基于WGCNA的甘蔗細(xì)胞壁建成和糖分積累調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

摘" 要：甘蔗是重要的糖料作物和能源作物，糖分積累和細(xì)胞壁建成是其生長(zhǎng)發(fā)育中的重要生物學(xué)過程。本研究以甘蔗品種新臺(tái)糖22號(hào)為試驗(yàn)材料，采集其第1、3、5節(jié)葉片，第1、3、5、7、11、17節(jié)間莖髓和第3、5、7、11、17節(jié)間莖皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)獲得的42份轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)利用WGCNA構(gòu)建基因共表達(dá)矩陣，獲得34個(gè)共表達(dá)模塊。其中鑒定到與第1節(jié)葉片、第7節(jié)間莖髓和第5節(jié)間莖皮特異顯著正相關(guān)的midnightblue、purple和magenta模塊，KEGG代謝通路和GO功能富集分析表明這些模塊參與了其組織中特定的生物學(xué)過程。Blue、yellow、turquoise和black模塊分別主要在葉、幼髓、幼嫩節(jié)間和莖皮中表達(dá)，最終在blue模塊中挖掘到參與光合作用的關(guān)鍵酶，包括LFNR1、PSAK、PETE、PSAN和NADP-ME4等，這些酶對(duì)甘蔗糖分的產(chǎn)生及積累十分關(guān)鍵。在yellow模塊中，構(gòu)建以SUS4為核心的蔗糖代謝網(wǎng)絡(luò)，包括SWEET2等一系列與糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的酶和蛋白，證實(shí)了莖髓是甘蔗運(yùn)輸和儲(chǔ)藏蔗糖的主要場(chǎng)所。在turquoise模塊中，鑒定到可能參與初生細(xì)胞壁合成與修飾的糖蛋白和酶；調(diào)控次生細(xì)胞壁生物合成的轉(zhuǎn)錄因子NST1與其他修飾細(xì)胞壁的酶富集在black模塊中，表明該模塊可能參與莖皮的細(xì)胞壁沉積，為甘蔗提供機(jī)械強(qiáng)度與防御外界脅迫的屏障。以上結(jié)果為研究甘蔗糖分積累和細(xì)胞壁建成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要參考。

關(guān)鍵詞：甘蔗；WGCNA；糖分積累；細(xì)胞壁；轉(zhuǎn)錄組；調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中圖分類號(hào)：S566.1 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Unraveling the Complex Regulatory Networks Controlling Sugarcane Cell Wall Synthesis and Sugar Content via WGCNA

YAN Ning¹， WANG Maoyao¹， LI Xinru¹， SHEN Yinjuan¹， LI Ming²， ZHANG Muqing¹， HUANG Jiangfeng^1*

1. College of Agriculture， Guangxi University / State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biology， Nanning， Guangxi 530004， China; 2. Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： Sugarcane is a crucial crop for both sugar and bioenergy production， with sugar accumulation and cell wall formation being critical biological processes during its growth and development. This study employed transcriptome sequencing on the ROC22 sugarcane variety， collecting samples from leaves at the 1^st， 3^rd， and 5^th nodes， bark tissues at the 3^rd， 5^th， 7^th， 11^th， and 17^th internodes， and pith tissues at the 1^st， 3^rd， 5^th， 7^th， 11^th， and 17^th internodes. A comprehensive analysis of 42 transcriptome datasets using Weighted Gene Co-expression Network Analysis （WGCNA） revealed 34 distinct co-expression modules. Notably， the midnight blue， purple， and magenta modules demonstrated significant and specific correlations with the 1^st node leaf， 7^th internode pith， and 5^th internode bark， respectively. KEGG and GO enrichment analyses indicated that the modules participated in tissue-specific biological processes. The blue， yellow， turquoise， and black modules were primarily expressed in leaves， young pith， immature internodes， and bark， respectively. Within the blue module， key enzymes implicated in photosynthesis were identified， such as LFNR1， PSAK， PETE， PSAN， and NADP-ME4， which are essential for the initial production and accumulation of sugar in sugarcane. The yellow module featured a sucrose metabolism network centered on SUS4， including SWEET2 and an array of sugar transport-related enzymes and proteins， suggesting that the pith serves as the primary site for sugar transport and storage in sugarcane. The turquoise module contained glycoproteins and enzymes potentially involved in the synthesis and modification of the primary cell wall. Meanwhile， transcription factor NST1， which regulates secondary cell wall biosynthesis， along with other cell wall-modifying enzymes in the black module， may contribute to cell wall deposition in the cortex， providing mechanical strength and a barrier against external stresses for sugarcane. The findings would provide important references for studying the regulatory networks of sugar accumulation and cell wall formation in sugarcane.

