杏鮑菇種質(zhì)資源評價及優(yōu)良雜交菌株選育

Evaluation of Pleurotus Eryngii germplasm resources and breeding of excellenthybrid strains

LIU Wenxin'， WANG Tiantian'， TANG Yuqin1，2，LIANG Yunjiang

1.Yanbni;

Abstract：ToanalyzethediversityofgermplasmresourcesofPleurotuseryngiistrains，thisstudyscrenedexcellent strainswithshortgrowthperiodandhighyieldasindustrialbreeding materials，imingtoprovidetheoreticalbasis forthe in-depth development of P. eryngii breeding technology.In thisstudy，34 strainsof P. eryngii（B1-B34） collected domestically were usedastestmaterials，andthesomaticcellincompatibilityexperiment，ISSRmolecularmarker tchnologyand agronomic trait evaluation werecomparedandanalyzed，and theexcellnthybridstrainswere selected.Theresults showed that the 34 strains of P. eryngii were rich in genetic variation，with a genetic similarity coeficient from O.73-0.97. When the genetic similarity coefficient was O.85，the 34 strains of P. eryngii could be classified into four categories. The agronomic traitsshowed thatthehighest total yield was B2，and thelowest yield was B7.Theshortest growth period was B1，which tookonly63days，while thelongest growth period wasB11，B14andB30，allofwhich took80days.Basedon the analysisof theaboveresults，theB2 strainwithhighyieldandhighbiologicaleficiencyand theB1strain withshort growthcyclewereselectedas hybrid breeding parents.Finally，theexcellent hybridstrainLX119 wasscreened，witha growth periodof 56 days and a yield of 762.14g?bag^-1

KeyWords：Pleurotus eryngi; ISSR analysis;Antagonistic reaction; Agronomic trait; Crossbreeding

杏鮑菇（Pleurotuseryngii）又名刺芹側(cè)耳，隸屬于側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus）。杏鮑菇最早起源于歐洲，因其肉質(zhì)肥厚如鮑魚，口感細(xì)膩，質(zhì)地脆嫩，富有嚼勁，是目前最受歡迎的蘑菇品種之一，在亞洲的部分地區(qū)被廣泛食用[4]。其子實體色澤雪白，質(zhì)地脆嫩，也稱“雪茸”，又有“平菇王”“干貝菇”“草原上的美味牛肝菌\"之美譽。杏鮑菇是一種藥食兩用的食用菌品種，具有宜人的香氣和良好的烹飪品質(zhì)，深受消費者歡迎。此外，杏鮑菇還含有大量的生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、膳食纖維等，均具有潛在的生物活性功能。據(jù)顏明娟等研究結(jié)果顯示，杏鮑菇干品中富含蛋白質(zhì)、還原糖、總糖、脂肪、游離氨基酸、甘露醇、水溶性成分以及水分等多種營養(yǎng)成分。具體來說，其蛋白質(zhì)含量高達 21.44% ，甘露醇和游離氨基酸含量也相當(dāng)豐富。與黑木耳、銀耳和香菇干品相比，杏鮑菇的灰分和蛋白質(zhì)含量更高，但脂肪和總糖含量則相對較低。此外，杏鮑菇中檢測到了17種氨基酸，其中8種是人體所必需的。在礦物質(zhì)元素方面，杏鮑菇同樣表現(xiàn)出色，每 100g 干菇中含有多種對人體有益的微量元素，杏鮑菇以其脆嫩爽滑的口感和豐富的營養(yǎng)價值贏得了消費者的廣泛喜愛，從而成為了市場上備受矚目、發(fā)展?jié)摿薮蟮氖秤镁贩N之一。

近年來，人工栽培杏鮑菇的農(nóng)戶及杏鮑菇工廠化生產(chǎn)企業(yè)日益增加，使杏鮑菇產(chǎn)業(yè)迅速增長。目前，國內(nèi)杏鮑菇栽培品種比較單一，僅有少數(shù)杏鮑菇工廠擁有自己的栽培品種[]。一般杏鮑菇是自然栽培的，農(nóng)戶用種比較混雜，容易出現(xiàn)同物異名、同名異物、品種亂用等問題，造成每年杏鮑菇的品質(zhì)和產(chǎn)量參差不齊，影響生產(chǎn)效益。此外，利用形態(tài)學(xué)方法進行比較和分類往往受環(huán)境等因素的影響而存在差異，而ISSR、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)因其能反映DNA水平遺傳多樣性，且受環(huán)境影響小，在食用菌遺傳分析中獲廣泛應(yīng)用。周紅艷對收集到的25個杏鮑菇菌株進行了農(nóng)藝性狀及菌絲體生長的研究，從中篩選到產(chǎn)量和生物學(xué)效率較高的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株，為杏鮑菇種質(zhì)資源的保護與研究提供了基礎(chǔ)依據(jù)；劉宇等[12]對9個杏鮑菇品種從菌絲生長速度、菌絲生長勢、生物學(xué)效率等方面進行了品比試驗，并從中篩選出菌絲生長速度較快、菌絲生長勢較強、子實體產(chǎn)量最高、子實體形態(tài)特征最好的栽培品種。陳珣等[13]、焦禾等[14]、鄧優(yōu)錦等[15]利用ISSR技術(shù)對金針菇、黑木耳、銀耳等食用菌進行了遺傳多樣性研究。楊和川等則應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了杏鮑菇生產(chǎn)菌株的DNA序列多態(tài)性，通過UPGMA平均分類法分析，將27個杏鮑菇生產(chǎn)性菌株在遺傳相似系數(shù)為0.87的水平上分為4類，這為杏鮑菇的雜交育種及親緣關(guān)系分析提供了理論基礎(chǔ)。

