指狀青霉拮抗放線菌R2A-77的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

摘" 要：柑橘是我國優(yōu)勢水果產(chǎn)業(yè)，對推動鄉(xiāng)村振興具有重要意義。但柑橘表面存在許多自然孔口，在采后貯藏和運輸過程中極易受到病原菌的侵染而發(fā)生病害。其中，柑橘綠霉病是由指狀青霉（Penicillium digitatum）侵染而成，發(fā)病過程快，傳染性強，造成果實采收后品質(zhì)嚴重下降，給柑橘產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。本團隊以柑橘綠霉病病原菌為靶標菌，從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株的根部土壤中分離篩選出1株對柑橘綠霉病病原菌具有良好拮抗作用的放線菌R₂A-77，對菌株進行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定，采用生長速率法對靶標菌生長圈直徑判斷發(fā)酵液的抑菌活性，采用單因素和交叉組合試驗優(yōu)化菌株發(fā)酵條件，以提高發(fā)酵液抑菌活性。結(jié)果表明：放線菌R₂A-77初步鑒定為鏈霉菌屬（Streptomyces）；最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨35 g/L、蒸餾水1000 mL；最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵初始pH 7.0、發(fā)酵時間為6 d、接種量為3%、裝液量為150 mL/250 mL；放線菌R₂A-77發(fā)酵條件優(yōu)化后，其發(fā)酵液的抑菌活性比優(yōu)化前提高15%，抑菌率為98%。結(jié)果說明，放線菌R₂A-77對指狀青霉具有較好的拮抗效果，有較好的實際應(yīng)用前景，該研究結(jié)果為綠色防控柑橘綠霉病積累了資源，為后期規(guī)?；l(fā)酵以及生防菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：指狀青霉；鏈霉菌屬；分類鑒定；抑菌活性；發(fā)酵優(yōu)化中圖分類號：S436.66；S476.1 """""文獻標志碼：A

Identification and Optimization of Fermentation Conditions of Antagonistic Actinomycete R₂A-77 by Penicillium digitatum

HUANG Jili， LUO Dongcheng， CHEN Yuanling， TANG Shi， CHEN Zhenfeng， LIANG Jiazhen，YANG Chunmin， XIE Yuxuan^*

Guangzhou College of Technology and Business， Foshan， Guangdong 528135， China

Abstract： Citrus is a dominant fruit industry in China， which is of great significance for promoting rural revitalization. However， there are many natural pores on the surface of citrus fruits. During post-harvest storage and transportation， they are highly susceptible to infection by pathogens， leading to diseases. Among them， citrus green mold is caused by the infection of Penicillium digitatum. The disease progresses rapidly and is highly contagious， severely deteriorating the quality of fruits after harvest and causing huge economic losses to the citrus industry. Our research team targeted the pathogen of citrus green mold. An actinomycete strain， R₂A-77， which exhibits excellent antagonistic effects against the pathogen of citrus green mold， was isolated and screened from the rhizosphere soil of red-orange plants in the Jiuzhoujiang Red-orange Orchard in Lianjiang， Zhanjiangy， Guangdong. The strain was characterized through morphological observation， physiological and biochemical tests， and molecular biological identification. The antibacterial activity of the fermentation broth was determined by measuring the diameter of the growth inhibition zone of the target bacteria according to the growth rate method. Single-factor and cross-combination experiments were conducted to optimize the fermentation conditions of the strain， aiming to enhance the antibacterial activity of the fermentation broth. The results indicated that the actinomycete R₂A-77 was preliminarily identified as the genus Streptomyces. The optimal fermentation medium was sucrose 10 g/L， soybean peptone 35 g/L， and distilled water 1000 mL. The optimal fermentation conditions were as follows： initial pH of 7.0， fermentation time of 6 days， inoculum size of 3%， and liquid volume of 150 mL in a 250 mL flask. After optimization， the antibacterial activity of the fermentation broth of actinomycete R₂A-77 increased by 15% compared to that before optimization， with an antibacterial rate of 98%. The results suggest that actinomycete R₂A-77 has a good antagonistic effect against P. digitatum， demonstrating promising practical application prospects. It would accumulate resources for the green prevention and control of citrus green mold and lays a foundation for large-scale fermentation and the development of microbial agents in the future.

