水稻白葉枯病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系的建立及在防效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

關(guān)鍵詞：水稻；白葉枯??；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；定量檢測；防效評(píng)價(jià)中圖分類號(hào)： 5435.111.4⁺7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2025）10-0145-07

水稻（OryzasativaL.）是世界最主要的糧食作物之一[1]，我國一半以上的人口以稻米為主食。因此，保障水稻的產(chǎn)量對(duì)我國糧食安全具有重要作用[2]。在生產(chǎn)過程中，若發(fā)生病蟲害，會(huì)對(duì)水稻產(chǎn)量造成一定的損失，而水稻白葉枯?。╞acterialleafblight，BLB）就是引起水稻減產(chǎn)的三大病害之一，該病害是由水稻黃單胞菌水稻致病變種［Xanthomonasoryzaepv.oryzae（簡稱：Xoo）引起的細(xì)菌性維管束病害[3]，在水稻的整個(gè)生命周期內(nèi)均可發(fā)生。在一般發(fā)病條件下，水稻白葉枯病造成的產(chǎn)量損失約為20% ，發(fā)病條件適宜時(shí)造成的產(chǎn)量損失甚至超過50% ，更嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致田塊沒有收成[4]。水稻白葉枯病在華東、華南和華中地區(qū)的危害較大[5]，嚴(yán)重影響了我國水稻的產(chǎn)量。因此，針對(duì)水稻白葉枯病病害發(fā)生嚴(yán)重的稻區(qū)開展水稻白葉枯病的防治研究，對(duì)于保證糧食安全生產(chǎn)至關(guān)重要。

近些年來，隨著水稻抗病基因的發(fā)掘和應(yīng)用，水稻白葉枯病雖然在整體上得到了控制，但是有些稻區(qū)可能由于原有抗性基因的抗性喪失，因而出現(xiàn)了水稻白葉枯病擴(kuò)展蔓延之勢，給當(dāng)?shù)厮旧a(chǎn)造成了較大損失。例如，在云南省楚雄市的粳稻種植區(qū)，該病害的發(fā)病面積逐年增加，嚴(yán)重地塊的發(fā)病率已達(dá) 100% 。目前，防治水稻白葉枯病的方法有生物防治法、農(nóng)藥防治法等[6-7]。其中，生物防治法主要利用拮抗作用、微生物代謝產(chǎn)物等防治水稻白葉枯病8，該方法具有健康環(huán)保、無公害等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，常見做法是利用從水稻根際土壤中或者水稻植株內(nèi)部分離得到的生防菌進(jìn)行防治[11]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，防治水稻白葉枯病最常用的方法是化學(xué)防治法，該方法主要利用化學(xué)藥品的拮抗殺菌作用防治病害，具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前防治水稻白葉枯病最廉價(jià)、高效的應(yīng)急舉措之一，常用藥劑有 20% 噻唑鋅懸浮劑[12] 6% 中生菌素可濕性粉劑 ，35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑[13]等。為了評(píng)估藥劑對(duì)水稻白葉枯病的防控效果，不僅可以通過病情調(diào)查進(jìn)行分析，還可以通過檢測施藥后水稻植株內(nèi)病原菌的含量來分析。目前，檢測 χ_oo 的方法有病原菌分離培養(yǎng)后計(jì)數(shù)和分子生物學(xué)方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative real -time PCR，qPCR）等[14]

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的檢測方法已經(jīng)不能滿足快速檢測的要求。PCR法、qPCR法等是目前檢測 Xoo 較為常用的方法[15]。常規(guī)PCR技術(shù)主要通過對(duì)一定量的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，DNA達(dá)到一定量時(shí)，常規(guī)PCR反應(yīng)才夠靈敏。當(dāng)DNA量較小時(shí)，常規(guī)PCR反應(yīng)就不靈敏，此時(shí)就需要使用靈敏度更高的qPCR技術(shù)進(jìn)行檢測[16-18]。qPCR 技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一種靈敏性好、特異性強(qiáng)、能快速檢測核酸分子的技術(shù)，在病原菌的快速檢測中扮演重要角色，該技術(shù)常通過PCR反應(yīng)體系與一定量的熒光染料結(jié)合，實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線、熔解曲線，后續(xù)通過結(jié)合分析軟件進(jìn)行定性、定量分析[5]qPCR技術(shù)可以檢測病原菌在植物體內(nèi)的數(shù)量，它克服了常規(guī)PCR的諸多不足，使得該技術(shù)成為分子檢測的熱門技術(shù)[17，19]

