副地衣芽孢桿菌LB3促生抑菌功能研究及全基因組分析

中圖分類號：S182 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）10-0267-08

地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）具有重要的研究和應用價值，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和工業(yè)等方面均有廣泛的應用[1-3]。副地衣芽孢桿菌（Bacillusparalicheniformis）為地衣芽孢桿菌的近緣種，根據(jù)基因組特征和表型方面的差異，將副地衣芽孢桿菌確認為一個新種。副地衣芽孢桿菌可以產(chǎn)多種酶類，包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等，同時也是一類產(chǎn)表面活性素、多黏菌素、桿菌霉素等脂肽類物質的芽孢桿菌[4]。研究表明，副地衣芽孢桿菌不僅能夠抑病防蟲[5-7]，還能夠調(diào)節(jié)根系微生物群落結構，促進植物生長[8-9]，且在食物防腐、畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖、飼料添加等方面具有一定潛力，表現(xiàn)出較高的應用價值和經(jīng)濟價值[10]

近年來，隨著測序技術的發(fā)展，實現(xiàn)了高效解析微生物基因組，為微生物的功能挖掘和代謝機理的研究提供了重要方法。陳志娜等通過對植物乳桿菌CHEN1進行全基因組測序，挖掘出其潛在的細菌素基因簇，為該菌及抑MRSA細菌素的開發(fā)與應用提供了生物信息基礎[1]。高娜等利用全基因組分析自絮凝細菌Massiliasp.W12，發(fā)現(xiàn)其可以合成聚羥基丁酸酯（PHB），這為生物絮團系統(tǒng)的功能強化提供了候選菌株[12]。劉坤等對人參細菌性軟腐病致病菌PseudomonasglycinaeXJFL-1進行毒力基因預測，發(fā)現(xiàn)該菌編碼了豐富的PCWDEs基因，同時具有獨特的與致病相關的Ⅱ型和Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應因子[13]

筆者所在課題組前期從自然堆肥發(fā)酵的牛糞秸稈中分離出1株芽孢桿菌，經(jīng)過16SrRNA基因序列相似性鑒定確定該菌為副地衣芽孢桿菌（Bacillusparalicheniformis），編號為LB3。本研究通過體外促生指標測定和體內(nèi)促生試驗明確促生功能，并用藜麥葉斑病病原菌（Alternariaalternata）檢測LB3的抑菌效果，結合全基因組分析，探究其促生抑菌機理、挖掘功能基因，以期為LB3菌株的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

副地衣芽孢桿菌（Bacillusparalicheniformis）LB3，為實驗室保藏菌種，于2022年10月從河北省承德市灤平縣自然發(fā)酵堆肥的牛糞秸稈中分離篩選獲得；藜麥葉斑病病原菌（Alternariaalternata），由植物病理實驗室提供。

LB肉湯、營養(yǎng)瓊脂（NA）、營養(yǎng)肉湯（NB）、酪蛋白瓊脂、CAS檢測培養(yǎng)基均為海博生物技術有限公司產(chǎn)品。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基： 0.5g/L 氯化鉀， 0.5g/L 硫酸鎂， 1.0g/L 磷酸氫二鉀， 3.0g/L 硝酸 鈉， 5.0g/L 羧甲基纖維素鈉， 20.0g/L 瓊脂

蛋白脈氨化培養(yǎng)基： 5.0g/L 蛋白脈， 0.5g/L 磷酸氫二鉀， 0.25g/L 氯化鈉， 0.5g/L 硫酸鎂，0.01g/L 硫酸亞鐵。

1.2促生指標測定

1.2.1產(chǎn)鐵載體能力測定 將活化好的菌株劃線接種于營養(yǎng)瓊脂（NA）上，待菌落長出后，挑取單菌落點接于CAS檢測培養(yǎng)基上，每個處理重復3次，置于25^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，觀察菌株產(chǎn)水解圈情況

1.2.2產(chǎn)蛋白酶能力測定將活化好的菌株劃線接種于營養(yǎng)瓊脂（NA）上，待菌落長出后，挑取單菌落點接于酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，每個處理重復3次，置于 25°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，觀察菌株產(chǎn)透明圈情況。

