巴戟天種質(zhì)資源SCoT分子標(biāo)記遺傳多樣性分析

關(guān)鍵詞：巴戟天；種質(zhì)資源；SCoT；遺傳多樣性；聚類(lèi)分析；mantel檢驗(yàn)中圖分類(lèi)號(hào)： S567.1Σ⁺90.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2025）11-0031-08

巴戟天（MorindaofficinalisHow）為茜草科巴戟天屬植物，其干燥根入藥，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，主治陽(yáng)痿遺精、月經(jīng)不調(diào)等病癥[1]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，巴戟天作為“藥食兩用”性中藥，市場(chǎng)需求量急劇增加，供不應(yīng)求，導(dǎo)致人們過(guò)度采挖，使得巴戟天野生資源已接近枯竭，其商品藥材絕大多數(shù)來(lái)源于栽培，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工嫁接，種質(zhì)資源已經(jīng)分化[2。關(guān)于巴戟天種質(zhì)資源的研究，有學(xué)者采用RAPD[3]、ISSR[4]、SRAP和CDDP分子標(biāo)記[5]進(jìn)行研究，但多為一代分子標(biāo)記技術(shù)。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）是基于PCR擴(kuò)增的二代分子標(biāo)記技術(shù)，是由Collard等開(kāi)發(fā)的一種新穎的標(biāo)記技術(shù)[]，基于基因的ATG翻譯起點(diǎn)相應(yīng)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，該方法結(jié)合了前述分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，可作為RAPD等傳統(tǒng)分子標(biāo)記的有效補(bǔ)充[7]。SCoT分子標(biāo)記在各類(lèi)植物上都有較強(qiáng)的通用性，近年來(lái)SCoT分子標(biāo)記已在廣西葛根[8]、地黃[9]、廣藿香[10]、白芨[]、枸杞[12]青錢(qián)柳[13]、金線(xiàn)蓮[14]、梔子[15]等多種中藥材的遺傳多樣性分析研究中得以應(yīng)用，而國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有關(guān)于巴戟天SCoT分子標(biāo)記研究的文獻(xiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)選用條帶清晰、多態(tài)性好的7條SCoT引物對(duì)32個(gè)居群巴戟天的遺傳多樣性進(jìn)行分析，了解不同居群間的親緣關(guān)系，以期為新品種選育、優(yōu)良基因的挖掘提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

183份巴戟天樣品分別于2023年采集自廣西、廣東、福建和海南4個(gè)省份32個(gè)居群，樣品清洗后置于含硅膠的密封袋中，于 -20^°C 冰箱中保存，樣品信息見(jiàn)表1。巴戟天經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)戴忠華副教授鑒定為茜草科巴戟天屬巴戟天。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

試驗(yàn)儀器與試劑包括梯度PCR儀（美國(guó)Bio-

Rad公司）凝膠成像儀（GelLogic）、天根植物DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司） .2×Hieff PCRMasterMix（上海翌圣生物科技股份有限公司）、GelRed染料（Biotium）、瓊脂糖（BioFroxx）、5×TBE 緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.3總DNA提取及檢測(cè)

按照試劑盒DNA提取方法提取巴戟天總DNA，提取產(chǎn)物經(jīng) 1% 凝膠電泳檢測(cè)；采用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)巴戟天總DNA純度及其濃度，并將樣品濃度稀釋到濃度為 20ng/μL ，置于 -20°C 冰箱中保存。

1.4 引物篩選

83條引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其中36條引物為參照Collard等的研究開(kāi)發(fā)的通用引物，47條引物為自設(shè)引物，以183份巴戟天樣品進(jìn)行引物篩選，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，篩選出條帶清晰、多態(tài)性好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系 （20μL）：0. 5μLDNA 模板（ 20μg/mL ）， 1μL 上、下游引物 ?10μmol/L ）， 8μL 2× Hieff PCR Master Mix， ddH₂0 加至 20μL ;PCR程

序 ：95C3min;95C25s，52.2C60s，72C 110s，45個(gè)循環(huán)； 。PCR產(chǎn)物置于1.0% 瓊脂糖凝膠中檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)

對(duì)凝膠電泳圖進(jìn)行分析，以條帶有無(wú)為依據(jù)，將電泳圖轉(zhuǎn)化為“1”“0”矩陣表。通過(guò)POPGENE32軟件分析Nei's基因多樣性指數(shù) （H） 等遺傳信息參數(shù)。基于居群間遺傳相似度矩陣，利用NTSYS2.10進(jìn)行聚類(lèi)分析。應(yīng)用GENALEX軟件對(duì)巴戟天居群的地理距離、遺傳距離進(jìn)行mantel檢驗(yàn)，分別用于檢測(cè)個(gè)體間的相互關(guān)系和地理距離、遺傳距離的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

使用7條SCoT引物對(duì)183份樣品進(jìn)行擴(kuò)增，部分引物（SCoT-51）的瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，不同引物的多態(tài)性位點(diǎn)指數(shù)如表2所示。