目前，國內(nèi)外廣泛將qPCR技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)植物病原菌的快速檢測和定性、定量研究中。張健男等利用qPCR，從水稻細(xì)菌性條斑病菌（Xoc）現(xiàn)有的基因入手，設(shè)計(jì)和篩選出適合qPCR檢測的Xoc特異性引物，并建立了qPCR檢測方法，可用于檢測、鑒定 Xoc^[3] 。Chaves 等開發(fā)了1種新的基于 TaqMan探針的qPCR方法，該方法也可在常規(guī)PCR反應(yīng)中進(jìn)行，用于檢測4種已知植物病原物種[20]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行防治之后，利用qPCR技術(shù)對(duì)水稻葉片內(nèi)的病原菌含菌量、數(shù)量變化進(jìn)行檢測已經(jīng)得到廣泛運(yùn)用。唐利華等通過qPCR技術(shù)檢測噴施化學(xué)農(nóng)藥后柑橘葉片中黃龍病病原菌的含量，發(fā)現(xiàn)噴施藥劑后柑橘葉片中病原菌的含量大幅度降低，說明該藥劑對(duì)柑橘黃龍病具有防治效果，也說明qPCR技術(shù)可以用于化學(xué)防治效果的田間評(píng)價(jià)[21]。王淑芳等利用qPCR 技術(shù)對(duì)噴施生防菌前后水稻紋枯病菌的數(shù)量、發(fā)病情況及水稻產(chǎn)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)施用生防菌后，水稻紋枯病菌的數(shù)量有所降低，與防治效果、產(chǎn)量結(jié)果一致，說明qPCR技術(shù)可以用于生物防治效果的田間評(píng)價(jià)[22]

為了深入研究防治水稻白葉枯病的有效藥劑，本研究擬對(duì)防治Xoo的相關(guān)藥劑進(jìn)行溫室試驗(yàn)，并通過qPCR技術(shù)檢測施用不同藥劑后水稻白葉枯病菌在水稻葉片中的含量，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行溫室藥效評(píng)價(jià)。以期為田間防治水稻白葉枯病的高效用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻材料為日本晴；供試接種菌株為水稻白葉枯病菌株 （Xoo）LF21-38 （分離于云南省楚雄彝族自治州祿豐市發(fā)病最嚴(yán)重的稻田，保存于楚雄師范學(xué)院環(huán)化學(xué)院生化與分子實(shí)驗(yàn)室）。NA培養(yǎng)基配方： 7g 蛋白脈， 3g 牛肉膏， 12g 葡萄糖， _lg 酵母粉， 18g 瓊脂， 1000mL 蒸餾水， pH 值7.0，配好后于 121^qC 滅菌 20min 。LB 液體培養(yǎng)基配方： 10g 胰蛋白膚， 5g 酵母粉， 10gNaCl，1000mL 蒸餾水，配好后于 121^°C 滅菌 20min 。供試生防菌為枯草芽孢桿菌（分離于云南省楚雄彝族自治州祿豐市水稻種植區(qū)的水稻葉片，保存于楚雄師范學(xué)院環(huán)化學(xué)院生化與分子實(shí)驗(yàn)室），供試藥劑為 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑（青島奧迪斯生物科技有限公司） ，20% 噻唑鋅懸浮劑（廣州方富化工有限公司） 6% 中生菌素可濕性粉劑（福建凱立生物制品有限公司），均由楚雄師范學(xué)院資源環(huán)境與化學(xué)學(xué)院生化與分子實(shí)驗(yàn)室提供。