Keywords： sugarcane; WGCNA; sugar accumulation; cell wall; transcriptome; regulatory network

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.014

甘蔗（Saccharum spp. Hybrid）屬多年生草本植物，是全球重要的糖料作物和能源作物，對(duì)世界食糖生產(chǎn)和可再生能源發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)；其以極高的太陽能轉(zhuǎn)化效率成為已知作物中生物量最高的C₄作物^[1]。甘蔗莖由多個(gè)節(jié)段組成，節(jié)間主要由髓和皮構(gòu)成，糖分主要儲(chǔ)存在莖髓的薄壁細(xì)胞中，而莖皮主要由木質(zhì)化的纖維組成，為甘蔗提供機(jī)械強(qiáng)度支撐以保證其直立生長(zhǎng)。作為主要的收獲器官，蔗莖占了生物質(zhì)總量的80%～ 85%^[2]；在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，蔗莖的髓中積累了大量的糖分，包括蔗糖、葡萄糖、果糖等和其他還原糖^[3]。此外，甘蔗莖桿含有豐富的纖維，這些纖維是由細(xì)胞壁木質(zhì)化程度不同的細(xì)胞組成。

甘蔗的糖分性狀極其復(fù)雜，不僅受遺傳因素影響，更容易受環(huán)境影響。因此，深入挖掘甘蔗糖分代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)積累的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。在甘蔗屬割手密種中，有關(guān)C₄光合代謝的分子機(jī)制得到了較深入的研究。其中NADP-ME對(duì)C₄植物的光合作用至關(guān)重要，SsC4NADP-ME2受到ABI5的調(diào)節(jié)，參與了高效的碳固定并降低光呼吸率^[4]。蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase， MDH）也是C₄光合途徑中重要的酶，它催化蘋果酸（malate）與草酰乙酸（oxaloacetate， OAA）之間的可逆轉(zhuǎn)化，并在這一過程中生成或消耗NADH，釋放的CO₂用于卡爾文循環(huán)，從而提高CO₂的濃度，減少光呼吸^[5]。光合作用是植物糖分積累的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，植物通過光合作用同化空氣中的CO?，生成的碳水化合物主要以蔗糖的形式被糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到非光合器官進(jìn)行儲(chǔ)存。在甘蔗屬割手密種中，一系列SWEETs被證實(shí)在光合組織以及莖桿中參與了糖的轉(zhuǎn)運(yùn)^[6-7]。此外，鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和WRKY轉(zhuǎn)錄因子也被證實(shí)在甘蔗光合作用中具有關(guān)鍵作用^[8]。NADP蘋果酸酶（NADP-ME）在C₄光合途徑中具有關(guān)鍵作用，它催化了蘋果酸的脫羧反應(yīng)，促進(jìn)CO₂高效傳輸?shù)絉ubisco，從而提高光合效率^[9]。

植物細(xì)胞壁主要分為初生細(xì)胞壁和次生細(xì)胞壁。初生壁主要由纖維素、半纖維素、果膠和糖蛋白組成，具有靈活性和可塑性，以供細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)形成特定的細(xì)胞形態(tài)。次生細(xì)胞壁建成與植物的結(jié)構(gòu)支撐、病原防御、信號(hào)傳導(dǎo)以及形態(tài)結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，其主要由纖維素、木質(zhì)素和半纖維素組成^[10]。甘蔗莖桿的穿刺力試驗(yàn)表明，甘蔗莖皮中纖維素的含量與莖桿的機(jī)械強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)^[11]；此外，作為良好的生物能源的原料，如何改良甘蔗渣中各組分的含量及結(jié)構(gòu)成為學(xué)者們廣泛研究的主題。JUNG等^[12]利用TALEN技術(shù)對(duì)咖啡酸氧-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeic acid O-methyltransferase， COMT）的保守區(qū)域進(jìn)行編輯，突變系的木質(zhì)素含量顯著降低，而半纖維素含量增加，改善了用于生產(chǎn)木質(zhì)纖維素乙醇的細(xì)胞壁特征。在水稻中異源表達(dá)甘蔗SHINE1會(huì)增加轉(zhuǎn)基因株系中的果膠、纖維素含量，降低木質(zhì)素水平，并同步提升莖稈糖化效率及生物量，揭示其通過細(xì)胞壁組分重構(gòu)優(yōu)化木質(zhì)纖維素利用的潛力^[13]。目前的研究已經(jīng)證實(shí)NAC和MYB轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主開關(guān)，控制著擬南芥和其他維管植物次生細(xì)胞壁生物合成的部分程序^[14-16]。RGP屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族，參與了細(xì)胞壁多糖的合成與修飾^[17]；過氧化物酶PER52在擬南芥中參與了木質(zhì)素的合成，突變體per52中S型木質(zhì)素單體/G型木質(zhì)素單體比率的降低說明了PER52在S型木質(zhì)素單體生物合成中的潛在功能^[18]。盡管在其他模式作物中，次生細(xì)胞壁生物合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)得到了較深入的研究，但在甘蔗中仍待深入研究。