Keywords： Penicillium digitatum; Streptomyces; classification and identification; antimicrobial activity; fermentation optimization

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.08.017

放線菌是一類極具開發(fā)潛力的生物資源，在空氣、土壤以及水體中均可生存，且具有生長速度快和代謝產(chǎn)物多等特點，已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域^[1-2]。目前，利用生防放線菌與病原菌的競爭關(guān)系或拮抗作用來控制病害已成為研究熱點^[3-4]。已有研究表明，放線菌發(fā)酵液對辣椒白絹病菌（Sclerotium rolfsii）^[5]、山茶炭疽病菌（Colletotrichum camelliae）^[6]、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）^[7]等植物病原菌具有良好的抑菌活性。在公眾對食品安全關(guān)注度持續(xù)攀升的當下，利用生物手段防治農(nóng)作物病害，已成為農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域的關(guān)鍵研究課題^[8-9]。

指狀青霉（Penicillium digitatum）是一種壞死營養(yǎng)型的病原真菌，可通過果實表面的損傷入侵果實內(nèi)部組織，導(dǎo)致宿主細胞死亡，進而利用營養(yǎng)進行生長^[10]。柑橘在田間生長、采收及貯藏運輸過程中極易受到物理損傷而產(chǎn)生傷口^[11]，這為病原微生物的入侵創(chuàng)造了條件，最終導(dǎo)致果實腐爛，造成嚴重的經(jīng)濟損失。長期以來，國內(nèi)外對水果病害的防治主要依賴化學(xué)殺菌劑，但長期使用化學(xué)殺菌劑不僅會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性而降低防治效果，還會嚴重危害人體健康和環(huán)境^[12]。而生物防治法采用具有安全性、有效性、環(huán)保性和高經(jīng)濟效益優(yōu)勢的拮抗微生物，可實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn)^[13]。NAJMEH等^[14]從農(nóng)田土壤中分離出的110株鏈霉菌菌株對指狀青霉具有良好的抑制作用。林書華等^[15]揭示了鏈霉菌X33發(fā)酵提取物（SLFE）對柑橘綠霉病菌具有防治效果。本團隊從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株根部土壤中分離篩選出1株對指狀青霉具有較好拮抗活性的放線菌R₂A-77，本研究對該菌株進行鑒定以及發(fā)酵條件優(yōu)化，為廉江紅橙土壤微生物資源及活性物質(zhì)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 供試菌株和病原真菌 "從廣東省湛江市廉江九州江紅橙園紅橙植株根部土壤分離篩選出放線菌R₂A-77。指狀青霉由西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院曾凱芳教授惠贈。

1.1.2" 培養(yǎng)基" 菌株鑒定固體培養(yǎng)基：ISP系列培養(yǎng)基（ISP1～ISP7）^[16]、PDA培養(yǎng)基、R₂A培養(yǎng)基^[17]、GA培養(yǎng)基^[18]、改良G2培養(yǎng)基^[19]、MS培養(yǎng)基^[20]、NA培養(yǎng)基^[21]、黑色素培養(yǎng)基、硫化氫培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、牛奶凝固與胨化培養(yǎng)基^[22]。

菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基：ISP系列培養(yǎng)基（ISP1～ISP7）、PDA培養(yǎng)基、GA培養(yǎng)基、改良G2培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基。

生長培養(yǎng)基：改良G2培養(yǎng)基。

1.2" 方法

1.2.1" 菌株鑒定" （1）形態(tài)學(xué)觀察。將菌株劃線接種至ISP3固體培養(yǎng)基，28"℃條件培養(yǎng)5 d，用掃描電鏡觀察菌絲特征及孢子形態(tài)。

采用固體培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基見1.1.2）劃線接種菌株，在28"℃下培養(yǎng)10 d。在第3、5、7、10天采用平皿插片法和光學(xué)顯微鏡觀察菌株菌體形態(tài)，篩選出菌株最優(yōu)生長培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