筆者以全國各地收集來的34個杏鮑菇品種為材料，采用體細(xì)胞不親和性、分子標(biāo)記技術(shù)及農(nóng)藝性狀的比較分析，在系統(tǒng)地對杏鮑菇菌株進行種質(zhì)資源的綜合評價的基礎(chǔ)上，篩選出具備優(yōu)秀開發(fā)潛力的優(yōu)良菌株以及優(yōu)勢互補的雜交親本菌株，作為育種試驗的材料。通過雜交育種，選育產(chǎn)量高、抗雜性強、生育周期短的雜交菌株，為杏鮑菇工廠化生產(chǎn)提供潛在具有經(jīng)濟價值的育種材料。

1材料與方法

1.1 試供菌株

供試杏鮑菇菌株B1～B34，均來自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食用菌實驗室。試驗于2022年7月至2023年12月在吉林益隆長白山實業(yè)有限公司進行。

1.2 主要儀器與試劑

主要試劑：瓊脂、葡萄糖、 10% 的KOH、 3% 的剛果紅、蛋白脈、酵母膏、乙醇、磷酸二氫鉀、硫酸鎂。

儀器設(shè)備：電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司BSA224S-CW）、滅菌鍋（博訊YXQ-100SII）、超凈工作臺（上海尚道儀器制造有限公司SW-CJ-IFD）、生化培養(yǎng)箱（上海秋佐科學(xué)儀器有限公司SPX-250）、微波爐（Midea公司M1-211D）。DNA提取FastDNASPINKitforSoilKit試劑盒（Invitrogen公司MF070-plus-01）、移液器（Eppen-dorf公司LR17113085）。

1.3 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基為馬鈴薯綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g 、葡萄糖 20g? 、瓊脂 20g 、蛋白脈 5g 、酵母膏 1g? 水1000mL ，于 121^°C 高壓滅菌 30min^[17] 號

三角搖瓶培養(yǎng)基配方：馬鈴薯 100g?L^?1， 酵母膏 2.5g?L^-1. 葡萄糖 20g?L^-1. 蛋白豚 1g?L^-1 、硫酸鎂0.75g?L^-1 、磷酸二氫鉀 0.75g?L^-1 ，于 121^°C 高壓滅菌 30min^[18] 0

栽培種培養(yǎng)基：木屑 42% 、玉米芯 38% 、麥麩10% 、豆粕 4.5% 、玉米粉 4.5% 、輕鈣 0.5% 、石膏0.5% ，含水量 60%～65% 。將裝好的栽培袋放入高壓滅菌鍋中滅菌 ^2h ，滅菌條件為 0.125MPa 、121^°C ，待栽培袋晾至室溫后接種[9]。

1.4體細(xì)胞不親和性試驗

將34株供試菌株于 24^°C 恒溫培養(yǎng)7d復(fù)壯。一個平板內(nèi)平均分布3個菌株，菌株間相聚 1～2cm 培養(yǎng)條件為 24^°C. 避光、7～10d，觀察不同菌株菌絲接觸部分是否有拮抗線并記錄，將拮抗結(jié)果的有（+）、無（-）進行統(tǒng)計2，每個處理均設(shè)置3次重復(fù)，下同。

1.5 ISSR分析方法

對34株杏鮑菇進行DNA提取，并進行PCR擴增，引物序列見表 1^[21] 。采用北京博友順生物技術(shù)有限公司的磁珠試劑盒提取。取 3μL DNA用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增體系（ 25μL） 為：DNA模板約 40ng ， 10× Bufer 2.5μL ，primer 0.3μmol?L^-1，4 種dNTPs各 0.25μmol?L^-1 MgCl₂1.5mmol?L^-1 ，TaqDNA聚合酶 1.25U 。PCR擴增程序為： 94^°C 預(yù)變性 5min ，然后進行35個循環(huán)： 94^°C 變性 45s，55～62^°C 復(fù)性45s， 72^°C 延伸 1.5min ；循環(huán)結(jié)束后 72^°C 延伸 保存。PCR結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在 2.0% 的瓊脂糖凝膠（電壓 120V 電泳 50min 檢測。PCR擴增產(chǎn)物的電泳在凝膠的某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。采用NTSYS軟件計算相似系數(shù)（DICE系數(shù)），并且按照遺傳系數(shù)進行UPGMA聚類分析[22]。用POPGENE32軟件對供試材料的遺傳多樣性指數(shù)進行分析。

表1ISSR引物及其序列 Table1 IsSR primer sequences

1.6農(nóng)藝性狀分析

1.6.1菌絲生長特性取培養(yǎng)好的適齡菌塊，接種于培養(yǎng)基中， 24^°C 恒溫培養(yǎng)，采用十字劃線法測量平板菌落的半徑，菌絲生長速度/ （mm?d^-1）= 菌落半徑/培養(yǎng)總時間[23]。

1.6.2子實體生長狀況測定 （1）測定栽培袋一潮菇所采收的子實體總產(chǎn)量，根據(jù)干料計算各菌株的生物學(xué)效率并取平均值。

（2）在不同菌株中隨機取樣每個重復(fù)中的3袋，觀察其個體形態(tài)特征，測量產(chǎn)量、菌蓋直徑、菌柄直徑等，不同菌株每個重復(fù)的試驗數(shù)據(jù)均為取樣數(shù)的平均值。