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation network analysis， WGCNA）廣泛應(yīng)用于生物基因表達(dá)數(shù)據(jù)的研究，該分析通過識(shí)別基因之間的共表達(dá)關(guān)系，并通過構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)來分析復(fù)雜的生物現(xiàn)象^[19]。在甘蔗逆境脅迫、養(yǎng)分運(yùn)輸、生長(zhǎng)發(fā)育及病害抗性等研究中，WGCNA也發(fā)揮了重要的作用。李佩婷等^[20]對(duì)斑茅和YCE96-40進(jìn)行干旱處理，分析2個(gè)品種在干旱處理下差異表達(dá)的基因，篩選出26個(gè)與干旱響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。TANG等^[21]研究甘蔗分蘗苗對(duì)干旱的響應(yīng)，獲得與干旱脅迫下生理變化顯著相關(guān)的共表達(dá)模塊和樞紐基因。張恒燕等^[22]則挖掘到可能參與甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的關(guān)鍵基因?？状贡?sup>[23]探究不同施肥水平下叢枝菌根真菌對(duì)甘蔗生長(zhǎng)和養(yǎng)分相關(guān)基因表達(dá)的影響，篩選到與氮、磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的候選基因。HUI等^[24]比較割手密和熱帶種對(duì)缺氮響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組，成功鑒定并克隆了參與氮代謝的關(guān)鍵基因ScNRT2.3。WU等^[25]分析易感黑穗病品種ROC22和抗黑穗病品種YT93-159接種Sporisorium scitamineum后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到正調(diào)控和負(fù)調(diào)控甘蔗黑穗病抗性的關(guān)鍵基因。隨著甘蔗栽培種基因組的發(fā)表^[26–28]，使得進(jìn)一步闡明

甘蔗生化過程的分子機(jī)理成為可能。本研究獲得甘蔗栽培種新臺(tái)糖22號(hào)不同節(jié)間葉片、莖皮和莖髓的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用WGCNA構(gòu)建不同組織中基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，旨在為進(jìn)一步研究甘蔗糖分積累和細(xì)胞壁建成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 材料

試驗(yàn)材料為甘蔗品種新臺(tái)糖22號(hào)，種植于廣西崇左市扶綏縣廣西大學(xué)農(nóng)科新城基地（22°31′5.85″N，107°47′17.66″E）。在甘蔗成熟期，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的甘蔗，分別快速采集甘蔗第1、3、5節(jié)葉（R1Y、R2Y、R3Y），第1、3、5、7、11、17節(jié)間莖髓（R1S、R3S、R5S、R7S、R11S、R17S），第3、5、7、11、17節(jié)間莖皮（R3P、R5P、R7P、R11P、R17P）（圖1），快速剝離并用錫紙包裹投入液氮中。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2" 方法

1.2.1" 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理" 對(duì)獲得的測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過濾，使用FastQC軟件對(duì)測(cè)序所得FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，檢測(cè)數(shù)據(jù)的總體質(zhì)量、堿基質(zhì)量分布、接頭污染及低質(zhì)量讀取情況。根據(jù)質(zhì)控結(jié)果，采用Trimmomatic工具對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行剪切，去除接頭序列和低質(zhì)量堿基（Qlt;20），確保下游分析的數(shù)據(jù)質(zhì)量。使用HISAT2工具將質(zhì)控后的序列批量比對(duì)至甘蔗栽培種的參考基因組ZZ1（中蔗1號(hào)）^[27]，確定每個(gè)reads在基因組中的位置。使用Samtools將sam文件轉(zhuǎn)換成bam文件，比對(duì)完成后用計(jì)數(shù)工具feature counts統(tǒng)計(jì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的讀取數(shù)，隨后算出基因的TPM（transcripts per million）值。

