熱帶雨林5株生防紅曲霉菌株的分離、鑒定和活性物質(zhì)研究

摘" 要：紅曲霉（Monascus sp.）通常被應(yīng)用于食品以及醫(yī)療行業(yè)，為探究源于熱帶雨林的紅曲霉菌株及其次生代謝產(chǎn)物對植物病原菌的生防潛力，本研究通過對熱帶雨林腐殖質(zhì)樣品中的真菌進行分離鑒定，共獲得5個紅曲霉菌株，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈紅色，具有典型的紅曲霉形態(tài)特征，結(jié)合ITS、LSU、pksKS基因序列測序與分析，分離菌株被鑒定為血紅紅曲霉（Monascus sanguineus）。拮抗試驗結(jié)果表明，5個紅曲霉菌株對香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）、豇豆枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. tracheiphilium）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、木瓜炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）4種常見植物病原菌具有較好的抑制作用。利用不同培養(yǎng)基對紅曲霉進行發(fā)酵，提取次生代謝產(chǎn)物后進行拮抗試驗以及高效液相色譜（HPLC）、核磁共振分析，發(fā)現(xiàn)熱帶雨林紅曲霉菌株在固體培養(yǎng)基，尤其是麥麩培養(yǎng)基上可產(chǎn)生種類豐富且抑菌活性較強的次生代謝產(chǎn)物。進一步通過盆栽試驗證明，紅曲霉可有效降低豇豆枯萎病病情指數(shù)，孢子濃度為10⁶ CFU/mL時具有最好的生防效果。綜上所述，熱帶雨林中分離得到的紅曲霉對植物病害具有較好的生防作用，在大米培養(yǎng)基中發(fā)酵得到的次生代謝產(chǎn)物有較強的抑菌活性，并能有效防控豇豆枯萎病。熱帶雨林生防紅曲霉在植物病害生防應(yīng)用上具有較大的開發(fā)潛力，可為植物病害生物防治提供更豐富的菌株選擇。

關(guān)鍵詞：紅曲霉；次生代謝產(chǎn)物；植物病原菌；生物防治中圖分類號：S476.1 """""文獻標志碼：A

Isolation， Identification and Active Substances Analysis of Five Biocontrol Strains of Monascus sp. from Tropical Rainforest

WANG Lingxuan¹， DU Yi¹， SUN Yihan¹， YANG Yang^2*， YANG Laying^2*

1. School of Life and Health Sciences， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Environment and Plant Protection， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Monascus is usually used in food and medical industries. To explore the biocontrol potential of Monascus and its secondary metabolites against plant biocontrol pathogens， in this study， through the isolation and identification of the fungi from humus samples in the rain forest ， a total of five strains growing well on the potato dextrose agar medium were screened， the colonies were red， with typical Monascus morphological characteristics. The strains were identified as Monascus sanguineus based on the sequencing and analysis of ITS， LSU and pksKS gene sequences， The results of antagonistic experiments showed that the five strains of Monascus had better and more obvious inhibitory effects on Fusarium oxysporum f. sp. cubense， F. oxysporum f. sp. tracheiphilium， Phytophthora capsici， Colletotrichum gloeosporioides. After fermentation of Monascus with different media， high performance liquid chromatography （HPLC） and nuclear magnetic resonance analysis were carried out. It was found that Monascus could produce abundant secondary metabolites with strong antibacterial activity on solid medium， especially on wheat bran medium. The further pot experiment proved that Monascus could effectively reduce the wilt index of cowpea， and the best biocontrol effect was obtained when the spore concentration was 10⁶ CFU/mL. In summary， Monascus isolated from tropical rain forest showed good results of better biocontrol of plant diseases， and the secondary metabolites obtained by fermentation in rice medium had strong antibacterial activity， and could effectively control cowpea blight. Monascus strains isolated from tropical rain forest have great potential in plant disease biocontrol application， which can provide more abundant strains selection for plant disease biocontrol.