溫室試驗(yàn)于2023年5月在楚雄師范學(xué)院資源環(huán)境與化學(xué)學(xué)院溫室大棚進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1水稻白葉枯病病原菌LF21-38的基因組DNA提取對(duì)病原菌LF21-38進(jìn)行活化及傳代培養(yǎng)。挑取單菌落于 5mL 液體LB 培養(yǎng)基中，在28^°C 振蕩培養(yǎng) 12h （轉(zhuǎn)速為 180r/min ）后進(jìn)行基因組DNA的提取，提取方法參照天根生化科技（北京）有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2.2 引物合成參考Lu等的方法，基于 χ_oo 糖基轉(zhuǎn)移酶基因設(shè)計(jì)引物 JLXooΔF/R^[19] ，該引物對(duì)水稻白葉枯病病原菌具有較強(qiáng)的特異性。JLXooF序列為 5^′ -CCTCTATGAGTCGGGAGCTG- 3^′ ;JLXoo R序列為 5^′ - ACACCGTGATGCAATGAAGA -3^′ 。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.2.3引物的特異性檢測用引物JLXooF/JLXooR對(duì)提取的病原菌LF21－38基因組DNA進(jìn)行PCR、qPCR擴(kuò)增，檢測引物的特異性，以 Xoc （與Xoo為同種不同的致病變種）的基因組DNA作為陰性對(duì)照。

常規(guī)PCR反應(yīng)體系（ 25μL）：12μL 2×Taq PCRMix，各 1μL 引物， 1μL DNA模板，用 ddH₂0 補(bǔ)足至 25μL 常規(guī)PCR反應(yīng)程序：95 C 5min ;95個(gè)循環(huán); 72°C 10min 。對(duì)常規(guī)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

Real-timePCR反應(yīng)體系（ 20μL ： 10μL2× SuperRealPreMixPlus[天根生化科技（北京）有限公司的SuperReal熒光定量預(yù)混試劑]，各 0.4μL 引物 10μmol/L ）， 1μL DNA模板，用 ddH₂O 補(bǔ)足至20μL Real-timePCR反應(yīng)條件（三步法）： 95°C 3min;95%10s，54.5%30s，95% 10s （收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。PCR循環(huán)結(jié)束后，降溫至 60^°C 并保持 60s ，然后升溫至 72^°C ，保持72s，收集熒光信號(hào)，建立熔解曲線。根據(jù)熔解曲線是否為單一特異的峰，用來判斷引物的特異性。

1.2.4引物的靈敏度檢測Xoo 病原菌LF21-38基因組DNA按照10倍梯度稀釋成6個(gè)濃度梯度，先取10μL 原濃度的DNA（濃度為 1.01×10²ng/μL? 加入90μL 無菌水中，將DNA 稀釋成10倍，再取 10μL 稀釋成10倍的DNA加人 90μL 無菌水中，稀釋成100倍，以此類推分別稀釋成 10^-1，10^-2 ！ 10^-3 、10^-4，10^-5，10^-6 濃度梯度，DNA濃度依次為 4.35× 10¹ng/μL，3.30ng/μL，2.33×10³pg/μL，1.93× 2. 、1×10³fg/μL 。分別用常規(guī)PCR、qPCR對(duì)進(jìn)行梯度稀釋的DNA進(jìn)行引物靈敏度檢測，常規(guī)PCR、qPCR的反應(yīng)體系及程序同引物特異性檢測。根據(jù)擴(kuò)增條帶及熒光信號(hào)值大小，檢測所合成的引物在2種方法中對(duì)水稻白葉枯病病菌基因組DNA檢測的靈敏度。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以梯度稀釋的DNA作為模板，以JLXooR/XooF為引物進(jìn)行qPCR。反應(yīng)結(jié)束后，以模板DNA對(duì)數(shù)的copy值為 x 軸、循環(huán)閾值（cyclethreshold， C_T ）為 y 軸，建立Xoo特異性引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù) qPCR 儀系統(tǒng)分析的lgDNA（濃度）值與 C_T 值之間的關(guān)系，驗(yàn)證兩者之間的相關(guān)度[23]

1.2.6 溫室試驗(yàn)