1.2.2" 基因加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析" 使用R語言WGCNA包，對(duì)各節(jié)間組織基因進(jìn)行加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。為確保網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，過濾掉方差為0和缺失樣本超過10%的基因，并選擇在3個(gè)生物學(xué)重復(fù)中平均TPM大于5的基因進(jìn)行共表達(dá)矩陣的構(gòu)建。利用WGCNA包中的pickSoftThreshold計(jì)算加權(quán)系數(shù)β=1～20范圍內(nèi)基因的平均連接度。β應(yīng)選取相關(guān)系數(shù)R²接近0.8，同時(shí)對(duì)應(yīng)的β值下還要保證一定的基因連接度。使用blockwiseModules自動(dòng)將鄰接矩陣轉(zhuǎn)化為拓?fù)渲丿B矩陣（topological overlap matrix，TOM），其中模塊最少基因數(shù)為30（minModuleSize=30），模塊合并參數(shù)為0.25（mergeCutHeight=0.25），其他參數(shù)按照默認(rèn)。

1.2.3" 模塊基因富集分析及基因互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建" 將目標(biāo)模塊中的基因蛋白序列提交至eggNOG- mapper v2在線網(wǎng)站進(jìn)行注釋^[29]，使用Tbtools軟件^[30]分別進(jìn)行KEGG代謝通路和GO功能富集分析，通過在線網(wǎng)站chiplot（https：//www.chiplot. online）對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化分析。kME（Module Eigengene Connectivity，模塊特征值連接性）用于衡量基因與模塊特征值的關(guān)聯(lián)度，kME高的基因通常在網(wǎng)絡(luò)中具有更高的連接性，對(duì)模塊的功能起到關(guān)鍵作用。為了獲得模塊內(nèi)代表性基因，設(shè)置邊權(quán)重閾值為0.1，對(duì)目標(biāo)模塊內(nèi)kMEgt;0.8的基因的互作信息導(dǎo)出至軟件cytoscape^[31]。將導(dǎo)出的基因蛋白序列提交至擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR（https：//www. arabidopsis.org）進(jìn)行同源比對(duì)，根據(jù)注釋信息選擇出關(guān)鍵基因。再根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的Degree值選出前10%的網(wǎng)絡(luò)核心基因，與候選關(guān)鍵基因構(gòu)建基因互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

過濾掉低表達(dá)基因后，對(duì)各節(jié)間組織過濾得到的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算并進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果顯示在48個(gè)樣品中無明顯離群樣本（圖2），并且同一組織的不同生物學(xué)重復(fù)間表達(dá)模式相似，說明數(shù)據(jù)整體質(zhì)量較高，試驗(yàn)的重復(fù)性良好，利于后續(xù)構(gòu)建的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)更加穩(wěn)定。通過pickSoftThreshold計(jì)算合適的加權(quán)系數(shù)β，如圖3顯示，當(dāng)β＝9時(shí)，無尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù)R²大于0.8，且平均連通性趨近于0，以此軟閾值構(gòu)建無尺度網(wǎng)絡(luò)。采用動(dòng)態(tài)剪切算法對(duì)基因進(jìn)行聚類，并計(jì)算每個(gè)模塊的特征向量值合并相似模塊，最終得到34個(gè)模塊。每個(gè)模塊用不同顏色表示，其中g(shù)rey模塊表示未明確分配到任何模塊的基因（圖4），該模塊可能包含許多植物基本生命活動(dòng)所需的管家基因，這些基因不隨組織的變化而波動(dòng)，因此未被分配到其他共表達(dá)模塊中。

2.2" 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與不同組織樣品的關(guān)聯(lián)分析

為了進(jìn)一步探究不同節(jié)間組織的生化差異，對(duì)模塊特征基因（module eigengenes， MEs）與樣品類型進(jìn)行相關(guān)性分析（圖5）。結(jié)果表明，部分模塊在不同組織類型中呈現(xiàn)不同的相關(guān)性，且與特定類型的組織顯著相關(guān)（Plt;0.05）。其中，在6個(gè)莖髓組織樣品中，purple模塊與第7節(jié)間莖髓（R7S）顯著相關(guān)，達(dá)到0.83（P=7×10^–12）；在6個(gè)莖皮組織中，paleturquoise模塊與第17節(jié)間莖皮（R17P）顯著相關(guān)，達(dá)到0.76（P=7×10^–9）；在3個(gè)葉組織中，midnightblue模塊與第1節(jié)葉（R1Y）顯著相關(guān)，達(dá)到0.91（P=5×10^–17）；且這3個(gè)模塊在其他組織均無顯著相關(guān)性，說明其可能分別在這3個(gè)部位參與著特定的生物學(xué)過程。此外，部分模塊在同一類型的組織中呈現(xiàn)出廣泛正相關(guān)。如yellow、lightcyan等模塊在發(fā)育的莖髓中呈廣泛正相關(guān)；black等模塊在莖皮組織呈廣泛正相關(guān)，而blue模塊則在葉組織中呈特異正相關(guān)；說明這些模塊中的特征基因在其組織中特異表達(dá)，并調(diào)控著相關(guān)的代謝活動(dòng)。