（3）出菇后測定產(chǎn)量和生物學(xué)效率。

生物學(xué)效率 1%= （子實體鮮質(zhì)量/培養(yǎng)料干質(zhì)量） ×100^[24] 。

1.7雜交菌株的選育

1.7.1孢子的收集根據(jù)綜合農(nóng)藝性狀的評價，篩選出優(yōu)良菌株進行雜交試驗。獲取杏鮑菇親本菌株的單孢和雙孢，進行單-單雜交和單-雙雜交，采用細(xì)胞學(xué)鑒定、生理特性鑒定相結(jié)合的方法鑒定雜交子的真實性，通過對菌絲特性、生育期、商品性狀及產(chǎn)量進行比較分析，最終選育出優(yōu)良的雜交杏鮑菇新菌株。

在無菌條件下，用接種針輕輕地刮取硫酸紙上收集的杏鮑菇孢子，放入 100mL 無菌水中，搖勻，制成孢子懸濁液，用移液器從中取出 1mL 孢子懸濁液加入 9mL 無菌水，如此反復(fù)稀釋，獲得 10^-2 、10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8 等7個濃度梯度的孢子稀釋液，分別將不同濃度的孢子稀釋液均勻涂布于準(zhǔn)備好的平板培養(yǎng)基上，密封后 24^°C 黑暗培養(yǎng)。每天觀察2次，當(dāng)培養(yǎng)基上的孢子萌發(fā)出現(xiàn)肉眼可見的菌落，立即挑取單菌落轉(zhuǎn)接于PDA小試管斜面上，編號后在 24^°C 培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)[25]。

1.7.2單核體分離配制 10% 的KOH和 3% 的剛果紅，先滴入1滴 10% 的KOH再滴入1滴 3% 的剛果紅到載玻片上，挑取收集的單菌落的菌絲，染色1min 后蓋上蓋玻片，用濾紙將周圍的染色液吸干，在光學(xué)顯微鏡下（物鏡 40× ，目鏡 10× 觀察菌絲鎖狀聯(lián)合的有無，拍攝并記錄[2。

1.7.3配制雜交組合將2個鑒定出的單核菌株接到培養(yǎng)血中，2菌種塊相距 2cm 左右， 24^°C 培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長滿培養(yǎng)血后，在超凈工作臺上挑取2單孢菌絲交界處的菌塊轉(zhuǎn)入平板培養(yǎng)基中，距接種塊 2cm 處傾斜的插入滅菌后的蓋玻片，待菌絲爬上蓋玻片后，用鑷子取出，用顯微鏡觀察菌絲有無鎖狀聯(lián)合，判斷雜交是否成功。如有鎖狀聯(lián)合，立即轉(zhuǎn)管，以備雜交子真實性的鑒定。

1.7.4雜交子真實性的鑒定將具有鎖狀聯(lián)合的雜交菌株與2親本接種于同一平板培養(yǎng)基中，各菌種塊之間相距 2cm 左右， 24^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待滿血后，觀察雜交子是否與兩親本接觸部位產(chǎn)生明顯的拮抗線。生理特性試驗是鑒定不同菌株體細(xì)胞是否親和的方法，拮抗線的產(chǎn)生表現(xiàn)菌株之間不同的遺傳特性。

1.7.5優(yōu)良雜交菌株的選育對鑒定的真實雜交子進行農(nóng)藝性狀評價分析，具體操作方法見1.6。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS27.0進行數(shù)據(jù)分析與處理，對產(chǎn)量和生育期進行方差分析，對農(nóng)藝性狀進行主成分分析，明確性狀之間的相關(guān)性和重要性，具體步驟參照姜婉竹等2的方法，利用Excel2016進行計算，所有數(shù)值均采用平均值表示，設(shè)置3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體細(xì)胞不親和性試驗

34株供試菌株的拮抗反應(yīng)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，菌株B16和B17、B18和B19、B24和B25之間無拮抗線產(chǎn)生，這表明這3對菌株的體細(xì)胞親和，親緣關(guān)系較近。但要確認(rèn)它們是否為同一菌株，還需要進一步通過其他評價方法進行驗證。其他28個菌株之間均有拮抗線產(chǎn)生，為不同品種的杏鮑菇菌株。

2.2 ISSR分析

通過12條引物擴增的ISSR聚類圖結(jié)果如圖1所示，其遺傳距離在0.70～1.00之間，在平均相似系數(shù)0.85處可將34個菌株杏鮑菇材料分為四大類群，說明供試菌株可能存在同物異名現(xiàn)象。其中，菌株B1、B2、B4、B5、B8、B9、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B19、B20、B21、B22、B24、B25、B26、B27、B28、B29、B30、B31、B32、B33、B34可聚為第一大類；菌株B11為第二類；菌株B3、B6、B7、B10、B12被聚為第三類；菌株B23被聚為第四類。通過觀察上述聚類分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律：來源于同一地區(qū)的菌株往往歸為同一類群。從河北地區(qū)引進的菌株B29、B30、B31、B32、B33、B34被歸為一類；同樣地，來自江蘇地區(qū)的B8、B14、B16、B19菌株也被歸為一類；此外，從貴州引進的B25、B26、B27菌株同樣屬于同一類群。這一規(guī)律表明，菌株的類群與其地理來源存在一定的關(guān)聯(lián)。綜合ISSR聚類分析及體細(xì)胞不親和性試驗結(jié)果可證明菌株B16和B17、B18和B19、B24和B25為同一菌株。

表2不同菌株菌絲間的拮抗作用

Table2Theantagonisticactionofdifferentstrainsonstockculture

注：“ + ”表示有拮抗現(xiàn)象，“一”表示無拮抗現(xiàn)象。Note：“ + ”indicatesantagonism，and“-”indicates no antagonism.

