基于ISSR分子標(biāo)記的鉆天柳遺傳多樣性分析

中圖分類號：S791.43 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-9499（2025）04-0033-07

Analysisof GeneticDiversityinSalixarbutifolia Using ISSR Molecular Markers

ZHANGYu1.2 GAO Jinhui1 XUE Yonghui2 JIANG Zhen4 ZHANGGuocai3 ZHANGHeyang ZHANG Houliangl**

（1.Yichun Branch of Heilongjiang Academy ofForestry，Heilongjiang Yichun 153000; 2.Heilongjiang Agricultural Engineearing Vocational College，Heilongjiang Harbin 150088;3.Northeast Forestry University，Heilongjiang Harbin 15o04O;4.Yichun Geographic Information Processing Center，Heilongjiang Yichun 153000）

AbstractThis study established18 natural distribution sites and plots in the Greaterand Lesser Khingan Mountains from 2021 to 2022，collcting 50 samples of Salix arbutifolia.The modified CTAB method was employed for genomic DNA extraction from leaves.Through ISSR-PCR amplification，10 primers were identified，and their optimal annealing temperatures were determined.The results indicate that the extracted genomic DNA meets quality standards.The genetic diversityof Salixarbutifolia populations is relatively high，with an average polymorphic band percentage of 91.91% at the species level and 92.22% overall， indicating substantial genetic variation.The Shannon information index and Nei'sgene diversity index peaked at an elevation of 548m .The genetic differentiation coefficient （GST） was calculated at 0.2303， suggesting significant gene flow among populations.The five natural populations exhibited close genetic relationships，with genetic similarity ranging from O.8867 to 0.9651 and genetic distance from 0.0355 to 0.1203.The 29 individuals were categorized into four major groups.The findings conclude thatthe genetic diversity of Salixarbutifoliaarises from genetic variation influenced by itsbreeding system and seed dispersal mechanisms，while the impact of geographic isolation appears minimal.

Key wordsSalix arbutifolia; ISSR;genetic diversity; genetic composition

鉆天柳（Salixarbutifolia）是楊柳科中分布范圍最小的一個(gè)類群，該樹種生長迅速，樹形優(yōu)美，適合作為綠化樹種，具有顯著的生態(tài)價(jià)值，常分布于河岸及溪流兩側(cè)，是理想的護(hù)岸樹種，零星分布于中國東北部分地區(qū)[1]。通過對72種柳樹及其雜交種的孢粉形態(tài)進(jìn)行了研究，結(jié)果支持將鉆天柳屬并入柳屬的分類處理[2-5]。

盡管其分類學(xué)復(fù)雜、重要意義和瀕危地位，但現(xiàn)有的遺傳多樣性信息仍然匱乏。有少數(shù)研究主要集中于鉆天柳的種子[6-8]嫩枝、硬枝扦插[9，10]嫁接[10，1]和組培繁殖技術(shù)[12，13]，鉆天柳的生長規(guī)律與特點(diǎn)[14]，鉆天柳人工造林、撫育[15]和種群現(xiàn)狀及生物多樣性[16-19]等。關(guān)于鉆天柳的深層次研究較少且不全面，例如鉆天柳的種群、群落特征及物種多樣性[20，21等有關(guān)其資源現(xiàn)狀和立地造林條件、抗水濕機(jī)理、城市綠化應(yīng)用與管理等應(yīng)用方面，尤其是鉆天柳作為瀕危物種的遺傳多樣性、瀕危機(jī)制等方面的研究少有報(bào)道。本研究有望為今后鉆天柳的遺傳多樣性研究提供大量的數(shù)據(jù)資源，并揭示其瀕危機(jī)制，為科學(xué)制定拯救與保護(hù)策略提供理論支撐。

1材料與樣地設(shè)置

2021年6月至2022年7月，在中國大、小興安嶺地區(qū)。根據(jù)鉆天柳的天然分布區(qū)，設(shè)置了18個(gè)鉆天柳天然分布點(diǎn)，這些天然分布點(diǎn)涵蓋了鉆天柳的主要分布區(qū)域，并考慮了地理梯度、行政區(qū)劃以及氣候、土壤和生態(tài)條件的差異。