2.3" 特異表達(dá)模塊基因功能富集分析

在樣品類型與模塊的關(guān)聯(lián)分析中，purple、paleturquoise、magenta、midnightblue模塊分別與R7S、R17P、R5P、R1Y呈顯著正相關(guān)（rgt;0.7，Plt;0.05），表明這些模塊分別在其特定部位發(fā)揮特定作用。這4個(gè)模塊分別含602、43、1024、217個(gè)基因，由于paleturquoise模塊中的基因數(shù)量較少，因此僅對(duì)其余3個(gè)模塊中的基因進(jìn)行KEGG代謝通路和GO功能富集分析。為了挖掘3個(gè)模塊中的核心通路，根據(jù)富集的結(jié)果分別選擇enrich factor和Enrichment score前5的KEGG代謝通路和GO功能通路進(jìn)行可視化分析（圖6）。KEGG代謝通路富集分析結(jié)果表明，midnightblue模塊中的基因富集在與光合作用相關(guān)及其他生命大分子的生物合成通路上，說明該模塊中的基因在第1節(jié)葉片中不僅參與光合作用，還參與其他生化活動(dòng)。Purple模塊富集在以苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism）為中心組成的次級(jí)代謝網(wǎng)絡(luò)中，參與次級(jí)代謝物的合成與代謝，反映了第7節(jié)間莖髓中豐富的代謝活動(dòng)。Magenta模塊中的基因則主要集中在信號(hào)傳導(dǎo)途徑上，包括對(duì)環(huán)境信號(hào)的感知、傳遞、響應(yīng)和對(duì)植物激素信號(hào)的傳導(dǎo)、響應(yīng)；其中部分基因富集在GTP-結(jié)合蛋白上，作為信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要角色，進(jìn)一步說明第5節(jié)間莖皮中存在活躍的信號(hào)傳導(dǎo)。GO功能富集分析的結(jié)果基本與KEGG代謝通路富集的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，purple模塊部分基因富集到了細(xì)胞編程性死亡（programmed cell death）這一生物過程，可能與苯丙氨酸代謝途徑有一定的關(guān)系；magenta模塊在生物過程脫落通路（abscission）上富集，可能是該模塊基因在激素等信號(hào)傳導(dǎo)途徑上活躍的結(jié)果。以上結(jié)果表明，甘蔗在某些特定的組織中可能發(fā)生著特別的生物學(xué)過程。

2.4" 目標(biāo)模塊的關(guān)鍵基因挖掘與互作網(wǎng)絡(luò)分析

為了探究甘蔗糖分積累和細(xì)胞壁建成調(diào)控通路中的關(guān)鍵基因，對(duì)blue、yellow、turquoise和black模塊中的關(guān)鍵基因進(jìn)行挖掘。這4個(gè)模塊分別在同一組織中的特異表達(dá)表明，其對(duì)應(yīng)在葉片中的光合作用及碳水化合物合成、莖髓中的糖分運(yùn)輸和積累、幼嫩節(jié)間中初生細(xì)胞壁的建成、莖皮中的次生細(xì)胞壁沉積等生化過程中起到關(guān)鍵作用。因此，根據(jù)kME值初步篩選出模塊中的關(guān)鍵基因，隨后對(duì)這些基因進(jìn)行擬南芥同源比對(duì)的功能注釋（表1），并將比對(duì)到的關(guān)鍵基因與連接度前15的基因利用cytoscape進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)的可視化分析（圖7）。在blue模塊中，比對(duì)到多個(gè)縱軸每行代表不同的模塊，橫軸每列代表不同的樣本類型；紅色表示模塊與樣本類型呈正相關(guān)，藍(lán)色表示模塊與樣品類型呈負(fù)相關(guān)；格子上方的數(shù)字代表相關(guān)性系數(shù)，下方括號(hào)中的數(shù)字代表顯著性。

