1 濃度下，環(huán)鏈蟲草菌株ICBS918對(duì)茶卷葉蛾幼蟲和茶小卷葉蛾幼蟲的累計(jì)校正死亡率均 100% LT₅₀ 值分別為3.25d和3.13d；韓燕峰等[54]在研究小菜蛾的生物防治時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種孢子濃度為 1× 10⁸ 孢子 ?mL^-1 的環(huán)鏈蟲草對(duì)小菜蛾幼蟲的致死率高達(dá) 100% 。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)木毒蛾幼蟲在接種1.0×10⁸ 孢子 ?_mL^-1 的CcQZ-02、CcQZ-03菌株14d后，其校正累計(jì)死亡率為 77.17%±1.41% 和 63.30%±12.71% ， LT₅₀ 值為6.88d和 8.34d 表明2株環(huán)鏈蟲草對(duì)木毒蛾具一定的致病力，但與已有研究相比，2菌株對(duì)3齡木毒蛾幼蟲的致病力相對(duì)較低，造成該差異的原因可能是環(huán)鏈蟲草的種類、菌株的寄主不同，也有可能與供試試蟲的蟲齡不同有關(guān)，即蟲齡越低，對(duì)致病菌的抵抗力越弱，防治效果越好[55]。本研究?jī)H是在室內(nèi)條件下測(cè)定的2株環(huán)鏈蟲草對(duì)木毒蛾幼蟲的致病力效果，如何開發(fā)出適合田間實(shí)際應(yīng)用的劑型以及配套的使用方法，以適應(yīng)復(fù)雜多變的沿海環(huán)境，仍是未來(lái)研究需要解決的問題。

液體發(fā)酵培養(yǎng)是多數(shù)絲狀真菌生物制劑生產(chǎn)的主要方法，該方法具生產(chǎn)周期短，污染低、高效率及低成本等特點(diǎn)[5]，為后續(xù)的固體發(fā)酵培養(yǎng)持續(xù)且穩(wěn)定地供應(yīng)大量的高質(zhì)量種子液[57]。Feng等[58]研究發(fā)現(xiàn)液體發(fā)酵培養(yǎng)能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的白僵菌菌絲體，后續(xù)進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)，其產(chǎn)孢量得到了顯著提高。大量研究表明，液體發(fā)酵條件對(duì)菌株生長(zhǎng)代謝速率影響顯著，優(yōu)化發(fā)酵過程中的營(yíng)養(yǎng)條件能夠提高菌株菌絲生物量[59-62]。本研究在篩選出適宜2株環(huán)鏈蟲草菌絲生長(zhǎng)的察氏液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了2菌株對(duì)不同碳氮源的利用情況，發(fā)現(xiàn)2菌株均在以淀粉為碳源、牛肉浸膏為氮源時(shí)菌絲干質(zhì)量最大，王超然[63]曾報(bào)道環(huán)鏈蟲草液體培養(yǎng)菌絲體生長(zhǎng)的最優(yōu)碳氮源為葡萄糖和酵母浸粉，這與本研究結(jié)果有差異，造成該差異原因可能與菌株間來(lái)源不同和豐富的遺傳變異性有關(guān)[64]。液體發(fā)酵效果不僅受到營(yíng)養(yǎng)因素影響，也與發(fā)酵的環(huán)境條件密切相關(guān)[45]。適宜的環(huán)境條件（pH值、溫度、光照等）是實(shí)現(xiàn)工廠化液態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵因素，因此，未來(lái)的工作將繼續(xù)探索這些環(huán)境因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，為后續(xù)生防菌劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

4結(jié)論

本研究鑒定出分離自橙帶藍(lán)尺蛾蛹的2株蟲生真菌均為環(huán)鏈蟲草。室內(nèi)生物測(cè)定結(jié)果表明，2菌株對(duì)木毒蛾幼蟲均具有較強(qiáng)的致病力；當(dāng)接種分生孢子濃度為 10⁸ 孢子： mL^-1 時(shí)，菌株CcQZ-02和CcQZ-03的致死中時(shí)間 LT₅₀ 分別為6.88d和8.34d 。液體發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明，以碳源為淀粉、氮源為牛肉浸膏的察氏液體培養(yǎng)基有利于2株環(huán)鏈蟲草菌株菌絲生長(zhǎng)。

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ldentification of Two Entomogenous Fungal Strains and Their Pathogenicity Against Lymantria xylina.

BAO Xiao-chun1， XU Qian- ?Ie¹ ， ZHAN Fang-fang2，LIU Dong-xiang1， DING Shan-shan1， ZHAO Yang1， LIN Yan3，LI Jian1， CAl Shou-ping2

（1.CollegeofForestry，F(xiàn)ujanAgricultureandForestryUniversityFuzhou5，China;2.FujanAcademyofFoetry Sciences，F(xiàn)ujian Provincial KeyLaboratory of Forest Cultivationand Processing and Utilizationof Forest Products，F(xiàn)uzhou 350012，China;3.Xinluo District Forestry Bureau，Xinluo364000，China）

Abstract：[Objective]Toclarifytheclassificationof two entomopathogenic fungi isolatedfromthe pupae of Milioniabasalisand their biocontrol potential against Lymantriaxylina，providingatheoretical basis for the biological control of the major pestsaffecting the coastal shelter forest tree species Casuarina equisetifolia. [Methods]This study determined the taxonomic status of two Cordyceps fungi through morphological characteristicsand rDNA-ITS，LSU，and TEF sequence analysis.Their pathogenicitytoL.xylina larvae was assessedusing bioassays，folowed bythe optimizationof liquid fermentation conditions for both fungal strains.[Results] Based on the morphological features，cultural characteristics，and phylogenetic analysis results，both fungal strainswereidentifiedasCordycepscateniannulata.Afterinoculatingnunmoth larvae with a spore suspension of 1.0×10⁸ spores/mL from strains CcQZ-02 and CcQZ-03 for 15 days， the cumulative corrected mortality rates were 77.17±1.41% and 63.30±12.71% ，respectively，with LT₅₀ values of6.88 days and 8.34 days.The growth of strains CcQZ-02 and CcQZ-03 on differentliquid culture media showed that the mycelial dry weight was the highest in Czapek's solution，which was 13.71mg?mL^-1 and 10.76mg?mL^-1 respectively.The second-best media was Sabouraud dextrose broth， followed by synthetic low-nutritionmedium.Among the tested carbonand nitrogensources，starchand beef extract were the mosteffective forboth strains.[Conclusion]Both C.cateniannulata strains exhibited significantpathogenicityagainstL.xylina larvae. Czapek medium，with starchas the carbonsource and beef extract as the nitrogensource isconducive to the growth of both strains'mycelia，indicating their potential as effctive biocontrol agents for furtherdevelopment.

Keywords：Cordyceps cateniannulata; Lymantria xylina; pathogenicity; liquid fermentation

（責(zé)任編輯：崔貝）