1.2.6.1溫室預(yù)防水稻白葉枯病試驗(yàn)將水稻日本晴幼苗進(jìn)行移栽，待水稻苗長到孕穗前期，進(jìn)行溫室試驗(yàn)。用無菌水與菌株LF21-38配制成濃度為 約為0.5）的菌懸液進(jìn)行噴霧接種。在溫室預(yù)防試驗(yàn)中，先噴施供試藥劑（ 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑 6% 中生菌素可濕性粉劑 ，20% 噻唑鋅懸浮劑）及枯草芽孢桿菌， ^12h 后再噴施菌懸液，施藥量均為每種藥劑的推薦使用劑量，將枯草芽孢桿菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，至菌懸液濃度約為 10⁸CFU/mL（D_600nm 約為0.5）[24]，以噴施等量無菌水的處理作為空白對(duì)照，套袋保濕，控制溫室溫度為 24～30^°C ，自然光照條件。藥劑的推薦用量如下：枯草芽孢桿菌 7500mL/hm² 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑 480～540mL/hm² 6% 中生菌素可濕性粉劑 450～600g/hm² 20% 噻唑鋅懸浮劑 1005～ （204號(hào) 1500mL/hm² 。參試藥劑用水量均為 600L/hm² ，進(jìn)行溫室預(yù)防水稻白葉枯病試驗(yàn)7d后觀察其發(fā)病情況。

1.2.6.2溫室治療水稻白葉枯病試驗(yàn)在溫室治療試驗(yàn)過程中，先接種菌懸液， 48h 后再噴施供試藥劑、枯草芽孢桿菌，施藥量同溫室預(yù)防試驗(yàn)，以噴施等量無菌水作為空白對(duì)照。通過套袋進(jìn)行保濕，控制溫室溫度為 24～30°C ，自然光照條件，7d后觀察其發(fā)病情況。

1.2.6.3溫室預(yù)防和治療防治效果的測定根據(jù)水稻發(fā)病狀況進(jìn)行藥劑預(yù)防、治療效果的測定，測量接種葉片的病斑長、總?cè)~片長，并進(jìn)行病情等級(jí)的分級(jí)。水稻白葉枯病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照吳水祥等的方法[12]。根據(jù)測量結(jié)果，按照如下公式計(jì)算病情指數(shù)和防治效果：病情指數(shù) =[Σ （各級(jí)病葉數(shù) × 病情級(jí)數(shù)）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù) ×9 ） ]×100 ；病情防效 Σ=Σ [（空白對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/空白對(duì)照區(qū)病情指數(shù)] ×100% 。用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS16進(jìn)行數(shù)據(jù)間的差異分析。

1.2.7水稻葉片總DNA的提取采集溫室試驗(yàn)處理后的水稻葉片，用無菌水清洗水稻葉片3次后，用液氮研磨成細(xì)粉，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取葉片總DNA，CTAB法參考譚小艷等的方法[25] 。

1.2.8Real-timePCR定量檢測接種后水稻葉片中水稻白葉枯病病原菌含量按照上述qPCR的反應(yīng)體系及程序?qū)μ崛〉乃救~片總DNA進(jìn)行qPCR 。根據(jù)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷進(jìn)行治療試驗(yàn)、預(yù)防試驗(yàn)后水稻葉片上水稻白葉枯病病菌量的變化情況。將反應(yīng)后的 C_T 值代入建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，可以計(jì)算出lgDNA，再根據(jù)如下公式計(jì)算水稻白葉枯病病原菌DNA的拷貝數(shù)：DNA拷貝數(shù) Σ=Σ [DNA濃度（ ng/μL ） ×DNA 體積 （μL）×6.02×10²³]. /[片段長度 ×660g/mol]^[26] ，從而對(duì)水稻葉片上水稻白葉枯病病菌的數(shù)量進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1引物特異性驗(yàn)證

用引物JLXooF/JLXooR對(duì)水稻白葉枯病病原菌LF21-38的DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。由圖1-a可知，水稻白葉枯病病原菌的DNA擴(kuò)增出 230bp 的目標(biāo)條帶，而作為陰性對(duì)照的Xoc基因組DNA無擴(kuò)增條帶。用引物JLXooF/JLXooR進(jìn)行real-timePCR擴(kuò)增，圖1-b結(jié)果顯示，該引物僅對(duì)水稻白葉枯病病原菌有單一的吸收峰。