Keywords： Monascus sp.; secondary metabolite; phytopathogen; biological control

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.022

紅曲霉（Monascus sp.）是一種腐生絲狀真菌，為真菌門子囊菌綱真子囊菌亞綱紅曲霉屬^[1]，存在于樹木、土壤和堆積物等中。紅曲霉的最適pH通常在3.5～5.5之間，最適生長溫度一般為25～ 35"℃^[2]，廣泛應(yīng)用于中藥、釀酒、食品著色等方面。其味甘，性溫，具有消食和胃、活血止痛、健脾燥胃等功效?，F(xiàn)代研究表明，紅曲霉及其次生代謝產(chǎn)物，如他汀類、脂肪酸、甾醇、色素等成分具有調(diào)節(jié)血脂、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇等藥理作用^[3-4]。同時，紅曲在我國作為食品著色劑和防腐劑已經(jīng)有1000余年歷史，多應(yīng)用于發(fā)酵食物中^[5-6]，紅曲霉以及紅曲中的桔霉素、紅曲色素等均具有抑菌活性，且安全性高^[7-9]。

紅曲霉及其次生代謝產(chǎn)物具有抑菌、調(diào)節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、神經(jīng)保護等生物活性，目前對紅曲霉及其次生代謝產(chǎn)物的研究大多集中在醫(yī)藥領(lǐng)域^[10-11]。紅曲霉的代謝產(chǎn)物對真菌和細菌表現(xiàn)出抗菌活性，其藥理作用廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。有研究表明，從嘉義縣紅樹林濕地分離得到1株紫紅曲霉（M. purpureus）菌株WMD2424具有獨特的抗菌活性^[11]。紅曲霉的培養(yǎng)液對細菌的抗菌效果明顯，尤其對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抗菌能力較強^[12]。MARTINKOVA等^[13]研究發(fā)現(xiàn)紅曲霉色素提取物對細菌、酵母和絲狀真菌具有抑制作用。余濟源^[14]發(fā)現(xiàn)紅曲黃色素能夠抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。任浩^[15]研究發(fā)現(xiàn)紅曲黃色素對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有較弱的抑菌性，紅曲紅色素對枯草芽孢桿菌具有較弱的抑菌性。紅曲霉及其次生代謝產(chǎn)物的抗菌性和安全性表明，紅曲霉及其次生代謝產(chǎn)物是植物病害生物防治的良好材料。而目前紅曲霉的研究大多集中在醫(yī)藥及食品方面，尚無紅曲霉及其次生代謝產(chǎn)物在植物病害生物防治方面的研究和應(yīng)用。鑒于紅曲霉在醫(yī)藥與食品中具有較高的生物安全性，且其對多種微生物表現(xiàn)出顯著的抑菌活性，探討其在植物病害生物防治中的應(yīng)用潛能，以及對促進植物的生長發(fā)育或增強抗逆性等方面的作用，為開發(fā)新型生物防治劑提供理論依據(jù)，并為進一步探索紅曲霉在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

海南熱帶雨林是我國分布最集中、類型最多樣、保存最完好、連片面積最大的大陸性島嶼型熱帶雨林，是島嶼型熱帶雨林的代表，是熱帶生物多樣性和遺傳資源的寶庫和海南島生態(tài)安全屏障，具有國家代表性和全球保護意義。海南熱帶雨林中具有大量豐富的大型真菌^[16]、芽孢桿菌^[17]以及酵母種質(zhì)資源^[18]。相關(guān)微生物研究顯示，在海南熱帶雨林土壤及特有珍稀動物長臂猿排泄物中均存在豐富多樣的微生物種群^[19]。表明海南熱帶雨林中蘊含著種類繁多的微生物，是一個有待開發(fā)和發(fā)掘的微生物種質(zhì)資源寶藏。