1.2.3產(chǎn)纖維素酶能力測定將活化好的菌株劃線接種于營養(yǎng)瓊脂（NA）上，待菌落長出后，挑取單菌落點接于甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基上，每個處理重復3次，置于 25^°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，經(jīng)剛果紅染色、NaCI溶液漂洗后，觀察菌株產(chǎn)水解圈情況

1.2.4分泌吲哚乙酸（IAA）能力測定采用Salkowski比色法定性檢測菌株分泌IAA情況。將活化好的LB3菌種接種至含有L-色氨酸的LB肉湯中，于 25^°C 下振蕩培養(yǎng)3d，取 100μL 培養(yǎng)液滴于白色陶瓷板上，加人等量Salkowski比色液，并取100μL 未接菌的空白培養(yǎng)基為對照，每個處理重復3次，于室溫下避光反應 30min ，觀察顏色變化，變紅則為陽性，說明能夠分泌IAA。

1.2.5產(chǎn) NH₃ 能力測定將活化好的菌株按 1% 的接種量接種至蛋白肺氨化液體培養(yǎng)基中，于 25^°C 下振蕩培養(yǎng) ^48h 后，取 200μL 培養(yǎng)液滴于白色陶瓷板上，滴加納氏試劑，以未接菌的培養(yǎng)基為對照，每個處理重復3次，觀察若有黃色或者棕紅色沉淀，說明有產(chǎn) NH₃ 能力。

1.3對擬南芥根系發(fā)育的影響

參考康品的試驗方法[14]，將擬南芥種子處理后，點接至方形固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為 16h/8h （光照/黑暗），豎直培養(yǎng)7d后，挑選生長一致的擬南芥轉接至含有無菌濾紙的新方形培養(yǎng)血中，該濾紙經(jīng)Hogland營養(yǎng)液浸濕，每Ⅲ5株，重復3次。制備LB3菌懸液，用無菌水調(diào)整菌濃度至 10⁸CUF/mL ，取200μL 菌懸液沿擬南芥幼苗根部均勻滴加，以無菌水為空白對照。繼續(xù)豎直培養(yǎng)7d，測量主根長度并計算不定根數(shù)。

1.4抑菌試驗

將活化后的菌株LB3按 1% 的接種量接種至營養(yǎng)肉湯（NB）中， 25°C 振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以藜麥葉斑病病原菌（Alternariaalternata）為供試病原菌，接種至PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長滿平板，用打孔器打取新鮮培養(yǎng)的病原菌菌餅，接種于新的PDA平板右側，PDA平板左側放入無菌牛津杯，并在牛津杯中加入 100μL 菌懸液，置于 25°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理重復3次，觀察菌株抑菌情況。

1.5全基因組測序分析

1.5.1基因組測序提取菌株DNA，并檢測 DNA總量和完整性。利用第二代、第三代分子測序技術，對文庫進行測序。將原始下機數(shù)據(jù)過濾生成高質量序列：接頭污染去除、質量過濾、長度過濾、模糊堿基N過濾。對三代下機數(shù)據(jù)拼裝，并用二代數(shù)據(jù)進行糾錯，拼接獲得完整序列。

1.5.2基因預測與功能注釋使用GeneMarkS軟件預測LB3菌株的全基因序列；利用軟件antiSMASH預測LB3菌株的次級代謝產(chǎn)物相關基因簇[15]；LB3菌株的CAZy 酶類基因采用hmmscan 軟件進行預測[16] 。

2 結果與分析

2.1 促生指標檢測結果

通過對LB3菌株促生指標的檢測，發(fā)現(xiàn)該菌在CAS檢測培養(yǎng)基、酪蛋白培養(yǎng)基和羚甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上均有明顯的透明圈，說明該菌能夠產(chǎn)鐵載體，可以分泌蛋白酶和纖維素酶（圖1-A、圖1-B、圖1-C）；Salkowski比色后反應液顏色略變紅但不明顯，說明該菌產(chǎn)IAA能力較弱（圖1-D）；產(chǎn) NH₃ 顯色反應液有棕紅色沉淀，說明該菌具有產(chǎn) NH₃ 能力（圖1-E）。

2.2對擬南芥根系發(fā)育的影響

LB3菌株處理后觀察擬南芥生長情況，測量幼苗主根長并計算不定根數(shù)，結果見表1和圖2。經(jīng)LB3菌懸液處理后的擬南芥幼苗主根長顯著增加，但不定根數(shù)與對照組沒有顯著差異。