（2）生理生化特征測定。參考文獻[22]中的方法對菌株的生理生化特性進行測定。測定內(nèi)容包括：最適溫度、最適鹽濃度、最適培育pH、過氧化氫酶的產(chǎn)生、黑色素/硫化氫的產(chǎn)生、明膠液化、牛奶凝固或胨化。

（3）16S rRNA基因序列測定與分析。將菌株送至北京擎科生物科技有限公司進行16S rRNA基因序列測定。測序結(jié)果與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選相似菌株。采用MEGA 11軟件進行鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育分析，設(shè)置1000次bootstrap評估拓撲結(jié)構(gòu)，構(gòu)建16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬。

1.2.2" 菌株抑菌能力測定" （1）菌種活化和制備種子液。菌種活化：將菌種接種至改良G2固體培養(yǎng)基中，于28"℃培養(yǎng)5 d。

制備種子液^[23]：將菌株接種至150"mL/250"mL的改良G2液體培養(yǎng)基中，于28"℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d。

（2）制備菌株無菌發(fā)酵液。將3%的種子液加入到150 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28"℃、180"r/min培養(yǎng)5"d。取發(fā)酵上清液，于10 000 r/min離心15 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾后得到無菌發(fā)酵濾液^[24]。

（3）發(fā)酵液抑菌活性測定。采用生長速率法^[25]測定菌株發(fā)酵液對靶標菌的抑菌活性。發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基按1∶10（V/V）制成平板。將8 mm靶標菌菌餅置于平板中央，于28"℃培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算平均值和抑菌率。抑菌率=[（對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/（對照病原菌菌落直徑–菌餅直徑）]× 100%^[26]。

1.2.3" 菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵條件優(yōu)化" （1）菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。將11種不同的液體培養(yǎng)基各100 mL分別添加至250 mL 錐形瓶中，然后加入種子液發(fā)酵，參照1.2.2-（3）的方法測定抑菌活性，篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)基作為后續(xù)試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

采用單因素試驗法，在篩選出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，以葡萄糖、大米、小米、玉米面、蔗糖、燕麥、麥芽糖、淀粉、乳糖、甘露醇作為碳源；以酸水解酪蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、硫酸銨、酵母膏、胰蛋白胨、大豆粉、魚蛋白胨、麥芽粉、蛋白胨作為氮源，參照1.2.2-（3）的方法測定抑菌活性，篩選出3種較好的氮源和碳源。

利用交叉組合試驗，將篩選出的3個碳源和3個氮源進行交叉組合，確定最優(yōu)的碳源和氮源組合，參照1.2.2-（3）的方法進行抑菌活性測定，得到最優(yōu)碳氮源組合。

以最優(yōu)碳氮源組合固定碳源或氮源，將氮源或碳源濃度分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，參照1.2.2-（3）的方法測定抑菌活性，確定最優(yōu)碳源、氮源濃度為最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

（2）菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化。在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基下，優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件。采用單因素試驗，分別選擇不同的發(fā)酵初始pH：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；不同的發(fā)酵時間：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d；不同的接種量：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；250 mL錐形搖瓶中不同的裝液量：75、100、125、150、175、200 mL^[27]。參照1.2.2-（3）的方法測定抑菌活性，確定最優(yōu)發(fā)酵初始pH、發(fā)酵時間、接種量和裝液量。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用IBM SPSS Statistics 27軟件進行顯著性分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 形態(tài)學(xué)觀察

在ISP3培養(yǎng)基上，放線菌R₂A-77單菌落形態(tài)呈圓形，氣生菌絲生長繁茂，產(chǎn)生密集孢子堆，菌落呈現(xiàn)灰棕色。通過掃描電鏡觀察可知，菌株菌絲眾多，孢子鏈伸展，形狀為長圓形（圖1）。

放線菌R₂A-77菌株在不同鑒定培養(yǎng)基上的生長存在明顯差異，其氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的生長狀況等方面均有差異，在ISP1、ISP2、ISP6、ISP7培養(yǎng)基上產(chǎn)生可溶性黃色色素，在ISP1、ISP3、R₂A、MS培養(yǎng)基上生長旺盛（表1）。