本研究通過對霸王嶺雨林腐殖質(zhì)樣品進行菌株分離，利用形態(tài)學(xué)觀察及多基因分子鑒定，鑒定得到5株紅曲霉菌株；通過平板拮抗試驗、發(fā)酵培養(yǎng)基篩選，得到防效較好的菌株以及最適培養(yǎng)基，并利用盆栽試驗驗證其對豇豆枯萎病的生防效果。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 供試病原菌" 香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）、豇豆枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. tracheiphilium）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、木瓜炭疽菌（Colleto-trichum gloeosporioides）、豇豆棒孢菌（Coryne-spora cassiicola）、小麥赤霉病菌（F. grami-nearum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、蘆筍擬莖點霉菌（Phomopsis asparagi）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所微生物資源與利用實驗室提供。

1.1.2" 供試豇豆" 豇豆品種為翠龍3號，豇豆種子購于北京中農(nóng)綠亨科技有限公司。盆栽自然土采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所園圃。

1.1.3" 供試培養(yǎng)基" PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15.0 g、水1000 mL；大米培養(yǎng)基：大米50 g、水50 mL；麥麩培養(yǎng)基：麥麩和玉米粉的混合基質(zhì)（總質(zhì)量50 g，質(zhì)量比1∶1），其中麥麩與玉米粉各25 g、水50 mL；MEA培養(yǎng)基：麥芽提取物15.0 g、蛋白胨1.0 g、水1000"mL、pH 7.0；PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、水1000 mL；CYA培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g、蔗糖30.0 g、瓊脂15.0 g、水1000 mL、NaNO₃ 3.0 g、KH₂PO₄ 1.0"g、KCl 0.5"g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、FeSO₄·7H₂O 0.01 g。

1.1.4" 引物" 引物V9G、LS266、LR0R、LR5、pks1、pks2及其序列^[20]見表1。

1.1.5" 主要儀器" PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、電泳槽、搖床、28"℃培養(yǎng)箱、37"℃培養(yǎng)箱、旋蒸機、超凈臺、血球計數(shù)板、高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.2" 方法

1.2.1" 樣品采集和菌株分離" 于2023年9月采集霸王嶺熱帶雨林腐殖質(zhì)樣品。帶回實驗室采用稀釋涂布分離法分離樣品中的各種真菌。將不同形態(tài)的菌落用劃線分離法進行純化，重復(fù)上述步驟直至得到單菌落，然后轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共獲得50株真菌菌株，對獲得的菌株進行編號。置于28"℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，初步篩選出疑似紅曲霉的目標菌株5株。

1.2.2" 紅曲霉菌株的形態(tài)觀察" 采用插片法對菌落進行預(yù)處理，于正置顯微鏡下觀察菌株的菌絲和孢子的形態(tài)^[20]。

1.2.3" 紅曲霉菌株的分子鑒定" （1）DNA提取。取對數(shù)生長期的1.2.1篩選得到的目標菌株培養(yǎng)液置于5 mL離心管中，在12 000 r/min條件下離心2 min；在沉淀中加入1.7 mL TE緩沖液，然后依次加入1.8 g溶菌酶、10% SDS 90 μL、20 mg/mL蛋白酶K 9 μL，于37"℃水浴鍋中恒溫1 h；加入6 mol/L NaCl 300"μL，CTAB/NaCl 240"μL，于65"℃水浴鍋中恒溫10 min；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12 000 r/min離心5 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一個離心管中，加入0.6體積異丙醇使DNA沉淀，12 000 r/min離心1 min；棄上清液，加入70%乙醇洗滌2次，溶于TE緩沖液，置于–20"℃保存，備用。

（2）序列擴增及PCR檢測。以通用引物V9G和LS266對5個目標菌株ITS區(qū)進行擴增，以引物LR5和LR0R對LSU區(qū)進行擴增，設(shè)計引物pks1和pks2用于擴增目標菌株pksKS區(qū)。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×Es Taq MasterMix （Dye） 25"μL，ddH₂O 17.5 μL，DNA模板4.5 μL，上下游引物各1.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94"℃ 預(yù)變性5"min；94"℃變性45 s，53"℃退火30 s，72"℃延伸105 s，35個循環(huán)；72"℃終延伸10 min。

（3）系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因測序。測序得到相應(yīng)的ITS、LSU和pksKS堿基序列。利用MEGA（2024）軟件分別與參考紅曲霉菌株^[20]的ITS、LSU和pksKS序列構(gòu)建基因發(fā)育樹。