光合作用中的關(guān)鍵酶基因，如LFNR1、PSAK、PETE、PSAN參與了電子傳遞或接受的酶，是光合作用中能量轉(zhuǎn)換的重要一環(huán)；TIM、MDH、GAPB、PGK2、S 1，7 BPase、NADP-ME4則參與光合作用中的碳代謝，為碳水化合物的合成提供了碳骨架或中間產(chǎn)物。在yellow模塊中，比對(duì)到糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖合成相關(guān)的蛋白基因，其中SUS4是參與蔗糖代謝的關(guān)鍵酶基因之一^[32]，它調(diào)節(jié)植物體內(nèi)蔗糖的合成與分解，幫助植物有效利用碳資源；SWEET2參與了糖的跨膜運(yùn)輸，在糖從光合組織運(yùn)送到非光合組織過程中起到關(guān)鍵作用^[33]；CHC1在細(xì)胞內(nèi)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)、胞內(nèi)運(yùn)輸及內(nèi)吞作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括糖、蛋白質(zhì)和其他生物大分子的內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運(yùn)過程^[34]。在turquoise模塊中，比對(duì)到木聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因MUCI21，MUCI21參與半纖維素木聚糖的合成^[35]；PMEI9是果膠甲酯酶抑制子（pectin methyleseterase inhibitor，PMEI），通過調(diào)控PME活性維持細(xì)胞壁的動(dòng)態(tài)平衡^[36]；還比對(duì)到作用于細(xì)胞壁調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)與擴(kuò)張的MSBP1和AGAL1基因^[37-38]。在black模塊中，則比對(duì)到調(diào)控次生細(xì)胞壁生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因NST1^{[14， 39]}以及參與細(xì)胞壁形態(tài)建成的基因CESA3、PER52和RGP2；RABA4A編碼的酶可能參與了細(xì)胞壁聚合物或修飾這些聚合物的酶到達(dá)細(xì)胞壁的過程^{[18， 40-42]}。這些關(guān)鍵基因的發(fā)現(xiàn)揭示了不同組織中的一些特定生理過程，為深入解析甘蔗糖分積累和細(xì)胞壁建成的分子機(jī)制提供新的研究方向，同時(shí)也為改良甘蔗品質(zhì)和抗逆性提供潛在的靶點(diǎn)。

2.5" 核心基因的鑒定與互作網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步探究這4個(gè)關(guān)鍵模塊內(nèi)關(guān)鍵基因與核心基因的關(guān)系，利用cytoscape計(jì)算出網(wǎng)絡(luò)內(nèi)連接度前5的基因，并通過eggNOG在線網(wǎng)站對(duì)這些基因進(jìn)行功能注釋（圖8，表2）。在blue模塊中，Ctg.00355890編碼核糖體L27蛋白（ribosomal L27 protein），核糖體L27蛋白在核糖體上參與蛋白質(zhì)的合成^[43]，可能在光合作用中的酶合成中起到輔助作用。ROC-Ss-Chr07B0008600和ROC-Rec-Chr06A0047720分別編碼了氨基水解酶模塊圓圈代表網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)，連線代表網(wǎng)絡(luò)中的互作關(guān)系，連線越粗、顏色越深說明2個(gè)節(jié)點(diǎn)互作的權(quán)重值越大；黃色節(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中連接度前15的基因，綠色節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵基因。

（amidohydrolase）和Ⅲ類吡哆醛磷酸依賴的氨基轉(zhuǎn)移酶（class-III pyridoxal-phosphate-dependent aminotransferase），這2個(gè)酶都在氮代謝途徑中起到重要作用。而ROC-So-Chr02B0017180、YZ-Rec-Chr03A0001080未注釋到明確的功能。在yellow模塊中，YZ-Rec-Chr01A0037540是一類GTPase家族成員，具有動(dòng)力蛋白樣的結(jié)構(gòu)和功能特性。該超家族成員在細(xì)胞內(nèi)參與多種重要的動(dòng)力學(xué)過程，特別是在膜融合、分裂和囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮關(guān)鍵作用^[44]。比對(duì)到的關(guān)鍵基因ROC-So-Chr01D0016820/SUS2也處于網(wǎng)絡(luò)中較核心的位置，進(jìn)一步說明甘蔗莖髓中發(fā)生著活躍的蔗糖代謝活動(dòng)。YZ-Rec-Chr01B0020420未得到明確的功能注釋；ROC-So-Chr06A0014940則屬于Ras家族。YZ-Rec-Chr02A0018510編碼了微管蛋白（tubulin），微管是細(xì)胞內(nèi)的“高速公路”，許多分子馬達(dá)蛋白（如動(dòng)力蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白）通過微管運(yùn)送細(xì)胞器、囊泡和分子^[45]。結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了yellow模塊主要參與了莖髓中物質(zhì)運(yùn)輸、糖分代謝等生理過程。在turquoise模塊中，ROC-So-Chr03A0023650屬于阿拉伯半乳聚糖肽（arabinogalactan peptide），是一類植物中重要的糖蛋白，是細(xì)胞壁中重要的結(jié)構(gòu)成分，與果膠和多糖相互作用，在細(xì)胞分裂和細(xì)胞壁松弛過程中扮演重要角色^[46]。YZ-So-Chr02B0009400則屬于細(xì)菌轉(zhuǎn)移酶六肽（bacterial transferase hexape-ptide），該結(jié)構(gòu)域存在于許多糖基轉(zhuǎn)移酶中，可能在細(xì)胞壁多糖的修飾中發(fā)揮著重要作用。ROC-RecChr03A0019290未注釋到明確功能，YZ-Rec- Chr01A0055930含有蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。在black模塊中，ROC-So-Chr05A0005210、YZ-So-Chr01B0021400分別屬于泛素結(jié)合酶家族（ubiquitin-conjugating enzyme family）和GRAS家族；YZ-So-Chr03C0027330則含有EF-hand結(jié)構(gòu)域，EF-hand是一種典型的鈣離子（Ca2?）結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠響應(yīng)鈣離子信號(hào)^[47]。Ctg.00282120編碼了含有鋅指結(jié)構(gòu)的組蛋白去甲基化酶（LSD1 zinc finger），參與基因的表觀遺傳調(diào)控^[48]。以上結(jié)果解釋了模塊中核心基因與目標(biāo)關(guān)鍵基因的潛在聯(lián)系，為深入解析目標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供更多參考。