圖134個供試樣品的ISSR聚類分析 Fig.1ISSRclusteringanalysisof 34 tested samples

2.3 杏鮑菇農(nóng)藝性狀評價

2.3.1菌絲生長特性在杏鮑菇菌絲適宜的溫度24^°C 下，對34個杏鮑菇菌株進行菌絲生長速度和滿血時間的測定及菌絲生長勢和密度的比較，結(jié)果見表3，各菌株菌絲體平均生長速度在 0.568 7～ 0.8492cm?d^-1 ，不同菌株在菌絲生長速度上存在差異，B2、B3、B12、B23菌絲生長速度較快，滿皿時間短，均為10d，菌絲長勢強，較粗壯濃密，菌落整齊。B32菌絲生長速度最慢，滿皿時間為15d，但同一菌株在不同培養(yǎng)基中菌絲的生長速度及生長勢有所不同，所以B32能否作為栽培種需進一步觀察。2.3.2生育期評價由表4可知，各菌株的生育期差異較大，生育期為63～80d，其中菌株B1、B10、B12、B19、B24、B27、B34的滿袋時間、原基發(fā)生時間、子實體成熟時間相對較短，生育期低于65d，屬于早熟菌株；B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B13、B15、B16、B17、B18、B20、B21、B22、B23、B25、B26、B28、B29、B31、B33生育期為65～70d，屬于中熟菌株；B11、B14、B30、B32生育期大于70d，屬于晚熟菌株。除菌株B16、B24、B31均有污染情況的發(fā)生外，其他菌株均有較強的抗性。

2.3.3商品性狀評價對各供試菌株的商品性狀統(tǒng)計如表5～6所示，各菌株在子實體形態(tài)、菌蓋顏色、菌蓋直徑、菌柄直徑等商品性狀方面差異較大，遺傳性狀比較豐富。子實體總長在 10.60～21.42cm 菌蓋直徑在 3.13～7.52cm ；菌柄直徑在 3.21～5.46cm 子實體形態(tài)分為棒狀、近棒狀、保齡球形和近保齡球形；菌蓋顏色分為淺褐、褐、深褐。其中，菌株B1的商品性狀良好，B1的子實體總長、菌蓋直徑及菌柄直徑等指標(biāo)均明顯優(yōu)于其他菌株，子實體棒狀，菌蓋顏色褐色。杏鮑菇B2產(chǎn)量最高，每袋產(chǎn)量為745.01g ，生物學(xué)效率為 129.03% ，屬于高產(chǎn)型菌株；B5的產(chǎn)量僅次于B2，生物學(xué)效率為 122.71% ，而B7每袋產(chǎn)量最低，僅為 215.81g ，生物學(xué)效率為37.35% 。

2.3.4主成分分析杏鮑菇菌株間農(nóng)藝性狀差異性明顯，其中菌蓋直徑、子實體形態(tài)、菌柄直徑和菌蓋顏色等方面存在明顯差異。

主成分分析的結(jié)果表明，9個成分在提取值上呈現(xiàn)出很大的差異，這充分說明了各性狀在整體考量中的重要性并不相同。由表7可知，第1主成分的特征值為2.209，貢獻率高達 24.544% ；第2主成分特征值是1.610，貢獻率為 17.891% ；第3主成分特征值是1.319，貢獻率為 14.658% ；第4主成分特征值是1.140，貢獻率為 12.666% 。

Table3Mycelialgrowthofdifferentstrains

表3不同菌株菌絲生長情況

注： ++++ 代表粗壯、濃密； +++ 代表較粗壯、濃密； ⁺⁺ 代表菌絲稀疏、纖細(xì)。不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。下同。

Notes： ++++ issturdyandthick; ⁺⁺⁺ isrelativesturdyandthick; ⁺⁺ isthinandslender.Differentcapitallettersindicatesignificant differencesat O.O1level.Thesamebelow.

由圖2可知，最初的4個主成分的特征值變化較大，而之后的各個主成分特征值則相對固定。這一現(xiàn)象意味著前4個主成分在闡釋原始數(shù)據(jù)變量方面扮演了重要角色。因此，將這4個主成分作為分析的焦點是合適的。它們能夠有效地反映原始數(shù)據(jù)的主要特征和變動趨勢。

表4杏鮑菇生育期評價 Table 4 GrowthperiodevaluationofP.eryngii

由表7～8可知，第1主成分以 24.544% 的貢獻率位居首位，其中菌蓋直徑的特征向量值最高，代表杏鮑菇菌蓋大小的外觀形態(tài)，因此將該主成分命名為外觀形態(tài)構(gòu)成因子。第2主成分的貢獻率為17.891% ，略低于第1主成分，其特征向量值最大的是生育期，代表香鮑菇的出菇用時，命名為時間構(gòu)成因子。第3主成分貢獻率為 14.658% ，特征向量值最大的是子實體形態(tài)，代表杏鮑菇的子實體形態(tài)特征，稱為子實體形態(tài)構(gòu)成因子。第4主成分貢獻率為 12.666% ，特征向量值最大的性狀為菌絲長勢，雖規(guī)律性不明顯，但通過其貢獻率可見一斑。