1.2.4" 紅曲霉菌株抑菌活性分析 "采用平板對峙法檢測目標紅曲霉菌株對香蕉枯萎病菌、豇豆枯萎病菌、辣椒疫霉菌、木瓜炭疽菌4種重要植物病原菌的抑菌活性。利用打孔器打取直徑為5 mm的靶標病原菌菌餅置于PDA平板中央；然后取不同紅曲霉菌株分別等距離、等大小接種于靶標菌病原菌菌餅左右兩側(cè)；以不接紅曲霉只接病原菌作對照（CK）。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)。接種后從第2天開始每天測量靶標病原菌菌株的菌落直徑（d_B）和對照組靶標病原菌菌落直徑（d_CK），按以下公式計算紅曲霉目標菌株的抑菌率：抑菌率=（d_CK–d_B）/d_CK× 100%。篩選出綜合抑菌效果最強的1株紅曲霉菌株進行后續(xù)試驗。對篩選到的這株紅曲霉菌株作進一步的抑菌活性試驗，分析該紅曲霉菌株對豇豆棒孢菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、蘆筍擬莖點霉菌、大麗輪枝菌、稻瘟病病菌的拮抗作用。

1.2.5" 紅曲霉抑菌最適培養(yǎng)基篩選" （1）紅曲霉次生代謝產(chǎn)物抑菌試驗。將1.2.4中篩選到的紅曲霉菌株菌液分別接種于PDB培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基、CYA培養(yǎng)基、麥麩培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基中，發(fā)酵28 d。發(fā)酵結(jié)束后，使用等體積乙酸乙酯浸泡抽提，重復(fù)抽提3次，過濾收集乙酸乙酯相，利用發(fā)酵旋蒸機旋干；使用乙酸乙酯溶解，獲取其代謝產(chǎn)物粗提物。采用平板對峙法，通過觀察病原菌的生長情況判斷代謝產(chǎn)物粗提物對豇豆枯萎病菌、辣椒疫霉菌、木瓜炭疽菌的抑菌活性。

（2）紅曲霉次生代謝產(chǎn)物豐富度評價。將色譜柱安裝在液相色譜儀上，注意流路方向和密封性。使用注射器將樣品紅曲霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物液注入儀器，并通過連接樣品回路的閥門與流動相混合，進樣量為10"μL。色譜柱型號：C??-MS-Ⅱ 4.6"mm× 250 mm。選擇甲醇-水為流動相，流速為3"mL/min，全波長檢測，波長為200～580 nm，流動相洗脫梯度為20%～100%，洗脫時間為25 min。然后進行過濾和脫氣處理。分析結(jié)束后，在HPLC軟件中收集得到色譜圖，根據(jù)色譜圖對不同培養(yǎng)基下發(fā)酵得到的紅曲霉菌產(chǎn)物進行豐富度分析。同時將菌體的發(fā)酵產(chǎn)物溶于氘代甲醇后做核磁共振分析。氘代甲醇的溶劑峰為3.31 mg/L，水峰為4.87"mg/L。利用分析液相色譜和核磁共振的結(jié)果，初步通過出峰數(shù)量判斷不同條件下紅曲霉次生代謝產(chǎn)物的豐富度，結(jié)合平板對峙試驗結(jié)果，明確合適的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.6" 盆栽防效試驗 "（1）制備豇豆枯萎病病原菌孢子懸液。將PDA平板上的豇豆枯萎病病原菌菌落接種至200"mL的PDB培養(yǎng)基中，于28"℃搖床中培養(yǎng)5"d。用血球計數(shù)板計算懸液中的孢子數(shù)，得到孢子懸液的濃度，然后稀釋至10⁶ CFU/mL，備用。

（2）制備生防菌紅曲霉菌體懸浮液。將1.2.4中篩選到的菌株接種至200 mL的CYA培養(yǎng)基中，于28"℃搖床中培養(yǎng)3 d。用血球計數(shù)板計算懸液中的孢子數(shù)，得到孢子懸液的濃度，分別稀釋至10⁹、10⁸、10⁶、10⁴ CFU/mL，備用。