3" 討論

甘蔗的生物質(zhì)主要來源于地上部分的蔗葉和蔗莖，其中葉片通過光合作用將產(chǎn)物運(yùn)輸至蔗莖，驅(qū)動(dòng)糖分積累，是糖分代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵部位。成熟蔗莖由多個(gè)節(jié)間組成，糖分積累呈動(dòng)態(tài)變化：下部節(jié)間積累時(shí)間較長(zhǎng)趨于飽和，而上部幼嫩節(jié)間糖分轉(zhuǎn)運(yùn)更活躍，因此可認(rèn)為甘蔗生長(zhǎng)與糖分積累同步進(jìn)行^[49]。本研究發(fā)現(xiàn)，幼嫩節(jié)間莖髓中的yellow模塊與蔗糖代謝密切相關(guān)，鑒定出關(guān)鍵酶基因SUS4和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SWEET2，揭示了莖髓中糖分動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制。甘蔗糖分性狀受遺傳和環(huán)境雙重影響，其C₄光合代謝網(wǎng)絡(luò)尤為關(guān)鍵。與前人報(bào)道的SsC₄NADP-ME2參與高效的碳固定一致^[4]，本研究結(jié)果表明，NADP-ME4在光合作用的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能與其他酶協(xié)同作用提高光合效率，為進(jìn)一步研究C₄光合途徑提供參考依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，Purple、paleturquoise、magenta、midnightblue模塊在R7S、R17P、R5P、R1Y組織中特異表達(dá)，KEGG代謝通路和GO功能富集分析表明這幾個(gè)模塊在組織中發(fā)揮著特定功能。不飽和脂肪酸是葉綠體等生物質(zhì)膜的重要組成成分，而生物素代謝通路也與脂肪酸的合成及膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)^[50]，KEGG代謝通路表明，不飽和脂肪酸生物合成的第1節(jié)葉的光系統(tǒng)可能還在積極的建成當(dāng)中，在進(jìn)行光合作用的同時(shí)可能伴隨著生物質(zhì)膜的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)提高光合效率和促進(jìn)糖分合成及積累具有重要作用。在導(dǎo)管和纖維細(xì)胞分化的過程中，細(xì)胞木質(zhì)化的同時(shí)也進(jìn)行著細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death， PCD）生物過程^[51]；木質(zhì)化強(qiáng)化了細(xì)胞壁，而PCD則清除了細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，使細(xì)胞形成外強(qiáng)中空的結(jié)構(gòu)，為植物提供機(jī)械強(qiáng)度和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐ǖ馈Ｄ举|(zhì)素是苯丙氨酸代謝過程中的次級(jí)產(chǎn)物，這與purple模塊中富集到的苯丙氨酸相關(guān)的KEGG代謝通路和PCD生物過程的GO功能相互關(guān)聯(lián)，因此第7節(jié)間莖髓可能是細(xì)胞木質(zhì)化并發(fā)生PCD的活躍部位。在第5節(jié)間莖皮中，magenta模塊的特異表達(dá)說明該組織與信號(hào)的感應(yīng)和傳導(dǎo)密切相關(guān)。