Table5 Comparison ofcommoditytraitsofP.eryngii

表5杏鮑菇商品性狀比較

表6供試菌株產(chǎn)量

Table6Yieldoftestedstrains

Table7Total variance explainedbyprincipal componentanalysis

表8主成分載荷矩陣

圖2主成分分析碎石圖

Fig.2Screeplot of principal component analysis

綜上可知，9個性狀的提取值有很大差異，說明各性狀重要性不同，其中菌蓋直徑、生育期、子實體形態(tài)和菌絲長勢4個性狀的影響力較大。

2.4 優(yōu)良雜交菌株的選育

2.4.1雜交菌株生理特性鑒定收集兩親本B1和B2的孢子，并配置菌懸液。在濃度為 10^-5?10^-6?10^-7 /10^-8 的平板中挑出單核菌絲和雙核菌絲，菌株B1收集10個單核菌絲，菌株B2收集10個單核菌絲、6個雙核菌絲，通過單-單雜交和單-雙雜交共配制160個雜交組合。通過光學(xué)顯微鏡對160個雜交組合進行了詳細(xì)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這些組合中，有106個能夠在顯微鏡下清晰地觀察到鎖狀聯(lián)合。利用拮抗試驗檢測了選定的106個雜交菌株與其親本之間的體細(xì)胞不親和性。試驗結(jié)果見表9，有98個雜交組合分別與兩親本發(fā)生拮抗反應(yīng)，即出現(xiàn)3條拮抗線，體細(xì)胞不親和，為生理特性不同的菌株。其他8個雜交菌株均不發(fā)生拮抗反應(yīng)，體細(xì)胞親和，為生理特性相同的菌株。

表7主成分分析解釋的總方差表

Table8 Principal component loading matrix

2.4.2雜交菌株菌絲生長特性在杏鮑菇菌絲適宜的溫度 24^°C 溫度條件下，對98個雜交菌株及2個親本B1、B2進行菌絲生長速度和滿皿時間的測定及菌絲生長勢的比較，結(jié)果見表10。雜交菌株菌絲生長速度為 0.393～0.959cm?d^-1; ，不同菌株在菌絲體生長速度上存在差異。其中，生長速度最快的是雜交菌株LX155，菌絲生長速度為 0.959cm?d^-1 ，雜交菌株LX149菌絲生長速度僅次于雜交菌株LX155，菌絲生長速度為 0.954cm?d^-1 ，雜交菌株LX114稍差于雜交菌株LX155和LX149，菌株生長速度為 0.952cm?d^-1 ，菌絲生長速度第4的雜交菌株LX119為 0.943cm?d^-1 ，菌絲生長速度最慢的是雜交菌株LX62，為 0.393cm?d^-1 。

表9雜交菌株生理特性鑒定

Table9 Identificationof physiological characteristicsof

注：“ + ”表示有拮抗現(xiàn)象，“一\"表示無拮抗現(xiàn)象。Note：\" + \"indicates antagonism，and“-”indicates noantagonism.

2.4.3雜交菌株生育期比較對95個雜交菌株及2個親本的發(fā)菌特性的比較結(jié)果如表11所示，由于四極性異宗結(jié)合特性部分雜交菌株不結(jié)實，其他各雜交菌株的發(fā)菌時間在2～3d、滿袋時間在 24～40d 、原基發(fā)生時間在39～65d。其中，雜交菌株LX119滿袋時間最短，為24d，原基發(fā)生期為39d，雜交菌株LX2、LX23、LX115、LX118、LX135的滿袋時間僅次于LX119，為25d，滿袋時間最長的是雜交菌株LX137和LX155，為 40d 0

2.4.4雜交菌株產(chǎn)量和商品性狀比較通過栽培試驗，最終得到72株可結(jié)實雜交菌株。對72株雜交菌株的產(chǎn)量和商品性狀的比較結(jié)果見表12。子實體形態(tài)為棒狀、近棒狀、保齡球形和近保齡球形。雜交菌株菌蓋直徑在 1.8～9.1cm ，雜交菌株菌柄直徑在 2.2～8.0cm ，子實體總長在 5.4～21.5cm ，雜交菌株菌蓋顏色為淺褐色、褐色和深褐色，雜交菌株每袋產(chǎn)量在 170.55～762.14g 。其中，產(chǎn)量最高的雜交菌株為LX119，每袋產(chǎn)量為 762.14g ，其生物學(xué)效率為132.01% ，其次是菌株LX118，每袋產(chǎn)量為 725.06g ，生物學(xué)效率為 125.65% ，而雜交菌株LX31產(chǎn)量最低，每袋產(chǎn)量為 170.55g ，生物學(xué)效率僅有 29.49% 。

綜上所述，雜交菌株LX119的產(chǎn)量最高，生物學(xué)效率為 132.01% ，比親本菌株B1、B2分別高出19.46個百分點和15.21個百分點，生育期時間為56d 。

2.4.5雜交菌株主成分分析通過主成分分析可知，9個性狀的提取值有很大差異，說明各性狀重要性不同。主成分的選擇原則為特征值大于等于1的主成分。雜交菌株主成分分析中前3個主成分特征值都大于1，累計貢獻率達到 68.283% （表13）。其中第1主成分的特征值為3.770，貢獻率高達41.894% ；第2主成分特征值是1.263，貢獻率為14.028% ；第3主成分特征值是1.113，貢獻率為12.361% 。