2.2引物的靈敏度檢測

2.2.1常規(guī)PCR檢測引物的靈敏度用引物JLXooF/JLXooR對(duì)按照濃度梯度稀釋的基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR的靈敏度測定。由圖2可以看出，該引物能擴(kuò)增到濃度為 1.93×10²pg/μL （泳道4）的基因組DNA，目標(biāo)條帶大小約為 230bp 。在泳道5中，濃度為 1.43×10¹pg/μL 的 DNA也能擴(kuò)增出條帶，但目標(biāo)條帶微弱、模糊。泳道6、7的DNA濃度分別為 2.5pg/μL，1×10³fg/μL ，由于濃度較低，不能用常規(guī)的PCR檢測出來，因此不能擴(kuò)增出任何條帶。根據(jù)上述結(jié)果分析可知，常規(guī)PCR的檢測靈敏度為 1.43×10pg/μL 。

2.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測引物靈敏度借助real-timePCR技術(shù)，用引物JLXooF/JLXooR進(jìn)行靈敏度檢測。由圖3-a可知，熒光定量信號(hào)曲線均為單一、平滑的曲線，說明該引物的靈敏度較好。由圖3-b可知，熔解曲線均出現(xiàn)明顯單一的峰，說明該引物的靈敏度較好。 a，b，c，d，e，f 這6個(gè)濃度梯度的DNA均有擴(kuò)增曲線， g 濃度的DNA由于濃度過低，超出qPCR反應(yīng)檢測的下限，因而沒有擴(kuò)增出曲線，也沒有出現(xiàn)熔解峰?；谏鲜鼋Y(jié)果分析可知， qPCR 的檢測靈敏度為 2.5pg/μL ，是常規(guī)PCR檢測靈敏度的10倍。

2.3 Real-timePCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以梯度稀釋制備的DNA進(jìn)行qPCR檢測，由于引物JLXooF/JLXooR的擴(kuò)增對(duì)數(shù)曲線規(guī)律較好（圖3-a），因此以不同稀釋梯度的基因組DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為 x 軸 值為 y 軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4可知，該體系的線性關(guān)系良好 （y=-2.579 3x+ 43.946 0）， r²=0.999 9 ，可用于后續(xù)水稻白葉枯病菌熒光定量的檢測。

DNA； b-3.30ng/μL DNA; c-2.33×10³pg/μL DNA； d-1.93×10²pg/μL DNA; e-1.43×10pg/μL DNA; DNA; g-1×10³fg/μL DNA

2.4水稻白葉枯病原菌LF21-38侵染葉片后病原菌的real-timePCR定量

通過對(duì)水稻葉片總DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)后，將擴(kuò)增曲線上對(duì)應(yīng)的 C_T 代入回歸方程 y=-2.5793x+43.9460 ，便可計(jì)算出DNA濃度對(duì)數(shù)，再根據(jù)如下公式計(jì)算水稻白葉枯病病原菌的DNA拷貝數(shù)：DNA拷貝數(shù) σ=σ [DNA濃度 （ng/μL）× DNA體積 （ΔμL）×6.02×10²³]/[ 片段長度 × 660g/mol] 。由表1可知，在溫室治療和預(yù)防水稻白葉枯病試驗(yàn)過程中， 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑、6% 中生菌素可濕性粉劑 .20% 噻唑鋅懸浮劑和枯草芽孢桿菌處理后水稻白葉枯病菌的拷貝數(shù)均低于對(duì)照組， 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑處理后的拷貝數(shù)最低，其次是 6% 中生菌素可濕性粉劑、 20% 噻唑鋅懸浮劑和枯草芽孢桿菌處理。在不同處理后，無論是 C_T 值還是DNA拷貝數(shù)都具有顯著差異，說明35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑的處理效果最好， 6% 中生菌素可濕性粉劑次之，枯草芽孢桿菌的效果較差。

2.5 溫室藥效試驗(yàn)