（3）盆栽試驗。選取顆粒飽滿、大小一致的豇豆種子，有序播種于經(jīng)121"℃、30 min條件下滅菌2次后自然冷卻的自然土中，每盆（口寬20"cm，高15 cm，底寬13 cm）15顆種子，共計6盆，澆水并置于自然條件下，等待發(fā)芽。每盆設(shè)置以下處理：病原菌+生防菌10⁴ CFU/mL（F+ 10⁴S）、病原菌+生防菌10⁶ CFU/mL（F+10⁶S）、病原菌+生防菌10⁸ CFU/mL（F+10⁸S）、病原菌+生防菌10⁹ CFU/mL（F+10⁹S）、清水對照（CK）、病原菌對照（F）。播種17 d后測量不同處理豇豆的株高、根長、葉綠素含量，觀察并記錄發(fā)病情況，計算發(fā)病率，發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%;參考文獻[21]制作病情分級標準圖（圖1）及分級描述（表2），計算病情指數(shù)^[21]和防治效果^[22]，病情指數(shù)=∑（各株病情分級）/（總株數(shù)×最高病情分級）×100，防治效果=（CK病情指數(shù)–處理組病情指數(shù)）/CK病情指數(shù)×100%。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

紅曲霉菌株抑菌活性分析以及紅曲霉次生代謝產(chǎn)物抑菌試驗部分所有測定數(shù)據(jù)均進行3次生物學(xué)重復(fù)。測定結(jié)果以平均值±標準偏差表示，利用SPSS 27.0.1軟件分析并處理數(shù)據(jù)，以Plt;0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 紅曲霉形態(tài)觀察

對初步篩選出的5株疑似紅曲霉目標菌株采用插片法處理，然后利用正置顯微鏡觀察菌株的菌絲和孢子形態(tài)，菌株6-1和菌株6-2的菌絲上生長著成串的孢子，且成串孢子數(shù)量較多；菌株6-4和菌株6-6的菌絲著生單個孢子，數(shù)量較少；菌株6-5的菌絲較細，基本不長孢子（圖2）。

2.2" 紅曲霉分子鑒定

將PCR產(chǎn)物進行測序后獲得的序列在NCBI網(wǎng)站進行比對。同時下載參考菌株的堿基序列^[20]，制作ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）、LSU序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）和pksKS序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。通過分析系統(tǒng)發(fā)育樹可知，根據(jù)保守基因ITS序列和LSU序列初步判斷目標菌株均與CGMCC 3.5845相似，屬于血紅紅曲霉（M. sanguineus），其中菌株6-6可確認為血紅紅曲霉（M. sang-uineus），其余菌株與血紅紅曲霉的親緣性按照菌株6-5、菌株6-4、菌株6-2、菌株6-1的順序依次減弱。結(jié)合LSU序列結(jié)果，菌株6-1與黃色紅曲霉（M. flavipigmentosum）CBS 142366、URM 7534存在一定次生代謝產(chǎn)物的相似性，但是暫時無法準確判斷菌株6-1屬于血紅紅曲霉還是黃色紅曲霉。根據(jù)pksKS序列，可推測菌株6-4、菌株6-5與目標菌株CGMCC 3.2848相似，屬于紅色紅曲血紅雜種（M. ruber×sanguineus）。ITS序列和LSU序列為保守基因，pksKS序列存在較多變異可能，因此由ITS序列和LSU序列得出的結(jié)論可信度和參考價值更高。

2.3" 紅曲霉菌株抑菌活性

通過研究5株紅曲霉菌株對4種重要病原菌的抑菌活性表明，菌株6-4對豇豆枯萎病菌的拮抗作用較弱，抑菌率僅為10.84%，而菌株6-1、菌株6-2、菌株6-5、菌株6-6對豇豆枯萎病菌的拮抗作用較強，抑菌率均大于15.00%；5株紅曲霉菌株對香蕉枯萎病菌的抑菌率在20.00%以上；菌株6-2、菌株6-4、菌株6-5、菌株6-6對辣椒疫霉菌的抑菌率較高，總體抑制效果良好；菌株6-5和菌株6-6對木瓜炭疽菌的拮抗作用較為顯著（表3，圖6）。通過計算目標菌株對4種病原菌的抑