從主成分碎石圖可知，前3個主成分的特征值變化非常明顯，隨后的主成分特征值變化趨于平穩(wěn)（圖3），說明提取的前3個主成分對原始變量的信息有明顯的描述作用，選擇前3個主成分是恰當(dāng)?shù)摹?/p>

由表13～14雜交菌株主成分載荷矩陣可知，第1主成分貢獻率為 41.894% ，按照各性狀分量的絕對值大小，特征向量值最大的性狀是雜交菌株子實體總長，代表杏鮑菇的子實體長度，把第1主成分稱為子實體大小構(gòu)成因子。第2主成分貢獻率為14.028% ，明顯低于第1主成分，特征向量值最大的性狀是雜交菌株子實體形態(tài)，代表杏鮑菇的外形性狀，把第2主成分稱為表觀形態(tài)構(gòu)成因子。第3主成分貢獻率為 12.361% ，略低于第2主成分，特征向量值最大的性狀是雜交菌株菌絲生長速度。

表10杏鮑菇雜交菌株菌絲生長情況 Table1oMycelialgrowthofPleurotuseryngiihybridstrains

注： ++++ 代表粗壯、濃密； +++ 代表較粗壯、濃密； ⁺⁺ 代表菌絲稀疏、纖細(xì)；一代表菌絲未萌發(fā)。 Notes： ++++ issturdyandthick; +++ isrelativesturdyand thick; ⁺⁺ isthinand slender;-ismyceliumdid not germinate

表11杏鮑菇雜交菌株生育期評價

Table11GrowthperiodevaluationofhybridstrainsofP.eryngii

注：一代表栽培后未出菇。 Notes：-is no mushroom was produced after cultivation.

表12杏鮑菇雜交菌株產(chǎn)量和商品性狀比較

Table12Comparison ofyieldandcommoditytraitsofPleurotuseryngiihybrid strains

表12 （續(xù)） Table12（Continued）

表12 （續(xù)）

綜上可知，9個性狀的提取值有很大差異，說明各性狀重要性不同，其中雜交菌株子實體總長、雜交菌株子實體形態(tài)、雜交菌株菌絲生長速度是3個影響力較大的農(nóng)藝性狀。72株雜交菌株子實體如圖4所示。

Table13Total variance explained byprincipal component analysis of hybrid strains

表13雜交菌株主成分分析解釋的總方差表

圖3主成分分析碎石圖 Fig.3Scree plot of principal component analysis

表14雜交菌株主成分載荷矩陣

Table14Principalcomponent loading matrix of hybrid strains

3 討論與結(jié)論

杏鮑菇以營養(yǎng)豐富、口感極佳、易栽培等特點，在許多國家和地區(qū)迅速推廣，成為我國工廠化食用菌主要栽培種類之一[28]，而目前我國杏鮑菇菌株管理混亂，同種異名現(xiàn)象屢見不鮮，菌株反復(fù)轉(zhuǎn)接，缺乏提純復(fù)壯技術(shù)，導(dǎo)致品種退化現(xiàn)象嚴(yán)重、育種材料匱乏、國內(nèi)工廠化杏鮑菇栽培品種單一、可持續(xù)發(fā)展力量不足[29]。因此，杏鮑菇優(yōu)良種質(zhì)資源的收集、鑒定、創(chuàng)制及新品種的選育工作極其重要。

陳靚[30、于婭3都利用體細(xì)胞不親和性的方法分別對平菇和榆耳進行了生理特性研究，分析供試菌株間的生理特性多樣性及體細(xì)胞不親和性的拮抗反應(yīng)，常用于鑒別菌株的異同和種質(zhì)資源多樣性的評價。王振河等通過拮抗試驗、菌絲培養(yǎng)特性試驗和出菇試驗，明確8個平菇各菌株間的親緣關(guān)系。陳影等33在黑木耳育種過程中利用拮抗反應(yīng)對雜交菌株的親緣關(guān)系進行初步鑒定。本研究中菌株B16和B17、B18和B19、B24和B25之間無拮抗線，說明每對菌株親緣關(guān)系極為相近或者為同一個菌株。其他的菌株大部分都有拮抗線出現(xiàn)，說明這些菌株之間具有一定的生理差異。當(dāng)拮抗試驗中拮抗性表現(xiàn)不突出時，辨別菌株間是否真的發(fā)生了拮抗反應(yīng)變得較為困難，據(jù)報道，培養(yǎng)基的成分變化對抑制邊界的形成具有顯著影響[34]，在不同食用菌之間，抑制現(xiàn)象的強度也表現(xiàn)出明顯的差異。例如，杏鮑菇等菌絲較為粗壯的食用菌，其抑制現(xiàn)象較為顯著；而蟲草、木耳、靈芝等菌絲較弱的食用菌品種間的抑制反應(yīng)則相對較弱，拮抗試驗通常用于識別同一物種內(nèi)不同菌株的拮抗特性，然而，由于缺少標(biāo)準(zhǔn)化的評估準(zhǔn)則，僅依靠拮抗試驗來確定菌株間的親緣關(guān)系是不夠精確的。為了獲得更準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，應(yīng)該采用多種方法，對菌株的親緣關(guān)系進行綜合分析，因此在試驗中加入了ISSR分子標(biāo)記共同鑒定菌株間的親緣關(guān)系。