在每個(gè)天然分布點(diǎn)，設(shè)置調(diào)查面積為 20m×20m 的樣地，共計(jì) 7200m² 。在每個(gè)樣地內(nèi)進(jìn)行詳細(xì)的植被調(diào)查，記錄鉆天柳的生長狀況、數(shù)量、分布以及與其他物種的相互關(guān)系。同時(shí)，對樣地的環(huán)境因子進(jìn)行了詳細(xì)記錄，如海拔、坡度、土壤類型和植被覆蓋度等。

在每個(gè)采樣點(diǎn)，進(jìn)行3次重復(fù)取樣，以確保數(shù)據(jù)的可靠性和代表性。共采集19個(gè)種群共50株鉆天柳的有效個(gè)體樣本（表1、表2）。

2檢測方法

采用改進(jìn)的CTAB方法提取鉆天柳葉片基因組 DNA^[22] 。ISSR-PCR擴(kuò)增，ISSR引物的合成序列基于加拿大哥倫比亞大學(xué)于2006年發(fā)布的100條通用引物序列，由生工生物技術(shù)有限公司完成合成。50條ISSR引物按標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系（table1），選取5個(gè)樣品（佳木斯湯原JMSTY01、圖強(qiáng)育英林場TQ01、嘉蔭明德村JYMDC01、黑河平山HHPS01、加格達(dá)奇JGDQ01）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（PCR-96，BBI，Korea），篩選出條帶清晰的引物后進(jìn)行復(fù)篩，并以引物的Tm 值為基礎(chǔ)，對每個(gè)篩選引物的退火溫度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，最終確定其最適退火溫度。

采用POPGENE1.31軟件估算物種與種群多態(tài)性條帶百分率（PPB）Shannon表型多樣性指數(shù)（I） 、Nei's基因多樣性指數(shù)（He）;估算參試種群的Shannon表型多樣性指數(shù)的總體值（ISP）及其平均值 （I_POP） ，計(jì)算種群間遺傳分化系數(shù)（GST）。采用NTSYS-pc2.1軟件對種群內(nèi)的遺傳距離進(jìn)行非加權(quán)平均法聚類分析，繪制UPGMA聚類圖[25]。

3結(jié)果與分析

3.1最優(yōu)方法的確定

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的鉆天柳葉片基因組DNA，并使用NANODROP2000超微量分光光度計(jì)測定其純度和濃度。

由圖1和表4可知：使用改良CTAB法提取的鉆天柳基因組DNA，其OD260/OD280值為 1.67～ 1.84，條帶清晰明亮，無拖尾或彌散現(xiàn)象，表明鉆天柳基因組DNA未受RNA、蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)的污染，滿足ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的要求。

鉆天柳ISSR-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果為反應(yīng)體系為20μL ，每管含有 10×PCRBuffer2.5μL，DNA2μL， 0 1NTP20mmol/L，Taq 酶1U、引物 20μmol/L ISSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?94^9C 預(yù)變性 5min，94^°C 變性1min，50^qC 退火 50s，72°C 延伸 3min ，34個(gè)循環(huán)，72^°C 總延伸 10min，4°C 保存。

通過建立的最優(yōu)鉆天柳ISSR-PCR反應(yīng)體系對哥倫比亞大學(xué)公布的UBC800-UBC900的100條隨機(jī)引物進(jìn)行初篩和復(fù)篩。

由圖2可知，選出重復(fù)率好、多態(tài)性高、特異性強(qiáng)的引物10條，分別為 807，808，809，834，880， 881、885、886、890和891。并以引物 Tm 值為中心，通過設(shè)置退火溫度梯度實(shí)驗(yàn)，確定每個(gè)引物的最優(yōu)退火溫度。