為了明確 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑 6% 中生菌素可濕性粉劑、 20% 噻唑鋅懸浮劑3種藥劑和枯草芽孢桿菌對(duì)水稻白葉枯病的防效，開展溫室藥效試驗(yàn)。在白葉枯病治療試驗(yàn)中，水稻在接種LF21-38菌懸液后再噴施3種藥劑和枯草芽孢桿菌。由表2可知，經(jīng)過不同處理后，病斑長在6.11＼～11.87cm 之間，病情指數(shù)在 48. 15%～53. 09% 之間。用 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑處理后，水稻葉片的平均病斑長為 6.11cm ，病情指數(shù)為 48.15% ，均低于其他處理組，治療效果為 26.41% ，均高于其他處理組，說明 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑處理對(duì)水稻白葉枯病的治療效果最好。其次是 6% 中生菌素可濕性粉劑 20% 噻唑鋅懸浮劑處理，枯草芽孢桿菌的治療效果最差，且 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑 ，6% 中生菌素可濕性粉劑 .20% 噻唑鋅懸浮劑處理后的病情指數(shù)無顯著差異。

白葉枯病的預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果表明， 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑 ，6% 中生菌素可濕性粉劑 ，20% 噻唑鋅懸浮劑和枯草芽孢桿菌處理后，白葉枯病的病情指數(shù)均低于對(duì)照處理。在水稻白葉枯病的預(yù)防試驗(yàn)中，病斑長在 3.04～9.48cm 之間，病情指數(shù)在32.72%～48.76% 之間。其中，噴施 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑后，水稻葉片的平均病斑長為3.04cm 病情指數(shù)為 32.72% ，均低于其他處理組，而預(yù)防效果為 50.92% ，均高于其他處理組，說明 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑對(duì)水稻白葉枯病的預(yù)防效果最好。其次是 6% 中生菌素可濕性粉劑 ，20% 噻唑鋅懸浮劑處理，枯草芽孢桿菌的預(yù)防效果較差，防治效果不足 30% 。綜上，根據(jù)溫室藥效試驗(yàn)結(jié)果可知，整體上預(yù)防效果均好于治療效果，且 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑對(duì)水稻白葉枯病防治有很好的效果，其次是 6% 中生菌素可濕性粉劑， 20% 噻唑鋅懸浮劑、枯草芽孢桿菌對(duì)水稻白葉枯病也有較好的防治效果。本試驗(yàn)結(jié)果與不同處理后水稻葉片中水稻白葉枯病原菌的real-timePCR定量結(jié)果一致。

2.6qPCR檢測結(jié)果與防治效果的相關(guān)性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證qPCR檢測結(jié)果對(duì)水稻病害防治效果的評(píng)價(jià)相關(guān)性分析，本研究對(duì)不同處理后水稻葉片的病情指數(shù)和qPCR檢測Xoo的拷貝數(shù)（copys）進(jìn)行相關(guān)性分析，通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，各處理水稻葉片qPCR檢測的Xoo拷貝數(shù)與葉片病情指數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)（圖5）。分析結(jié)果表明， qPCR 檢測可以用于評(píng)價(jià)藥物處理后水稻葉片白葉枯病害的病情指數(shù)，用于防效評(píng)價(jià)、分析。