總擴(kuò)增條帶位點(diǎn)均值為15.2857，最高的是引物SCoT-35（20），最低的是引物SCoT-51（13）；多態(tài)性位點(diǎn)最高的是引物SCoT-35（20），最低的是引物SCoT-51（8），均值為14.4281;多態(tài)性位點(diǎn)占比均值為 94.39% ，引物SCoT-51最低 （61.54% ），其次是引物SCoT-77（92. 86% ），其余5條引物多態(tài)性位點(diǎn)占比均最高（ 100.00% ）。

2.2不同居群的樣品遺傳多樣性分析

32個(gè)巴戟天居群的遺傳多樣性指數(shù)見(jiàn)表3。在物種水平上，等位基因數(shù) （N_a）=1.943 9 ，有效等位基因數(shù) （N_e）=1. 6853 ，Nei's基因多樣性指數(shù)（H）=0，3742 ，Shannon's信息指數(shù) （I）=0.541 7 ：在各栽培居群遺傳多樣性指數(shù)的平均值， N_a= 1.5592，N_e=1.3954，H=0.2223，I=0.3248 ；在各野生居群遺傳多樣性指數(shù)的平均值， N_a=1.6154 ，N_e=1.4583，H=0.2521，I=0.3651 。整體上，野生居群遺傳多樣性高于栽培居群。

巴戟天各居群擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)在 38～ 82之間，廣東陽(yáng)江市（YJ）居群擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最高，多態(tài)性比率為 76.64% ，說(shuō)明廣東陽(yáng)江市（YJ）居群巴戟天的遺傳多樣性比較高;廣東博羅（BL）僅擴(kuò)增出38個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)最少的居群，其多態(tài)性比率為 35.51% 。所研究的32個(gè)居群巴戟天物種水平多態(tài)性比率為 94.39% ，表明32個(gè)巴戟天居群資源間的遺傳多樣性較高。

基于 H 來(lái)看， H 在巴戟天各居群的變化范圍在0.143 3～0.310 2 ，居群水平平均值為0.2344，其中，廣東陽(yáng)江市（YJ）、福建平和（PH）、廣西浦北（PB）等居群的Nei's基因多樣性指數(shù)較高，分別為0.3102.0.3099.0.2883 ，上述居群均為野生品種，說(shuō)明巴戟天居群間存在著遺傳差異，且野生居群遺傳多樣性水平相對(duì)較高。Shannon信息指數(shù)（I）在0.2095～0.4499 之間，平均水平為0.3411，其中，廣東陽(yáng)江市（YJ）、福建平和（PH）、廣西浦北（PB）居群的shannon多態(tài)信息指數(shù) I 較高，分別為0.4499.0.4446.0.4163 。

2.3種質(zhì)的遺傳分化

根據(jù)POPGENE32軟件對(duì)巴戟天居群Nei's基因多樣性指數(shù)的分析結(jié)果，32個(gè)巴戟天居群的居群總基因多樣性（ ?H_t ）值為0.3721，居群內(nèi)基因多樣性 （H_s） 值為0.2344。居群間遺傳分化系數(shù)（ G_st 值為 0.3700gt;H_s ，巴戟天居群間的遺傳分化高于居群內(nèi)；基因流 N_m 值為 0.8512lt;1 ，則表明32個(gè)居群之間基因交流不頻繁。

2.4相似度與遺傳距離的分析

根據(jù)32個(gè)居群之間的遺傳距離 （D） 和遺傳相似度 （I） （表4）可知，巴戟天的居群遺傳距離存在一定差異，總體范圍在 0.054 0～0.401 4 之間，廣東陽(yáng)江市（YJ）居群與廣東茂名市（MM）居群之間遺傳距離最小，廣西八步區(qū)（BBQ）居群與海南樂(lè)東市（LD）居群之間遺傳距離最大；遺傳相似度范圍在 0.6694～0.9474 之間，其中廣東陽(yáng)江市（YJ）居群與廣東茂名市（MM）居群之間的遺傳相似度最大，為0.9474，廣西八步區(qū)（BBQ）居群與海南樂(lè)東市（LD）居群之間的遺傳相似度最小，為0.6694。