以引物UBC807和UBC808為例，在PCR儀器上設(shè)置 50～65^circC 范圍內(nèi)的12個(gè)梯度，以探索適合的退火溫度。

由圖3可知，當(dāng)引物的退火溫度低于 50^qC 時(shí)ISSR-PCR擴(kuò)增條帶模糊不清，擴(kuò)增的特異性較差；當(dāng)退火溫度高于 50^qC 時(shí)，ISSR-PCR擴(kuò)增的條帶數(shù)量減少且強(qiáng)度較弱，擴(kuò)增效率降低；相比之下，當(dāng)退火溫度為 50^qC 時(shí)，ISSR-PCR擴(kuò)增的條帶數(shù)量較多且清晰，因此確定引物UBC807和UBC808的最優(yōu)退火溫度為 50% 。

同樣，根據(jù)上述原則，為10條引物確定其最適退火溫度（表5）：分別為 50.50，60.2，53.2，53.2，53.2， 54.8，50，50，54.8‰ 0

3.2居群種群遺傳多樣性

由表6可知，對鉆天柳5個(gè)天然種群29株個(gè)體進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出270個(gè)位點(diǎn)。

10條ISSR引物的多態(tài)性條帶比例（PPB）范圍為 66.67%～100% ，平均值為 91.91% ，在物種水平上，多態(tài)性條帶為 92.22% 。

從圖4和圖5可知：各種群Shannon表型多樣性指數(shù) （I） 和Nei's基因多樣性指數(shù) （He） 分別為0.125 1～0.358 8 和 0.0828～0.2360 ，平均值分別為0.2277和 0.1504 。小興安嶺北部居群的種群遺傳多樣性水平最高 ′_{I=0.3588，He=0.2360}， ，小興安嶺南部種群、小興安嶺中部種群、大興安嶺北部種群、大興安嶺南部種群的遺傳多樣性水平呈依次遞減趨勢。鉆天柳物種水平 I 和 He 分別為0.2202和0.1653，這表明鉆天柳有一定的遺傳變異。

3.3居群間的種群遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳距離

由表7可知，鉆天柳種群間的遺傳分化系數(shù)（Nei，1987）GST =0.2303 。Wright（1965）研究表明[23]，當(dāng)物種種群間GST值大于0.25時(shí)，遺傳分化程度較高；當(dāng)GST介于0.15-0.25時(shí)，表明遺傳分化較為顯著；GST值在0.05-0.15時(shí)，分化程度為中等；而當(dāng)GST小于0.05時(shí)，遺傳分化程度則較低。因此，鉆天柳種群之間的遺傳分化程度較為顯著，居群間有基因流。

天然居群間種群的遺傳距離和遺傳相似度是評估物種親緣關(guān)系的重要參數(shù)。遺傳距離越大，種群之間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)；遺傳相似度則呈相反趨勢[24]。根據(jù)表8的數(shù)據(jù)顯示，5個(gè)鉆天柳天然種群的遺傳相似度為 0.8867～0.9651 ，平均值為0.9349，遺傳距離介于 0.0355～0.1203 ，這表明5個(gè)鉆天柳天然種群之間存在較為緊密的親緣關(guān)系，可能來源于相同的起源。其中，小興安嶺南部與大興安嶺北部居群親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似度為0.8867，遺傳距離為0.1203；而大興安嶺北部居群與大興安嶺南部居群親緣關(guān)系最近，遺傳相似度為0.9651，遺傳距離為 0.0355 。

由圖6可知，鉆天柳29株個(gè)體分為4大組群，其中組群1由呼瑪06、09組成;組群2由佳木斯湯原01、02組成；組群3由新林、烏馬河、黑河、湯旺河、朗鄉(xiāng)、加格達(dá)奇和伊美組成；組群4由嘉蔭、阿木爾、南岔、美溪、友好、塔河和圖強(qiáng)組成。

3.4居群種群遺傳多樣性與生境相關(guān)性分析

鉆天柳野生資源多分布在海拔 167～551m 的河流兩側(cè)，地理范圍為 122^°33^′04.19\"～130^°39^′21.95\"E ，47^°07^′00.39\"～52^°58^′43.04\"N ，所有分布點(diǎn)均分布在河岸防護(hù)林帶內(nèi)。該區(qū)域植被類型為寒溫帶和溫帶落葉闊葉混交林，土壤類型包括草甸土、沼澤土、沖積土以及暗棕壤。