3討論

3.1引物特異性和靈敏度檢測

水稻白葉枯病是水稻生產(chǎn)中典型的流行病害，而且病原菌可通過多種方式傳播，對(duì)水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此建立快速、高效的方法檢測水稻白葉枯病菌具有重要意義。張健男等設(shè)計(jì)了細(xì)菌性條斑病的特異性引物XocFhuE-F/XocFhuE-R，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增出特異性強(qiáng)且無引物二聚體的單一產(chǎn)物，表明該引物適用于qPCR，且該引物無需用熒光標(biāo)記的探針來保障引物檢測的特異性，用熒光染料就可對(duì) Xoc 進(jìn)行qPCR，這為水稻細(xì)菌性條斑病高效檢測提供了依據(jù)[3]。本試驗(yàn)利用引物JLXooF/JLXooR對(duì)水稻白葉枯病菌進(jìn)行擴(kuò)增，得到1條 230bp 的單一產(chǎn)物， qPCR 也能擴(kuò)增出單一峰，表明該引物特異性強(qiáng)。李文學(xué)等通過引物 （F-cox-Pv/R-Pv） 對(duì)葡萄霜霉病菌進(jìn)行常規(guī)PCR以及構(gòu)建qPCR檢測體系，結(jié)果表明qPCR 技術(shù)靈敏度比常規(guī)PCR高100倍[26]。孟鴻洲為了建立可以檢測水稻白葉枯病菌的qPCR體系，通過常規(guī)PCR技術(shù)和qPCR技術(shù)對(duì)菌液、帶菌種子、帶菌土壤的檢測，結(jié)果表明qPCR比常規(guī)PCR靈敏度高[27]。韓陽等用引物 Xoc2071F/R 對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌進(jìn)行常規(guī)PCR和qPCR反應(yīng)，結(jié)果表明qPCR的靈敏度比常規(guī)PCR 高100 倍左右[28]本試驗(yàn)通過引物JLXooF/R進(jìn)行檢測，常規(guī)PCR能檢測到濃度為 1.43×10¹pg/μL 的 DNA，而qPCR中對(duì)濃度為 2.5pg/μL 的DNA可得到單一峰，表明常規(guī)PCR檢測靈敏度比qPCR低10倍左右。

3.2實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)病原菌檢測

近年來， qPCR 技術(shù)在植物病害方面的研究不斷深入，不僅用于病原菌的鑒定，還可對(duì)被病害侵染的植物進(jìn)行病原菌定量分析，為防控藥劑對(duì)植物病害的防控效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。王淑芬等利用qPCR技術(shù)對(duì)施用生防菌前后水稻田土壤中水稻紋枯病菌的數(shù)量進(jìn)行監(jiān)測，并對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明對(duì)水稻紋枯病的防治效果隨著生防菌濃度的增加而加強(qiáng)，與清水對(duì)照組相比，噴施生防菌后土壤中的水稻紋枯病菌數(shù)量隨時(shí)間的推移不斷減少，生防菌的防控效果與qPCR檢測結(jié)果相一致，說明qPCR技術(shù)可以用于生物防治的田間防治效果評(píng)價(jià)[22]。唐利華等利用qPCR對(duì)施藥后柑橘葉片和果皮中柑橘黃龍病菌的含量進(jìn)行檢測，相比對(duì)照組施藥后的柑橘葉片和果皮中病原菌的含量明顯降低，柑橘葉片中病原菌含量降低了 97% 左右，果皮含菌量降低 87% 左右，表明噴施化學(xué)藥劑后可通過qPCR進(jìn)行防治效果評(píng)價(jià)[21]。本試驗(yàn)通過對(duì)溫室藥效試驗(yàn)水稻葉片的總DNA進(jìn)行 qPCR 檢測，結(jié)果表明，施用不同藥劑和枯草芽孢桿菌后水稻白葉枯病菌在水稻葉片上的病原菌含量低于清水對(duì)照組。在 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑作用下水稻白葉枯病菌的含量均比 6% 中生菌素可濕性粉劑、 20% 噻唑鋅懸浮劑和枯草芽孢桿菌處理的低，說明 35% 喹啉銅·四霉素懸浮劑處理后的水稻葉片病原菌數(shù)量最少，與溫室防治效果相一致，說明qPCR技術(shù)可以用于生物防治和化學(xué)防治的防治效果評(píng)價(jià)。因此，qPCR技術(shù)可對(duì)侵染階段的病原菌進(jìn)行監(jiān)測與定量，該方法有利于早期準(zhǔn)確估計(jì)病害發(fā)病情況，結(jié)合環(huán)境條件及時(shí)制定有效的防治策略。

4結(jié)論

運(yùn)用qPCR對(duì)白葉枯病菌DNA進(jìn)行PCR檢測，其靈敏度比常規(guī)PCR高出10倍。用qPCR對(duì)溫室

藥效試驗(yàn)后的水稻葉片進(jìn)行水稻白葉枯病菌的定量分析，定量后葉片中的Xoo拷貝數(shù)與葉片病情指數(shù)呈正相關(guān)。

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