橡膠樹(shù)HbMVD1基因啟動(dòng)子克隆及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子篩選

摘" 要：轉(zhuǎn)錄調(diào)控是生命活動(dòng)的重要調(diào)控方式之一。天然橡膠是一種重要的工業(yè)原材料，主要來(lái)源于橡膠樹(shù)。天然橡膠生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是近年來(lái)橡膠樹(shù)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶（MVD）是天然橡膠生物合成途徑的關(guān)鍵酶，目前對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚不清楚。本研究克隆了長(zhǎng)度為1500 bp的橡膠樹(shù)HbMVD1啟動(dòng)子，序列分析顯示其含有茉莉酸響應(yīng)、乙烯響應(yīng)、機(jī)械傷害響應(yīng)、光響應(yīng)、MYC結(jié)合等順式作用元件。自激活抑制梯度試驗(yàn)顯示，AbA濃度為100 ng/mL時(shí)，pAbAi-pHbMVD1誘餌載體的轉(zhuǎn)錄自激活得到有效抑制。利用酵母單雜交技術(shù)從橡膠樹(shù)膠乳酵母cDNA文庫(kù)共篩選到13個(gè)與HbMVD1啟動(dòng)子結(jié)合的非冗余蛋白，包括1個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子（HbWRKY1）、1個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子、1個(gè)G-box結(jié)合因子。組織特異性分析顯示這些蛋白的編碼基因在不同組織間存在不同的表達(dá)模式。轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析顯示HbWRKY1在體內(nèi)可以激活HbMVD1基因的表達(dá)。分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，HbWRKY1與HbMVD1啟動(dòng)子的機(jī)械傷害響應(yīng)元件結(jié)合，并鑒定到11個(gè)潛在的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)。本研究為進(jìn)一步揭示橡膠樹(shù)HbMVD1轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù)；HbMVD1啟動(dòng)子；酵母單雜交；轉(zhuǎn)錄因子；轉(zhuǎn)錄調(diào)控中圖分類(lèi)號(hào)：S794.1 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning of the"HbMVD1"Gene Promoter and Screening of Transcription Regulatory Factors in Rubber Tree

WEN Lianxuan^1，2， YANG Shuguang¹， SHI Minjing¹， DENG Xiaomin^1，3， CHAO Jinquan^1，3*

1. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Key Laboratory for Tropical Crop Breeding / Key Laboratory of Biology amp; Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Graduate School， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Beijing 100081， China; 3. Sanya Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Sanya， Hainan 572024， China

Abstract："Transcriptional regulation is one of the pivotal mechanisms governing biological activities. Natural rubber （NR）， a crucial industrial raw material， is predominantly derived from rubber trees. The transcriptional regulation of NR biosynthesis has emerged as a focal point in the fundamental research of rubber tree in recent years. Mevalonate diphosphate decarboxylase （MVD） is a key enzyme in the biosynthetic pathway of NR， yet its transcriptional regulation remains poorly understood. In this study， a 1500 bp promoter region of the"HbMVD1"gene from rubber tree was cloned. Sequence analysis revealed the presence of various"cis-acting elements， including the responsive to jasmonic acid， ethylene， mechanical wounding， light， and MYC binding. A gradient assay for autoactivation suppression demonstrated that the transcriptional autoactivation of the pAbAi-pHbMVD1 bait vector was effectively inhibited at an AbA concentration of 100 ng/mL. 13 non-redundant proteins from a rubber tree latex yeast cDNA library that interact with the"HbMVD1"promoter， including one WRKY transcription factor （HbWRKY1）， one heat shock transcription factor， and one G-box binding factor were identified utilizing yeast one-hybrid screening. Tissue-specific expression analysis indicated that the genes encoding the proteins exhibited distinct expression patterns across different tissues. Transcriptional regulation analysis showed that HbWRKY1 activated the expression of"HbMVD1 in vivo. Molecular docking revealed that HbWRKY1 bound to the mechanical wounding element of the"HbMVD1"promoter， and 11 potential amino acid binding sites were identified. This study would lay the groundwork for further elucidating the transcriptional regulatory network of"HbMVD1"in rubber tree.