菌率總和可知，菌株6-5、菌株6-6的總體抑菌率較好。

選取菌株鑒定明確且抑菌效果較好的菌株6-6作進一步的抑菌活性試驗，研究發(fā)現(xiàn)紅曲霉菌株6-6對蘆筍擬莖點霉菌、豇豆棒孢菌、大麗輪枝菌以及稻瘟病菌均有一定程度的抑制作用，但對小麥赤霉病菌和水稻紋枯病菌抑菌效果較弱（表4，圖7）。

2.4" 紅曲霉抑菌最適培養(yǎng)基篩選

選取形態(tài)觀察、分子鑒定和拮抗試驗結(jié)果較好的菌株6-6作為后續(xù)研究目標菌株。通過平板對峙試驗探究紅曲霉菌株6-6在不同培養(yǎng)基條件下的發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對豇豆枯萎病菌、木瓜炭疽菌和辣椒疫霉菌的拮抗作用（圖8）。結(jié)果表明，菌株6-6在PDB培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物對病原菌的抑制作用較弱，在麥麩培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物對病原菌抑制效果顯著，與2.3中菌落平板抑菌率（使用的是PDA培養(yǎng)基）相比，麥麩培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物對豇豆枯萎病菌的抑菌率提升了216.79%；與液體培養(yǎng)基發(fā)酵相比，麥麩培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物抑菌率顯著較高（表5）。因此，利用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)紅曲霉菌株6-6得到的次生代謝產(chǎn)物對植物病原菌產(chǎn)生抑制作用更顯著。

圖9為不同培養(yǎng)基中菌株6-6發(fā)酵產(chǎn)物的高效液相色譜圖，縱坐標為不同波長（nm），橫坐標為時間（min），不同顏色表示某個時間內(nèi)，不同波長下的吸光值，由淺到深表示吸光值由小到大，吸光值越大，顏色越深，物質(zhì)的含量越高。結(jié)果表明，相同洗脫條件下，色譜圖中大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的峰數(shù)最多，豐富度最高。核磁結(jié)果（圖10）與HPLC結(jié)果相似，大米培養(yǎng)基和麥麩培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物中物質(zhì)豐富度較高，PDB培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物物質(zhì)豐富度最低。大米培養(yǎng)基和麥麩培養(yǎng)基對病原菌的抑制效果優(yōu)于其余液體培養(yǎng)基，而麥麩培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物對豇豆枯萎病菌的抑菌率遠大于其余培養(yǎng)基（表5）。結(jié)合上述結(jié)果確定麥麩培養(yǎng)基為紅曲霉發(fā)酵最適培養(yǎng)基，其發(fā)酵產(chǎn)物較為豐富，且抑菌效果最好。

2.5" 盆栽防效試驗

試驗結(jié)果表明，不同濃度的生防菌紅曲霉菌株6-6對盆栽豇豆的促生效果不明顯（表6），而施用不同濃度的紅曲霉菌株6-6可以有效控制豇豆枯萎病菌的侵害。10⁴S處理的病害植株葉片明顯變黃，防治效果較差；10⁶S處理的植株病害明顯改善，發(fā)病率與病情指數(shù)均明顯降低，防治效果達到42.35%，相對較高（表7）。

綜合發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果認為，生防菌紅曲霉菌株6-6的最佳施用濃度為10⁶"CFU/mL，其防治效果最好，并且對植株的生長未造成傷害。施用濃度過低，如10⁴ CFU/mL，則防治效果較差，若施用濃度過高，如10⁹ CFU/mL，則對植物的生長狀態(tài)造成損害，這可能是由于滲透壓太高從而影響了植物的正常生理狀態(tài)。