2.5 NTSYS聚類(lèi)分析

采用NTSYS2.10軟件根據(jù)居群間的遺傳相似度對(duì)不同產(chǎn)地巴戟天進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。遺傳相似度在0.79時(shí)，32個(gè)巴戟天居群分為2類(lèi)，第1類(lèi)包括海南瓊中縣（QZ）、海南五指山市（WZS）、海南樂(lè)東市（LD）、海南儋州市（DZ）和海南保亭縣（BT）5個(gè)居群，在遺傳相似度為0.83時(shí)聚為一支，它們均產(chǎn)自海南，且為野生種質(zhì);第2類(lèi)包括廣東、廣西和福建的27個(gè)居群。遺傳相似度在0.82時(shí)，廣西賀州八步區(qū)（BBQ）廣西梧州波塘鎮(zhèn)（BTZ）廣西防城港市大菉鎮(zhèn)（DL）廣西防城港市東興市（DX）、廣西梧州市藤縣（TX）、廣東省揭陽(yáng)市普寧市（PN）、廣西藥用植物園（NN）居群聚為一支，DL、DX為野生種質(zhì)，其他5個(gè)居群的巴戟天為栽培品；當(dāng)遺傳相似度在0.84時(shí)，廣西的5個(gè)栽培居群聚為一支；遺傳相似度在0.85時(shí)，廣東德慶縣（DQ）、廣東惠州博羅縣（BL）、廣東肇慶高要區(qū)（GY）、福建龍巖市（LY）、福建漳州云霄縣（YX）、廣東云浮郁南縣（YN）居群聚為一支，這6個(gè)居群的巴戟天均為栽培品；遺傳相似度為0.87時(shí)，5個(gè)野生居群福建平和縣（PH）、廣西浦北縣（PB）、廣東陽(yáng)江市（YJ）、廣東茂名市（MM）和廣東廣寧縣（GN）居群聚為一支；遺傳相似度為0.89時(shí)，廣西的2個(gè)野生居群廣西防城港市那良鎮(zhèn)（NL）和廣西容縣（RX）居群聚為一支。聚類(lèi)分析中，同為野生種質(zhì)或同為栽培種質(zhì)的樣品之間遺傳相似度更高，親緣關(guān)系更近，地理距離相近的樣品親緣關(guān)系也更為接近。

2.6遺傳距離與地理距離相關(guān)性的mantel檢驗(yàn)

mantel檢驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示， r=0.261 4，P= 0.001lt;0.05 ，說(shuō)明巴戟天遺傳距離與地理距離存在著顯著相關(guān)性，巴戟天各居群間的遺傳變異會(huì)受地理隔離的影響，這也支持了聚類(lèi)分析（UPGAM）的分析結(jié)果。

3討論與小結(jié)

本研究采用SCoT標(biāo)記對(duì)不同產(chǎn)地巴戟天樣品進(jìn)行分析，7條SCoT引物共擴(kuò)增條帶107條，多態(tài)性條帶101條，多態(tài)性百分比為 94.39% ;Nei's基因多樣性指數(shù) （H） 為0.3742、Shanmon's信息指數(shù) （I） 為0.5417，說(shuō)明巴戟天種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，SCoT法適用于巴戟天樣品的遺傳多樣性分析。另外，栽培居群 H=0，222 3，I=0.324 8 ，野生居群H=0.252 1.I=0.365 1 ，說(shuō)明野生巴戟天遺傳分化程度較栽培品高，有學(xué)者指出，植物的繁育方式是影響遺傳多樣性的主要因素[16-17]。野生巴戟天為有性繁殖，栽培品多以扦插的無(wú)性生殖方式進(jìn)行繁衍，有性繁殖可傳遞親本的遺傳信息，利于基因重組和基因突變，使得野生巴戟天居群具有較高的遺傳多樣性；但是，栽培居群的遺傳多樣性沒(méi)有明顯低于野生居群，這可能是由于巴戟天栽培歷史悠久，可以追溯至18世紀(jì)初[18]，在長(zhǎng)期栽培過(guò)程中進(jìn)行了多次選擇和優(yōu)化，從而形成了具有較高遺傳多樣性的栽培居群。

聚類(lèi)分析表明，遺傳相似度在0.83時(shí)，5個(gè)海島居群聚為一支，瓊州海峽將海南島與其他地區(qū)隔開(kāi)，導(dǎo)致海南島5個(gè)居群與廣東、廣西和福建的27個(gè)居群遺傳分化較大，呈現(xiàn)出地理隔離對(duì)巴戟天遺傳分化的影響;遺傳相似度在0.84時(shí)，來(lái)自廣西的5個(gè)居群的巴戟天聚為一支，說(shuō)明產(chǎn)地對(duì)巴戟天樣品間遺傳分化也產(chǎn)生了影響。

聚成一支的5個(gè)海南居群都是野生種質(zhì)；遺傳相似度在0.878時(shí)，來(lái)自廣西的1個(gè)居群、福建的1個(gè)居群和廣東的3個(gè)野生居群聚為一支；遺傳相似度在0.89時(shí)，廣西的2個(gè)野生居群聚為一支。遺傳相似度在0.82時(shí)，來(lái)自廣西的6個(gè)居群與廣東的1個(gè)栽培居群聚為一支;遺傳相似度為0.85時(shí)，來(lái)自廣東4個(gè)栽培居群和福建的2個(gè)栽培居群聚為一支。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，同為野生種質(zhì)或同為栽培種質(zhì)的樣品之間遺傳相似度更高，親緣關(guān)系更近。廣東、廣西和福建的多個(gè)栽培居群遺傳距離較近，各栽培居群間遺傳分化受地理分布因素影響較弱，可能是由于巴戟天栽培品多以扦插的方式進(jìn)行繁殖，且多數(shù)種苗來(lái)自廣東德慶，導(dǎo)致栽培品基因穩(wěn)定，變異較少，造成遺傳背景相似[19]，使得巴戟天栽培品居群間遺傳分化地域性不明顯。本研究揭示巴戟天種質(zhì)資源遺傳分化情況，為巴戟天種質(zhì)資源的保護(hù)、良種繁育和栽培以及巴戟天藥材的質(zhì)量研究提供理論參考和科學(xué)依據(jù)

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