Keywords："rubber tree;"HbMVD1"promoter; yeast one-hybrid library; transcription factor; transcriptional regulation

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.08.001

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是生命活動(dòng)的重要調(diào)控方式之一，是指在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中通過(guò)一系列復(fù)雜的機(jī)制對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控^[1]。轉(zhuǎn)錄因子是執(zhí)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要成員。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)識(shí)別并結(jié)合到DNA上的順式作用元件，激活或抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)各種外界刺激以及自身生理反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程^[2]。酵母單雜交技術(shù)（yeast one-hybrid method，Y1H）是將順式作用元件序列和編碼轉(zhuǎn)錄因子的序列分別構(gòu)建到含報(bào)告基因及激活結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)化酵母觀察是否啟動(dòng)下游報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)確定轉(zhuǎn)錄因子是否和順式作用元件結(jié)合^[3]。目前Y1H已是篩選鑒定與順式作用元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的常用技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。如余婧等^[4]利用Y1H從煙草酵母cDNA文庫(kù)中篩選到與NtCBT基因啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子ANL2、ML1及NF-YA3；CAO等^[5]利用Y1H從百合酵母cDNA文庫(kù)中篩選到與LhMYBSPATTER基因啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子ERF4和MYB4，并利用熒光素酶實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)證明MYB4對(duì)LhMYBSPATTER基因的表達(dá)起激活作用而ERF4對(duì)LhMYBSPATTER基因的表達(dá)起抑制作用。

天然橡膠是一種重要的工業(yè)原材料，主要來(lái)源于橡膠樹(shù)。與人工合成橡膠相比，天然橡膠具有良好的絕緣性、耐磨性和抗拉性，被廣泛運(yùn)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、國(guó)防建設(shè)、交通運(yùn)輸、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域，在國(guó)計(jì)民生中發(fā)揮著不可替代的作用^[6-7]。天然橡膠本質(zhì)是高分子聚異戊二烯鏈，分子量可達(dá)數(shù)百萬(wàn)道爾頓。自然界中存在2種主要的異戊二烯焦磷酸（isoprene pyrophosphate， IPP）合成途徑：甲羥戊酸（mevalonic acid， MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（2-methyl-D-erythr-itol-4-phosphate， MEP）途徑，其中MVA途徑與橡膠樹(shù)中的天然橡膠生物合成密切相關(guān)。MVA途徑以乙酰輔酶A為底物，經(jīng)過(guò)6步酶促反應(yīng)最終形成IPP。焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶（meva-lonate-5- pyrophosphate decarboxylase， MVD）催化MVAPP脫去1分子的CO₂和H₂O形成IPP，是MVA途徑關(guān)鍵酶之一^[8-11]。1971年SKILLETER等^[12]從橡膠樹(shù)膠乳中成功純化MVD蛋白，并對(duì)其酶學(xué)活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其活性與膠乳代謝存在顯著正相關(guān)。但有關(guān)MVD的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究尚無(wú)報(bào)道。本研究克隆了橡膠樹(shù)HbMVD1的啟動(dòng)子，通過(guò)篩選膠乳酵母cDNA文庫(kù)，得到13個(gè)與HbMVD1啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白，包括3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。本研究為進(jìn)一步揭示天然橡膠生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1" 材料

橡膠樹(shù)無(wú)性系熱研8-79定植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州基地。橡膠樹(shù)熱研8-79膠乳酵母cDNA文庫(kù)為本課題組保存。多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；平末端克隆試劑盒（pEASY?-Blunt Cloning Kit）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；膠回收試劑盒（FastPureGel DNA Extraction Mini Kit）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；同源重組試劑盒（ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；酵母菌株Y1H Gold、農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑及生化試劑均為國(guó)產(chǎn)超純和分析純。

1.2""方法

1.2.1 "橡膠樹(shù)基因組DNA提取" 取橡膠樹(shù)熱研8-79幼嫩葉片，液氮研磨后根據(jù)多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA提取，并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整度檢測(cè)。