3" 討論

本研究在熱帶雨林腐殖質(zhì)中分離得到紅曲霉菌株。目前，國內(nèi)有關(guān)紅曲霉的研究大多從紅曲米、豆腐乳或者相關(guān)發(fā)酵食品中分離獲得，如徐杏敏^[23]在農(nóng)家自制腐乳和農(nóng)家自制酒糟中分離獲得紅曲霉菌株，張艷艷等^[24]在豆腐乳和紅曲米中分離得到紅曲霉，任浩^[15]在相似的紅曲米和紅腐乳中分離得到紅曲霉。而本研究從熱帶雨林腐殖質(zhì)中分離獲得紅曲霉，在紅曲霉菌株來源上進行擴充。

目前紅曲霉及其次生代謝產(chǎn)物抑菌活性研究多集中于人類病原菌，涉及農(nóng)業(yè)病原菌的研究較少。余濟源^[14]將不同濃度的紅曲素發(fā)酵液分別與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)紅曲黃色素能夠抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，且對革蘭氏陽性菌的抑制能力較優(yōu)。任浩^[15]探究了紅曲素對4種細菌和6種真菌的抑菌性能，發(fā)現(xiàn)紅曲黃色素對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性較弱，紅曲紅色素對枯草芽孢桿菌的抑菌性較弱；而在6種真菌的抑制試驗中，紅曲紅色素、黃色素對黃瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌、楊樹枯萎病菌以及草酸青霉均有不同程度的抑菌活性，其中對番茄早疫病菌的抑菌活性最強。張紅林等^[25]通過牛津杯法測定紅曲米的抑菌活性，探究不同產(chǎn)地紅曲米的抑菌效果，結(jié)果表明相同濃度紅曲米的提取物對細菌的抑菌效果普遍優(yōu)于真菌，抑菌強度依次為枯草芽孢桿菌gt;大腸桿菌gt;釀酒酵母菌。盡管上述研究為紅曲霉的抑菌應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但仍存在一定局限性：現(xiàn)有研究多聚焦于食源性致病菌，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，或常見腐生真菌，而對農(nóng)業(yè)領(lǐng)域重要的植物病原菌缺乏系統(tǒng)研究。本研究探究了紅曲霉對香蕉枯萎病菌、豇豆枯萎病菌、辣椒疫霉菌、木瓜炭疽菌4種常見的植物病原菌的抑菌作用，填補了該領(lǐng)域的研究空白，并為開發(fā)紅曲源生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。同時研究了紅曲霉對豇豆棒孢菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、蘆筍擬莖點霉菌、大麗輪枝菌、稻瘟病病菌的抑菌活性，表明紅曲霉對大多數(shù)植物病原菌均有抑菌效果，對豇豆枯萎病菌、辣椒疫霉病菌、木瓜炭疽病菌、蘆筍擬莖點霉菌、大麗輪枝菌、稻瘟病病菌均有較明顯的抑菌效果，說明紅曲霉的抑菌效果在植物病原菌中對象廣、范圍大。