圖4雜交新菌株Fig.4Newhybridstrains

陳影等[35]、劉桂娟[3都采用農(nóng)藝性狀方法對黑木耳進行了種質(zhì)資源多樣性研究，為進一步研究供試菌株間的多樣性，筆者對34株杏鮑菇菌株使用袋栽工廠化的方法進行出菇試驗。在本次試驗中，筆者對多個關(guān)鍵參數(shù)進行了詳盡的測定與分析，包括生育期、生物學(xué)效率等一系列與生長相關(guān)的參數(shù)，同時觀察了子實體的形態(tài)特征，如菌蓋的顏色、直徑、菌柄直徑和子實體長度等形態(tài)學(xué)特性。這些參數(shù)的測定與分析有助于全面評估杏鮑菇菌株的性能和特性，為選育優(yōu)良的杏鮑菇菌株提供更堅實的科學(xué)依據(jù)。然而，本研究中的杏鮑菇產(chǎn)量顯著高于陸娜[3和馮偉林[3的研究結(jié)果，可能的原因是使用的出菇室符合杏鮑菇工廠化生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，能更好地滿足杏鮑菇對生長環(huán)境的需求，同時使用的菌袋質(zhì)量也超過了以往的試驗。

單-單雜交和單-雙雜交育種的關(guān)鍵步驟是單核菌株的獲得和雜交子真實性的鑒定。宋瑩等3利用原生質(zhì)體單核體雜交技術(shù)，以野生香菇和幾個主栽品種為研究對象進行單-單雜交，結(jié)果顯示有3株菌株的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量等均優(yōu)于親本。筆者在此基礎(chǔ)上獲得了杏鮑菇雜交子真實性鑒定的相關(guān)參數(shù)。筆者獲得的雜交菌株在生育期、菌絲日均生長速度和生物學(xué)效率等方面均優(yōu)于馮偉林[3和潘慧4的研究結(jié)果。這種差異可能來自兩個方面：一方面，現(xiàn)代化的栽培環(huán)境更好地滿足了杏鮑菇的生長需求，提供了穩(wěn)定的溫度、濕度、通風(fēng)及無菌條件，從而促進了雜交菌株的生長；另一方面，通過大量的雜交育種試驗，篩選出了具有優(yōu)良性狀的菌株。這些菌株在產(chǎn)量和生育期上表現(xiàn)突出，表明雜交育種在改良杏鮑菇農(nóng)藝性狀方面具有顯著效果。因此，優(yōu)化的栽培環(huán)境和精確的育種策略是提高杏鮑菇生產(chǎn)效率的關(guān)鍵因素。

筆者綜合運用了體細(xì)胞不親和性檢驗、分子標(biāo)記分析以及農(nóng)藝性狀評估，對34株杏鮑菇菌株進行了全面評價，揭示了各試驗菌株在不同性狀上的遺傳變異和具體表現(xiàn)。得出結(jié)論如下，菌株B16和B17、B18和B19、B24和B25之間不產(chǎn)生拮抗線，為相同菌株。菌株B1和B2展現(xiàn)出了優(yōu)異的綜合性狀。特別是在發(fā)菌階段，不僅菌絲生長迅速，而且生育期也較短。在生物學(xué)性狀上，它們不僅外觀良好，而且在產(chǎn)量和生物學(xué)效率上也展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢。因此，將B1、B2作為雜交親本，用來選育性狀優(yōu)良的杏鮑菇后代。

通過應(yīng)用雜交育種技術(shù)，成功篩選出了優(yōu)異的雜交菌株LX119。在利用親本B1和B2配置的160個雜交組合中，結(jié)合細(xì)胞學(xué)與生理特性的鑒定，獲得98個真實雜交組合。通過出菇試驗，最終有72株菌株結(jié)實且農(nóng)藝性狀差異較大，最終篩選出優(yōu)良雜交菌株LX119。該菌株生物學(xué)效率為132.01% ，生育期為56d，且外形良好、菌絲生長速度快、生育期短、產(chǎn)量高、抗雜性較強，是具有開發(fā)成新品種潛力的雜交菌株。

參考文獻

[1] LISQ，SHAHNP.Antioxidantandantibacterialactivitiesofsulphated polysaccharides fromPleurotuseryngii and Strepto-coccus thermophilusASCC 1275[J].Food Chemistry，2014，165：262-270.

[2] LIXB，F(xiàn)ENGT，ZHOUF，et al，etal.Effects of drying meth-odson the tastycompoundsofPleurotuseryngii[J].Food Chem-istry，2015，166：358-364.

[3] RODRIGUEZESTRADAAE，ROYSEDJ.Yield，sizeandbac-terial blotch resistance of Pleurotus eryngii grown on cottonseedwhole ground soybean[J]. Bioresource Technology，2007，98（10）：1898-906.

[4] LISQ，SHAHN P.Effects of various heat treatments on pheno-lic profiles and antioxidant activities of Pleurotus eryngii ex-tracts[J].Journal ofFood Science，2013，78（8）：1122-1129.

[5] 郭美英.珍稀食用菌杏鮑菇生物學(xué)特性的研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，1998，13（3）：45-50.

[6] BOBOVCAK M，KUNIAKOVAR，GABRIZ J，et al.Effectof Pleuran（β-glucan from Pleurotus ostreatus） supplementationon celllar immune response after intensive exercise in elite ath-letes[J].Applied Physiology，Nutritionand Metabolism，2010，35（6）：755-762.