相較于其他培養(yǎng)基，放線菌R₂A-77菌株在MS培養(yǎng)基上的生長狀況較好（圖2），菌落顏色為灰白色，形狀為圓形，菌落易挑起，氣生菌絲呈灰白色，基內(nèi)菌絲呈乳黃色，無可溶性色素。因此，確定放線菌R₂A-77菌株的最適生長培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

2.2" 生理生化特征

放線菌R₂A-77菌株在37"℃時生長狀態(tài)最佳，低于19"℃和高于40"℃時菌株停止生長。NaCl的濃度為0%時，生長狀態(tài)最佳，培養(yǎng)4 d便有大量孢子覆蓋于菌落表面，形成表面干燥、凸起、灰白色的圓形菌落；NaCl濃度為0%～1%時菌株生長，2%時完全停止生長。菌株在pH為5.0～12.0時均能生長，且pH為5.0時菌落較大，產(chǎn)孢子豐富，生長狀況最佳。

放線菌R₂A-77菌株可使明膠液化，可產(chǎn)過氧化氫酶，但無法使牛奶凝固或胨化，同時也不產(chǎn)硫化氫和黑色素。

2.3 "16S rRNA基因測序結(jié)果

通過序列測定，放線菌R₂A-77菌株的16S rRNA基因長度為1446 bp，且完整性為99.8%。通過EzBioCloud平臺對放線菌R₂A-77菌株進行16S rRNA基因序列比對，與該菌株高度同源的菌株均來自鏈霉菌屬（Streptomyces）。其中，與放線菌R₂A-77最相似的菌株為S. salinarius SS06011，相似度為99.93%，其GenBank登錄號為LC430995。

基于16S rRNA基因序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹中（圖3），經(jīng)過1000次聚類，菌株與S. salinarius SS06011進化關(guān)系最近。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征檢測，結(jié)合16S rRNA序列測序與系統(tǒng)進化分析，確定放線菌R₂A-77為鏈霉菌（Streptomyces）。

2.4 "放線菌R₂A-77菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1" 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 "通過對11種不同的液體培養(yǎng)基發(fā)酵液進行抑菌活性測定（圖4），結(jié)果表明，放線菌R₂A-77菌株在不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中的抑菌活性具有一定差異，在MS培養(yǎng)基中的抑菌活性最優(yōu)，指狀青霉生長圈平均直徑為20.54"mm?；诖耍x定MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.4.2" 碳源" 以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別采用10種不同碳源進行抑菌活性測定（圖5）。結(jié)果表明，在以玉米面、蔗糖、淀粉為碳源發(fā)酵液中，指狀青霉生長圈平均直徑分別為16.58、16.37、16.79 mm，具有較強的抑菌活性，因此選用玉米面、蔗糖、淀粉作為進一步研究的碳源。

2.4.3" 氮源" 以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別采用10種不同氮源進行抑菌活性測定（圖6）。結(jié)果表明，以大豆蛋白胨、大豆粉、蛋白胨為氮源的發(fā)酵液中，指狀青霉生長圈平均直徑分別為11.20、22.10、24.24 mm，具有較強的抑菌活性，因此選用大豆蛋白胨、大豆粉、蛋白胨作為進一步研究的氮源。

2.4.4" 碳源與氮源組合" 根據(jù)篩選的氮源和碳源對放線菌R2A-77菌株進行交叉組合發(fā)酵培養(yǎng)（圖7）。結(jié)果表明，蔗糖+大豆蛋白胨組合的發(fā)酵液表現(xiàn)出最優(yōu)的抑菌活性，指狀青霉生長圈平均直徑為10.87 mm；蔗糖+大豆粉組合的抑菌活性次之，指狀青霉生長圈平均直徑為16.54"mm。因此確定蔗糖與大豆蛋白胨作為放線菌R2A-77菌株發(fā)酵的最優(yōu)氮源、碳源組合。

2.4.5" 碳源與氮源濃度 "基于最優(yōu)碳源、氮源組合，將碳源和氮源濃度分別設(shè)置為10個不同濃度梯度對放線菌R2A-77菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)（圖8）。結(jié)果表明，碳源濃度為10 g/L時，發(fā)酵液的抑菌活性最優(yōu)，指狀青霉的生長圈平均直徑為9.07"mm；氮源濃度為35"g/L時，發(fā)酵液的抑菌活性最優(yōu)，指狀青霉生長圈平均直徑為9.46"mm。因此碳源濃度選用10 g/L，氮源濃度選用35 g/L。