紅曲霉次生代謝產(chǎn)物功能豐富，成分復(fù)雜。目前已知的次生代謝產(chǎn)物有紅曲色素、莫納可林K、紅曲黃色素、麥角甾醇、γ-氨基丁酸以及桔霉素等。紅曲色素是紅曲霉的主要次生代謝產(chǎn)物之一，作為一種天然色素，紅曲色素已經(jīng)得到了廣泛的運用^[26]。1979年，遠藤章首次提取出莫納可林K并發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)可以抑制膽固醇的合成，紅曲中的多種他汀類似物均被提取出，并發(fā)現(xiàn)它們均具有抑制膽固醇合成的生物活性^[2]。李明起等^[27]通過硅膠柱層析技術(shù)分離了紅曲米中的紅曲黃色素、醇溶性紅曲紅色素、洛伐他汀以及水溶性紅曲紅色素4種組分，其中洛伐他汀是治療高血脂、冠心病的有效且最安全的藥物，具有抗病毒、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)等作用。劉科^[2]探究了洛伐他汀的最佳提取條件，還采用液相色譜法測定了發(fā)酵產(chǎn)物中的麥角甾醇和桔霉素含量。麥角甾醇可以抑制人體對膽固醇的吸收從而達到降血脂的作用^[28]，在陽光照射下麥角甾醇可轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D^[29]。徐冬云^[30]通過純化紅曲霉菌液得到γ-氨基丁酸粗提物，并探究了γ-氨基丁酸的降血脂作用。紅曲霉大米發(fā)酵代謝產(chǎn)物降低了TNF-α刺激的內(nèi)皮粘附性，下調(diào)了活性氧（ROS）的形成和選擇素的表達，從而能夠緩解臨床的動脈粥樣硬化疾病^[31]。由于桔霉素有致畸作用^[32]，任浩^[15]通過HPLC方法對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素含量進行測量，選擇低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉進行Pig E基因敲除，嘗試通過基因工程技術(shù)選育高產(chǎn)紅曲色素且抑制桔霉素合成的工程菌株。在目前的研究中，紅曲霉及其代謝產(chǎn)物的研究應(yīng)用多集中在食品或者藥理作用方面，如與膽固醇相關(guān)的莫納可林K和麥角甾醇，與降血脂有關(guān)的洛伐他汀、麥角甾醇和γ-氨基丁酸，而缺乏紅曲霉及其代謝產(chǎn)物應(yīng)用于植物生防領(lǐng)域的相關(guān)研究，并且尚無抑制植物病原菌的活性物質(zhì)。

生防菌作為生物防治的重要資源，其活性物質(zhì)的合成與功能表達高度依賴于培養(yǎng)條件的精細調(diào)控。環(huán)境因子通過影響菌株的代謝通路選擇、酶活性和基因表達，最終導(dǎo)致產(chǎn)物種類及生物活性的顯著差異，這一特性為定向開發(fā)高效生防制劑提供了科學(xué)依據(jù)。生防假單胞菌FD6在LB培養(yǎng)基中對番茄灰霉菌的抑菌活性最高，并通過優(yōu)化培養(yǎng)條件使其抑制率提高了近40%^[33]。培養(yǎng)條件影響植物乳酸菌形成的納米硒粒徑，從而影響不同細菌的抑菌效果^[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，從熱帶雨林腐殖質(zhì)中分離得到的紅曲霉及其次生代謝產(chǎn)物對植物病原菌有一定的抑制作用，利用麥麩培養(yǎng)基發(fā)酵的次生代謝產(chǎn)物的抑菌效果最佳且豐富度高。

4" 結(jié)論

基于ITS序列和LSU序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，目標菌株均歸屬于血紅紅曲霉。通過平板對峙試驗進一步驗證，從熱帶雨林環(huán)境中分離得到的紅曲霉菌株對多種常見植物病原菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性。研究結(jié)果初步證實了該菌株在植物病害生物防治領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值，為其后續(xù)開發(fā)為生防制劑提供了科學(xué)依據(jù)。采用液體培養(yǎng)基（MEA培養(yǎng)基、CYA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基）和固體培養(yǎng)基（大米培養(yǎng)基、麥麩培養(yǎng)基）對紅曲霉進行發(fā)酵，并對其發(fā)酵產(chǎn)物進行抽提，探究不同培養(yǎng)基發(fā)酵條件下紅曲霉次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性及豐富度。結(jié)果表明紅曲霉的次生代謝產(chǎn)物對常見的植物病原菌具有較好的抑菌作用；通過盆栽試驗，根據(jù)葉片的葉綠素含量、株高、根長以及發(fā)病情況可看出目標紅曲霉菌株對豇豆枯萎病具有一定的防治作用，雖然對植株無明顯的促生效果，但也未對植株的生長造成傷害。

本研究結(jié)果表明紅曲霉的次生代謝產(chǎn)物對常見的植物病原菌有較好的抑菌作用，且在固體培養(yǎng)基中可產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，從熱帶雨林分離出的紅曲霉在適當?shù)臐舛认履軌驅(qū)崿F(xiàn)對以豇豆枯萎病菌為代表的植物病原菌的抑制效果，具有一定生防的潛力。

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