莖桿的機(jī)械強(qiáng)度對(duì)甘蔗的直立生長(zhǎng)至關(guān)重要。對(duì)甘蔗莖桿的力學(xué)試驗(yàn)表明，莖髓不是主要承擔(dān)莖桿機(jī)械強(qiáng)度的組織，而莖皮則決定了莖桿的機(jī)械強(qiáng)度。多個(gè)甘蔗品種的研究表明，甘蔗在第1～5節(jié)間蔗莖機(jī)械強(qiáng)度快速增強(qiáng)，第6～10節(jié)間處于過渡階段，第11節(jié)間之后有2次增強(qiáng)的趨勢(shì)；且莖皮中細(xì)胞壁成分纖維素對(duì)莖桿機(jī)械強(qiáng)度的形成起決定作用^[11]。這些發(fā)現(xiàn)與black模塊中鑒定到的次生細(xì)胞壁合成開關(guān)NST1以及纖維素合酶CESA3等基因相對(duì)應(yīng)，表明black模塊確實(shí)是挖掘細(xì)胞壁形成相關(guān)基因的關(guān)鍵模塊，也表明該模塊可能在莖皮機(jī)械強(qiáng)度的形成中發(fā)揮作用。

甘蔗遺傳背景復(fù)雜，其細(xì)胞壁生物合成的分子機(jī)制研究面臨極大挑戰(zhàn)。大量研究表明，NAC-MYB的級(jí)聯(lián)調(diào)控作為次生細(xì)胞壁生物合成的主開關(guān)，調(diào)控下游纖維素、木質(zhì)素和半纖維素生物合成基因^[52-53]。本研究通過構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，在turquoise模塊鑒定到參與半纖維素木聚糖合成與修飾的MUCI21，在擬南芥中，MUCI21通過對(duì)木聚糖修飾使得果膠附著在種子表面^[35]，表明MUCI21可能在初生細(xì)胞壁中參與果膠與木聚糖的交聯(lián)與沉積。而AGAL1編碼α-半乳糖苷酶參與半乳糖類多糖的代謝^[38]。在初生細(xì)胞壁中，AGAL1可能通過調(diào)控半纖維素的降解和重塑，為細(xì)胞壁生長(zhǎng)和擴(kuò)展提供糖基化前體或調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的柔韌性。此外，PEMI9和MSBP1則可能分別通過抑制果膠甲酯化酶活性和調(diào)控木質(zhì)素合成來平維持初生細(xì)胞壁的動(dòng)態(tài)平衡，以適應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)變化^[36-37]。這些基因的共同作用使甘蔗莖髓細(xì)胞壁在快速生長(zhǎng)的同時(shí)具備足夠的強(qiáng)度和彈性，從而滿足其機(jī)械支持和生理功能需求。LIU等^[39]的研究還鑒定到調(diào)控次生細(xì)胞壁生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因NST1，表明甘蔗中次生細(xì)胞壁的生物合成可能也是由NAC類轉(zhuǎn)錄因子主導(dǎo)。此外，次生細(xì)胞壁形態(tài)和結(jié)構(gòu)的差異，會(huì)對(duì)細(xì)胞壁酶解糖化產(chǎn)生很大影響。因此，挖掘甘蔗中次生細(xì)胞壁修飾的關(guān)鍵基因，對(duì)改良細(xì)胞壁骨架并提高細(xì)胞壁的消化效率具有重要意義。在black模塊中，鑒定到的RGP2、RABA4A和PER52都在擬南芥中參與細(xì)胞壁的修飾；RGP2將UDP-阿拉伯吡喃糖（UDP-Arap）轉(zhuǎn)化為UDP-阿拉伯呋喃糖（UDP-Araf），這一轉(zhuǎn)化過程對(duì)含阿拉伯多糖的合成至關(guān)重要^[42]。RABA4A則參與將構(gòu)成細(xì)胞壁的多糖（如纖維素、半纖維素）及其合成酶運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外基質(zhì)區(qū)域，從而支持細(xì)胞壁的組裝和加強(qiáng)^[41]；PER52作為一種過氧化物酶，通過催化過氧化氫（H₂O₂）分解產(chǎn)生自由基。這些自由基能夠促進(jìn)木質(zhì)素單體（例如松柏醇、芥子醇）的聚合，將它們嵌入到細(xì)胞壁中，從而增強(qiáng)細(xì)胞壁的強(qiáng)度和穩(wěn)定性^[18]?？梢?，在甘蔗莖皮中，細(xì)胞壁可能進(jìn)行著復(fù)雜的修飾，最終形成了高機(jī)械強(qiáng)度的莖皮。

4" 結(jié)論

本研究通過WGCNA分析甘蔗品種新臺(tái)糖22號(hào)不同節(jié)間組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，構(gòu)建34個(gè)共表達(dá)模塊。在模塊與組織類型的相關(guān)性分析中，鑒定分別在葉、莖髓、莖皮組織中共表達(dá)的模塊，深入挖掘模塊中的關(guān)鍵基因，并且將這些已在擬南芥中報(bào)道的關(guān)鍵基因與模塊中的核心基因構(gòu)建互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為研究甘蔗糖分積累和細(xì)胞壁建成提供重要參考和候選基因。

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