2.5" 放線菌R₂A-77菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1" pH" 指狀青霉生長圈隨發(fā)酵初始pH的增大呈先緩慢減小后增大的趨勢（圖9）。pH為7.0時，指狀青霉的生長圈最小，生長圈平均直徑為10.27 mm；發(fā)酵初始pH低于7.0時，菌圈呈現(xiàn)出

逐步擴張的態(tài)勢；而隨著pH不斷增大，指狀青霉的生長圈隨之增大。說明放線菌R₂A-77菌株在強酸或強堿條件下，并不適宜產(chǎn)生具有活性的物質(zhì)。因此，確定pH為7.0作為放線菌R₂A-77菌株發(fā)酵的最優(yōu)初始pH。

2.5.2" 發(fā)酵時間" 指狀青霉生長圈隨發(fā)酵時間的延長呈先下降后上升的趨勢（圖10）。發(fā)酵至第6天時指狀青霉生長圈最小，生長圈平均直徑為10.85"mm。故發(fā)酵時間選用6"d作為放線菌R₂A-77菌株的最優(yōu)發(fā)酵時間。

2.5.3" 接種量" 指狀青霉生長圈隨放線菌R₂A- 77接種量的增加呈先降后升的趨勢（圖11）。當接種量為3%時，指狀青霉的生長圈最小，生長圈平均直徑為10.75 mm；其他接種量均導(dǎo)致放線菌R₂A-77菌株的抑菌活性下降。在接種量逐漸增加的初期階段，放線菌R₂A-77菌株產(chǎn)生的代謝物含量隨之上升，使得抑菌活性逐漸增強；接種量大于3%，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)難以滿足過量細胞的需求，細胞活性成分的合成過程受到限制，最終導(dǎo)致抑菌活性降低。因此，確定3%作為放線菌R₂A-77菌株的最優(yōu)接種量。

2.5.4" 裝液量" 指狀青霉的生長圈隨裝液量的增加呈先降后升的趨勢（圖12）。當250 mL錐形瓶的裝液量為150 mL時，指狀青霉的生長圈最小，生長圈平均直徑為9.83"mm；在裝液量逐漸增加的初始階段，由于錐形瓶內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)隨之增多，為放線菌R₂A-77菌株提供了更豐富的原料，使其產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的能力增強，然而，隨著裝液量的進一步增加，錐形瓶內(nèi)的氣體空間被壓縮，氧氣含量逐漸減少難以滿足放線菌R₂A-77有氧呼吸的需求，當氧氣不足時，放線菌R₂A-77的生長與代謝活動受到抑制，進而影響其產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的能力。因此，確定放線菌R₂A-77菌株的最優(yōu)裝液量為150 mL/250 mL。

2.6" 驗證試驗

綜合以上優(yōu)化結(jié)果，以10"g/L蔗糖、35"g/L大豆蛋白胨、1000"mL蒸餾水的改良MS發(fā)酵培養(yǎng)基，以發(fā)酵初始pH為7.0，接種量為3%，裝

液量為150 mL/250 mL，發(fā)酵6 d，對發(fā)酵液的抑菌活性進行測定，結(jié)果表明，優(yōu)化后的發(fā)酵液抑菌率為98%，優(yōu)化前的抑菌率為83%。抑菌效果見圖13。