[7] MUGAMBI A M，YANGWJ，MUGAMBI D K，et al.Antipro-liferative and immunostimulatory activity of aprotein fromPleurotus eryngii[J].Journal of the Scienceof Food and Agricul-ture，2014，94（15）：3152-3162.

[8] 顏明娟，江枝和，蔡順香.杏鮑菇營養(yǎng)成分的分析[J].食用菌，2002，24（2）：11-12.

[9] 呂爽.新型杏鮑菇深加工產(chǎn)品的制備及其特性研究[D].西安：陜西科技大學(xué)，2023.

[10]吳建坤，龔翔.杏鮑菇工廠化高效栽培關(guān)鍵技術(shù)要點[J].南方農(nóng)業(yè)，2019，13（27）：1-2.

[11]周紅艷.杏鮑菇農(nóng)藝性狀比較研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（2）：75-76.

[12]劉宇，陳文良，林秀敏，等.杏鮑菇不同菌株對比試驗[J].食用菌，2004，26（3）：11-12.

[13]陳珣，肇瑩，龔娜，等.應(yīng)用拮抗和ISSR標(biāo)記鑒定64個金針菇菌株的親緣關(guān)系[J].中南農(nóng)業(yè)科技，2024，45（1）：16-20.

[14]焦禾，王鳳利，馬銀鵬，等.黑木耳分子生物學(xué)研究進展[J].北方園藝，2023（17）：124-129.

[15]鄧優(yōu)錦，王慶福，陳介斌，等.具有拮抗關(guān)系的18個香灰菌株遺傳差異性分析[J].食用菌學(xué)報，2014，21（2）：25-31.

[16]楊和川，蘇文英，譚一羅，等.基于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的杏鮑菇種質(zhì)資源評價[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，32（7）：1480-1486.

[17]李月梅，采俊香，牛瑞青.不同基質(zhì)配方工廠化栽培杏鮑菇研究[J].北方園藝，2012（7）：177-179.

[18]楊麗維，王玉，班立桐，等.杏鮑菇液體菌種培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化[J].北方園藝，2014（6）：150-152.

[19]張瑞華，王承香，田洪霞，等.玉米芯栽培杏鮑菇培養(yǎng)料配方比較試驗[J].食用菌，2021，43（4）：48-49.

[20]SUSANNA S，SAYUTHI M，SALSABILAL，et al.Test antago-nism of several Trichoderma species in suppressing the growthofAlternaria sp.in vitro[J].IOP Conference Series：Earth andEnvironmental Science，2024，1297（1）：012066.

[21]鄭雪平.杏鮑菇菌株資源遺傳多樣性分析和評價[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[22]陳影，姚方杰，張友民，等.木耳栽培種質(zhì)資源的數(shù)量分類研究[J].菌物學(xué)報，2014，33（5）：153-163.

[23]李青，韓鵬遠(yuǎn)，李云霞，等.16 種杏鮑菇的菌絲生長特性比較[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報，2016，6（12）：39-42.

[24]黃春燕，郭惠東，楊鵬，等.21個杏鮑菇菌株比較研究[J].中國食用菌，2018，37（5）：11-14.

[25]姬建軍.杏鮑菇菌株間遺傳差異分析與單孢雜交配對研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[26]劉桂娟.黑木耳不親和性因子構(gòu)成及優(yōu)良品種選育的研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[27] 姜婉竹，姚方杰，方明，等.榆耳種質(zhì)資源主要農(nóng)藝性狀的數(shù)量評估[J].菌物學(xué)報，2021，40（12）：3143-3156.

[28]張瑞華，王承香，丁美麗，等.工廠化生產(chǎn)杏鮑菇出菇期主要病害及防治措施[J].中國食用菌，2020，39（3）：72-75.

[29] 戴天放，徐光耀，盧慧，等.江西食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀、問題與建議[J].中國食用菌，2020，39（9）：94-99.

[30]陳靚.平菇種質(zhì)資源評價及優(yōu)良菌株選育的研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[31]于婭.榆耳種質(zhì)資源評價及優(yōu)良品種選育的研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[32]王振河，王斌，武忠偉，等.8個平菇栽培菌株的親緣關(guān)系及培養(yǎng)特性研究[J].微生物學(xué)雜志，2007，27（4）：50-53.

[33]陳影，姚方杰，張友民，等.黑木耳新品種選育研究[J].北方園藝，2014（8）：133-134.

[34]MICALICO，SMITHML.Onthe independenceof barrageformation and heterokaryon incompatibility in Neurosporacrassa[J].FungalGeneticsandBiology，2003，38（2）：209-219.

[35] 陳影，姚方杰，劉桂娟，等.黑木耳栽培種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀多樣性研究[C].中國菌物學(xué)會2009學(xué)術(shù)年會論文摘要集，2009.

[36]劉桂娟.黑木耳不親和性因子構(gòu)成及優(yōu)良品種選育的研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[37] 陸娜.杏鮑菇優(yōu)良品種篩選及配套栽培技術(shù)研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2016.

[38]馮偉林.杏鮑菇優(yōu)良雜交新菌株選育研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2010.

[39]宋瑩，劉俊杰，張敏，等.采用原生質(zhì)體單核體雜交技術(shù)創(chuàng)新香菇種質(zhì)資源[J].北方園藝，2017（19）：165-169.

[40]潘慧.杏鮑菇優(yōu)良雜交子的初步選育[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.