鉆天柳種群分布呈現(xiàn)出間斷的“島狀\"或“點(diǎn)狀\"特征，甚至僅有少量個(gè)體零星分布，生境破碎化程度較為嚴(yán)重。18個(gè)分布點(diǎn)總計(jì)753株鉆天柳個(gè)體，其中加格達(dá)奇泔河種群最大，有428株個(gè)體，塔林林場、朗鄉(xiāng)保護(hù)區(qū)、南岔縣、美溪和烏馬河寶宇樣地株數(shù)均少于10株，并且結(jié)果的植株數(shù)量極為稀少，僅占總植株數(shù)量的 6.91% ，除大興安嶺加格達(dá)奇泄河種群林下幼苗數(shù)量較為豐富外，其余種群林下幼苗數(shù)量均偏少。這表明鉆天柳種群的結(jié)果率和幼苗轉(zhuǎn)化率較低，種群規(guī)模較小，面臨較為嚴(yán)峻的瀕危狀況。

運(yùn)用R語言對表示鉆天柳居群遺傳特征的參數(shù)利用普通最小二乘（OLS）回歸、Pearson法和Anova法做逐步回歸、相關(guān)性和單因素方差分析，將鉆天柳6個(gè)ISSR遺傳多樣性指數(shù)引為因變量，分別是Shannon信息指數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)、Nei's多樣性指數(shù)、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)，將每個(gè)采樣點(diǎn)搜集的3個(gè)生境因子，分別是緯度、海拔、郁閉度作為自變量，引入變量 P 值為0.05，剔除變量 P 值0.10，普通最小二乘（OLS）回歸模型較好的擬合了數(shù)據(jù)， R² 值為0.999（表9）。

當(dāng)海拔在 548m 時(shí)，Shannon's信息指數(shù)、Nei's基因多樣性指數(shù)最高，平均比基準(zhǔn)海拔高0.1341和0.0875。生境因子海拔高度與Shannon信息指數(shù)、Nei's基因多樣性指數(shù)與其之間存在顯著的相關(guān)性，隨著海拔的增高呈現(xiàn)不同的相關(guān)關(guān)系。海拔高度對Shannon信息指數(shù)、Nei's基因多樣性指數(shù)的解釋度均為 99.7% ，表明模型非常好地?cái)M合了數(shù)據(jù)。方差分析也都達(dá)到顯著水平 （Plt;0.05） ，引入的截距項(xiàng)系數(shù)也都各自與Nei's基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)顯著相關(guān) （Plt;0.05） ，其余生境因子與遺傳多樣性指標(biāo)無顯著相關(guān)性。

由分析可知，海拔 548m 的樣地位于小興安嶺北部，位于大小興安嶺的交界地帶，物種組成相對豐富、具有寒溫帶和溫帶的生態(tài)特征，基因流較大，表現(xiàn)了較強(qiáng)的遺傳多樣性。

4結(jié)論與討論

4.1結(jié)論

研究結(jié)果顯示，鉆天柳基因組DNA的OD260/OD280值為1.67～1.84，條帶清晰且明亮，無拖尾或彌散現(xiàn)象。這表明鉆天柳基因組DNA未受RNA、蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)的污染，滿足ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的要求。經(jīng)過初篩和復(fù)篩，選出重復(fù)率好、多態(tài)性高、特異性強(qiáng)的10條引物，分別為807、808、809、834、880、881、885、886、890和891，其退火溫度分別為50、50、60.2、53.2、53.2、53.2、54.8、50、50、54.8℃。

鉆天柳居群種群遺傳多樣性相對較豐富，10條ISSR引物多態(tài)條帶百分率（PPB）為 66.67%～100% ，平均值為 91.91% ，在物種層面，多態(tài)性條帶的百分比達(dá)到了 92.22% 。各種群的Shannon表型多樣性指數(shù) （I） 和Nei's基因多樣性指數(shù) （He ）分別為 0.1251～ 0.3588和 0.0828～0.2360 ，平均值分別為0.2277和0.1504。鉆天柳物種水平 I 和 He 分別為0.2202和0.1653，有一定的遺傳變異。當(dāng)海拔在 548m 時(shí)，Shannon's信息指數(shù)、Nei's基因多樣性指數(shù)最高，平均比基準(zhǔn)海拔高0.1341和 0.0875 。