3" 討論

放線菌是一個豐富的微生物類群，已鑒定出至少有180個屬2000多個種^[28]。而放線菌合成抗生素物質(zhì)是人們關(guān)注的焦點之一，據(jù)研究統(tǒng)計，70%的抗生素來自放線菌，50%來自鏈霉菌^[29]。除了產(chǎn)生抗生素外，放線菌發(fā)酵產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)病蟲害防治及醫(yī)學(xué)抗真菌藥物研制方面也是重要材料^[30]。國內(nèi)外學(xué)者通過對多種鏈霉菌進行了深入研究。例如，王寧等^[31]通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征以及16S rRNA序列分析等手段成功鑒定出蘋果樹腐爛病生防菌株A144為婁徹氏鏈霉菌；蔣冬陽等^[32]篩選到對引起大豆根腐病的多種病原菌以及大豆白絹病菌、草莓灰霉病菌、稻瘟病菌等均有很好抑制作用的弗吉尼亞鏈霉菌IRHB 47；HAMED等^[33]從海洋沉積物中分離到1株對白色念珠菌ATCC 10231具有極強拮抗活性的放線菌菌株MK388207，經(jīng)鑒定，該菌株為鏈霉菌屬。而較少有關(guān)鏈霉菌防治指狀青霉的研究報道。本研究從廣東省湛江市廉江九洲江紅橙園紅橙植株的根部土壤中分離的放線菌R₂A-77屬鏈霉菌，對指狀青霉具有良好的抑制作用。

已有研究表明，優(yōu)化活性菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件可提升抑菌活性物質(zhì)的作用^[34-35]。劉一賢等^[36]通過研究表明，發(fā)酵培養(yǎng)鏈霉菌17-7菌株的最適合碳源為玉米粉10"g/L和葡萄糖10"g/L，最適氮源為大豆粉25 g/L和酵母粉2 g/L。劉芳等^[37]優(yōu)化的鏈霉菌SZF-179最適發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為麥芽糖15.86"g/L和土豆淀粉10.00"g/L，氮源為酵母膏8.15"g/L。由此可知，不同的鏈霉菌在發(fā)酵中會受碳源、氮源的種類及其濃度的影響。此外，適當?shù)陌l(fā)酵初始pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵裝液量和接種量能促進發(fā)酵活性物質(zhì)的產(chǎn)生^[38]。例如，對多種植物真菌具有拮抗作用的鏈霉菌FIM- B0711的最佳發(fā)酵條件：pH為7.0，接種量為3%，裝液量為30 mL/250 mL，發(fā)酵時間為96 h，在該發(fā)酵條件下發(fā)酵物產(chǎn)量提升了57.69%^[39]。高加索鏈霉菌（S. ciscaucasicus）SS9-1的最佳發(fā)酵條件：裝液量為150"mL，接種量為3%，pH為8.0，發(fā)酵時間為7 d，在該發(fā)酵條件下發(fā)酵物對番茄灰霉病的拮抗效果提高到98.43%^[40]。因此不同的鏈霉菌有不同的營養(yǎng)要求和發(fā)酵條件。本研究對放線菌R₂A-77菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件進行優(yōu)化。通過優(yōu)化，該菌株的抑菌率提升15%，抑菌率達到98%。

本研究的放線菌R₂A-77與前期研究的放線菌R₂A-15^[19]同屬于鏈霉菌，但是16S rRNA基因序列不同，通過在NCBI上進行blastn比對，發(fā)現(xiàn)2株菌的16S rRNA基因序列相似性僅為95.29%。在進化關(guān)系上，與放線菌R₂A-77最相似菌株為S. salinarius SS06011，與放線菌R₂A-15最相似菌株為S. virginiae NRRL ISP-5094。放線菌R₂A-15在MS培養(yǎng)基上形成的菌落較大，氣生菌絲呈粉色，基內(nèi)菌絲呈米黃色，表型特征明顯與放線菌R₂A-77不同。本研究采用生長速率法測定放線菌R₂A-77發(fā)酵液對靶標菌的抑菌活性，篩選獲得的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基僅含蔗糖、大豆蛋白胨和蒸餾水，而放線菌R₂A-15的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基包含玉米面、酸水解酪蛋白、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉和蒸餾水，表明放線菌R₂A-77的發(fā)酵培養(yǎng)基原料種類更簡單、成本更低廉。但在發(fā)酵條件上放線菌R₂A-15的發(fā)酵時間僅需37.54 h，搖瓶裝液量減少至100 mL/250 mL，因此其發(fā)酵效率更高。研究表明，放線菌R₂A-15和放線菌R₂A-77對指狀青霉均有較高的抑菌活性，因此，這2株放線菌均具有重要的的研究價值和應(yīng)用潛力。后續(xù)研究重點將聚焦于其發(fā)酵活性物質(zhì)的分離與鑒定。

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