2.3抑菌能力檢測結果

與對照相比，LB3菌株產(chǎn)生抑菌帶，說明該菌對

藜麥葉斑病病原菌（Alternariaalternata）具有抑制作用（圖3）。

2.4 基因組分析

2.4.1基因組信息測序數(shù)據(jù)經(jīng)過糾錯、拼裝等程序后獲得菌株基因組信息。LB3菌株基因組呈一條環(huán)狀閉合DNA（圖4），大小為 4450573bp，G+（ 含量為 45.94% ，N50的長度為20648bp，N90的長度為 4019bp 。共預測到蛋白質編碼基因4567個，tRNA基因82個，5SrRNA基因、16SrRNA基因、23SrRNA基因各8個，ncRNA基因108個。

2.4.2基因組注釋將預測到的編碼基因與多個數(shù)據(jù)庫進行比對，如圖5所示，主要注釋到NR、COG、KEGG、Swiss-Prot、GO、Pfam的基因數(shù)量分別為 4552，3853，2362，3802，3094，3682 個，比例分別為99. 67% 84.37% 、51. 72% .83. 25% 67.75% 180.62% 。

2.4.3次級代謝產(chǎn)物基因簇分析次級代謝產(chǎn)物是指微生物生長到一定階段后合成的對微生物生命活動無明確功能的物質，但往往具有一定的應用價值。使用antiSMASH軟件尋找副地衣芽孢桿菌LB3次級代謝產(chǎn)物相關基因簇分布情況，共預測到12個次級代謝產(chǎn)物合成相關基因簇，主要包括非核糖體肽合成酶（NRPS）非核糖體肽金屬載體（NRP-metallophore）、第二類羊毛硫肽（lanthipeptide-class-Ⅱ）、環(huán)內(nèi)酯自誘導物（cyclic-lactone-autoinducer） ??β-? 內(nèi)酯（betalactone）環(huán)二肽合成酶（CDPS）鐵載體（NI-siderophore）等類型（表2）。其中非核糖體肽合成酶生物合成基因簇與地衣（菌）素（lichenysin NRP）、桿菌肽（bacitracin NRP）和bacillibactin、bacillibactinE、bacillibactinFNRP生物合成基因簇均有 100% 的相似度;第二類羊毛硫肽和環(huán)內(nèi)酯自誘導物生物合成基因簇與amyloliquecidinGF610RiPP生物合成基因簇有 93% 的相似度； β- 內(nèi)酯生物合成基因簇與豐原（菌）素（fengycinNRP）生物合成基因簇有 86% 的相似度;環(huán)二肽合成酶生物合成基因簇與普切明酸（pulcherriminicacidOther）生物合成基因簇有 66% 的相似度;NI-siderophore鐵載體生物合成基因簇與schizokinenOther鐵載體生物合成基因簇有 60% 的相似度。

2.4.4碳水化合物活性酶（CAZy）基因分析CAZy碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫，主要包含糖苷鍵降解、修飾及生成相關的酶類家族，分為5大類：糖苷水解酶（clycosidehydrolases，GH）、糖基轉移酶（glycosyltransferases，GT）多糖裂解酶（polysaccharidelyases，PL）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CE）和輔助活性酶（auxiliaryactivities，AA），同時該數(shù)據(jù)庫還包含與碳水化合物結合相關的酶（carbohydrate-bindingmodules，CBM）。副地衣芽孢桿菌LB3在CAZy數(shù)據(jù)庫中注釋到的基因數(shù)量為180個，其中糖苷水解酶注釋到的基因數(shù)量最多，為75個；其次是糖基轉移酶和碳水化合物酯酶注釋到的基因數(shù)量分別為41、37個（圖6）。

從內(nèi)到外，第1圈代表刻度，第2圈代表GC Skew，第3圈代表GC含量，第4圈和第7圈代表每一個CDS所屬的COG，第5圈植物多糖降解酶主要包括纖維素酶、木聚糖酶和淀粉酶[17]。副地衣芽孢桿菌LB3 基因組中有纖維素酶基因5個（包含4個內(nèi)切酶基因和1個外切酶基因），半纖維素酶基因6個，脫支酶基因1個，寡糖降解酶基因20個。此外，LB3基因組中還有淀粉酶GH13家族基因6個（表3）。