鉆天柳種群間遺傳分化系數(shù) （Nei，1987）G_SI= 0.2303，基因流為1.6709。其種群間遺傳分化程度明顯，居群間有基因流。5個(gè)鉆天柳天然居群保持著較近的親緣關(guān)系，遺傳相似度介于 0.8867～0.9651 之間，平均值為0.9349，遺傳距離介于 0.035 5～ 0.1203。其中，小興安嶺南部與大興安嶺北部居群親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似度為0.8867，遺傳距離為0.1203；而大興安嶺北部居群與大興安嶺南部居群親緣關(guān)系最近，遺傳相似度為0.9651，遺傳距離為0.035 5。

采集的19個(gè)種群50株個(gè)體中有效數(shù)據(jù)為5個(gè)天然居群29株個(gè)體，最終將29株個(gè)體分為4大組群，其中組群1由呼瑪06、09組成;組群2由佳木斯湯原01、02組成；組群3由新林、烏馬河、黑河、湯旺河、朗鄉(xiāng)、加格達(dá)奇和伊美組成；組群4由嘉蔭、阿木爾、南岔、美溪、友好、塔河和圖強(qiáng)組成。

4.2討論

物種的遺傳多樣性水平是其適應(yīng)環(huán)境能力的重要指標(biāo)，遺傳多樣性越高，適應(yīng)環(huán)境的能力通常越強(qiáng)[28]。一般而言，瀕危物種和分布范圍狹窄的物種往往遺傳多樣性較低。研究結(jié)果顯示，鉆天柳具有較高的遺傳多樣性，其多態(tài)性條帶百分率（PPB）平均值為 91.91% ，物種層面的多態(tài)性條帶百分率為 92.22% ，顯著高于植物平均多態(tài)性條帶百分率0 71.02% ）。植物遺傳多樣性的主要來源是遺傳變異與基因交流[25]。鉆天柳的基因流為1.6709，表明其種群間存在一定的遺傳信息交流，但遺傳分化較為顯著。作為溫帶和寒溫帶闊葉混交林河岸生態(tài)系統(tǒng)中的標(biāo)志性物種，鉆天柳可能起源于一個(gè)在溫帶及寒溫帶廣泛分布、具有相對豐富遺傳基礎(chǔ)的祖先。然而，隨著生境片段化的加劇，基因流受到阻礙，鉆天柳仍保留了一部分祖先的遺傳多樣性。此外，作為長壽命、異花授粉的樹種，這些特性有助于維持其遺傳變異水平。因此，綜合分析表明，鉆天柳的遺傳多樣性主要來源于顯著的遺傳變異。

通常認(rèn)為，物種種群的遺傳結(jié)構(gòu)是生活史、交配系統(tǒng)、種子傳播機(jī)制、基因流以及地理分布等多種因素綜合作用的結(jié)果[26]。鉆天柳采用異交交配系統(tǒng)，這可能是其種群內(nèi)遺傳分化較大的重要原因之一。其果實(shí)為蒴果，種子體積微小。在野外考察和采樣過程中發(fā)現(xiàn)，鉆天柳幼苗分布較為分散，由此推測鉆天柳主要依靠風(fēng)力進(jìn)行種子傳播，這可能是其基因流相對較強(qiáng)的主要原因。相關(guān)研究表明，基因流的強(qiáng)弱對物種種群的遺傳分化具有顯著影響[27]。當(dāng)物種的基因流值低于1時(shí)，便無法有效抵消遺傳漂變導(dǎo)致的種群間遺傳分化[28]。鉆天柳的基因流值 M_n=1.6709 ，遠(yuǎn)高于1，表明其不易發(fā)生遺傳漂變，因此對遺傳分化的影響較小。UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，各種群的聚類位置與其地理分布位置并不完全一致。例如，加格達(dá)奇單株與朗鄉(xiāng)單株雖地理距離較遠(yuǎn)，但卻歸為同一群組，而與其地理位置較近的南岔單株和美溪單株則聚為另一群組。這表明，地理隔離對鉆天柳種群的遺傳分化影響并不顯著。

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