2.4.5病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫（PHI）注釋PHI是病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫（pathogenhostinteractionsdatabase）[18]。通過PHI數(shù)據(jù)庫注釋，被注釋到導致病原菌致病能力降低的基因（reducedvirulence）最多，共有612個，注釋到導致病原菌致病能力喪失的基因（lossofpathogenicity）有54個，這可能是LB3菌株能夠抑制病原菌生長的主要因素（圖7）。

3討論

本研究表明，副地衣芽孢桿菌LB3具有促生能力，能夠產(chǎn)鐵載體、 NH₃ 、蛋白酶和纖維素酶。體內(nèi)促生試驗結果表明，LB3菌株對擬南芥根長具有顯著的促進作用。通過對次級代謝產(chǎn)物相關基因簇分析發(fā)現(xiàn)，該菌能夠產(chǎn)生兒茶酚型鐵載體bacillibactin，具有植物促生作用[19]，推測這與LB3表現(xiàn)促生效果有關。

CARD—抗生素抗性數(shù)據(jù)庫注釋；CAZy—碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫注釋；COG—直系同源蛋白數(shù)據(jù)庫注釋；GO—基因本體論注釋；Islandview—基因島預測；KEGG—基因組數(shù)據(jù)庫注釋；MEROPS—蛋白酶數(shù)據(jù)庫注釋；MvirDB—病毒基因組數(shù)據(jù)庫注釋；NR—非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫；Pfam—蛋白家族數(shù)據(jù)庫注釋；PHI—病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫注釋；prophage—原噬菌體預測；Secretory—分泌蛋白預測；Signal—信號肽預測；SwissProt—蛋白質數(shù)據(jù)庫注釋；T3SS—型分泌系統(tǒng)預測；TCDB—轉運蛋白分類數(shù)據(jù)庫注釋；Tmhmm—跨膜螺旋結構預測；VFDB—致病菌毒力因子數(shù)據(jù)庫注釋

LB3菌株還對藜麥葉斑病病原菌（Alternariaalternata）表現(xiàn)出一定的抑制作用，這與其存在地衣素（lichenysin）、桿菌肽（bacitracin）、豐原素（fengycin）等生物合成基因簇有關。研究表明，地衣素是由地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物，通過破壞細胞膜的完整性，表現(xiàn)出抑菌活性[20]。桿菌肽是多肽類抗生素，可抑制細菌細胞壁的合成，從而表現(xiàn)出抑菌效果[21]。豐原素也是芽孢桿菌產(chǎn)生的活性物質，可以擾亂細胞膜，從而抑制作物病害[22]

副地衣芽孢桿菌LB3的全基因組序列由1條大小為 4450573bp 的環(huán)狀染色體組成， G+C 含量為 45.94% 。大部分基因注釋到NR、COG、KEGG、Swiss- ?-Prot，G0 、Pfam等數(shù)據(jù)庫中。在CAZy數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)LB3菌株大部分基因注釋到糖苷水解酶中，糖苷水解酶能夠降低黏附生物膜的生物量，降低線蟲和果蠅毒力[23]。LB3中還存在多個多糖降解酶基因，包括纖維素酶、半纖維素酶、脫支酶、寡糖降解酶等相關基因，這與促生指標測定試驗結果相一致。其淀粉酶相關基因的數(shù)量比地衣芽孢桿菌

ATCC14580（GenBank：CP000002）和 CBA 7132（GenBank：CP021970）多，這與趙帝等的研究結果[24]相符。GH13家族淀粉酶能夠水解淀粉分支部位的 α-1，6 糖苷鍵，可以有效提高淀粉利用率[25]說明該菌能夠更好地利用淀粉類多糖。

PHI數(shù)據(jù)庫注釋結果顯示，LB3菌株中有612 分類中，該分類被認為是減弱病原菌致病力的重要個基因注釋到毒力降低的基因（reducedvirulence） 突變表型，此外還有54個基因注釋到失去致病力的

基因（lossofpathogenicity）分類中，這也使得該菌能夠在平板對峙中抑制藜麥葉斑病原菌的生長，為其抗病基因的挖掘奠定基礎。

對副地衣芽孢桿菌LB3菌株的促生抑菌功能研究以及基因組信息分析結果表明，該菌具有較大的開發(fā)和應用潛能，這為開發(fā)新型生防菌劑和微生物菌肥奠定了基礎。

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