1.2.2""HbMVD1啟動(dòng)子克隆及順式作用元件預(yù)測(cè)" 從橡膠樹(shù)熱研8-79基因組數(shù)據(jù)中獲取HbMVD1基因的啟動(dòng)子序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆HbMVD1啟動(dòng)子的上游引物（proHbM-VD1-F：TGTAGCATTGATGCAGCTT）和下游引物（proHbMVD1-R：TACAGCAAGCAACACAC CA）。以橡膠樹(shù)熱研8-79基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：DNA模板1"μL，2×PrimeSTAR mix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各1"μL，超純水22"μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5"℃ 3"min；95"℃ 30"s，56"℃ 30"s，72"℃ 30"s，35個(gè)循環(huán)；72"℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收連接至pEASY-Blunt克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，過(guò)夜培養(yǎng)后挑選陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的HbMVD1啟動(dòng)子（proHbMVD1）序列提交至PlantCARE（http：// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件分析。

1.2.3 "pAbAi-pHbMVD1誘餌載體構(gòu)建" 以測(cè)序正確的pEASY-proHbMVD1質(zhì)粒為模板，用攜帶pAbAi載體同源臂的引物pHbMVD1-F（AAGC TTGAATTCGAGCTGTAGCATTGATGCAGCTT）和pHbMVD1-R（ACAGATCCCCGGGTACCGAT ACAGCAAGCAACACAC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收目的片段，通過(guò)ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit同源重組方法將片段構(gòu)建至pAbAi載體獲得pAbAi-pHbMVD1誘餌載體，并以pHbMVD1-F端引物和pAbAi載體通用R端引物（CCATCTCGAA AAAGGGTTTGCC）對(duì)重組載體進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.4" 最低AbA濃度測(cè)定 "將pAbAi-pHbMVD1誘餌載體和pAbAi-p53陽(yáng)性對(duì)照載體線性化，分別轉(zhuǎn)化酵母Y1H Gold感受態(tài)細(xì)胞并涂布于SD/-Ura固體培養(yǎng)基，30"℃恒溫倒置培養(yǎng)3 d。分別挑選陽(yáng)性菌落，經(jīng)無(wú)菌水稀釋后涂布到SD/- Ura、SD/-Ura/AbAi（100 ng/mL）、SD/-Ura/AbAi（150 ng/mL）、SD/-Ura/AbAi（200 ng/mL）的固體培養(yǎng)基上，30"℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察平板上菌落的生長(zhǎng)情況。

1.2.5" 酵母單雜交cDNA文庫(kù)篩選" 從SD/-Ura平板上挑取含pAbAi-pHbMVD1誘餌載體的Y1H Gold單菌落，接種于5 mL SD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30"℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)16～18 h至飽和。取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至50 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30"℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5。室溫下1000×g離心5 min收集菌體，用25 mL無(wú)菌水洗滌并重懸于1"mL 1.1×TE/LiAc緩沖液（10"mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、100 mmol/L LiAc， pH 7.5）。取50"μL含pAbAi-pHbMVD1誘餌載體的Y1H Gold感受態(tài)細(xì)胞，依次加入：2 μg膠乳酵母cDNA文庫(kù)質(zhì)粒DNA、10 μL鮭精DNA（10 mg/mL，預(yù)先煮沸5 min后冰浴）、500 μL PEG/LiAc溶液（40% PEG4000、100 mmol/L LiAc、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA， pH 7.5）輕柔混勻后于30"℃水浴孵育30 min。加入20 μL DMSO（終濃度為7%），42"℃熱激15 min。室溫下1000×g離心5 min，棄上清，菌體用1 mL YPDA重懸。30"℃、250 r/min復(fù)蘇培養(yǎng)1 h。將復(fù)蘇培養(yǎng)物1000×g離心5 min，菌體用100 μL無(wú)菌水重懸。取10 μL涂布于SD/-Ura-Leu/AbA（100 ng/mL）篩選平板，30"℃倒置培養(yǎng)3～5 d。待陽(yáng)性克隆菌斑直徑達(dá)1～ 2"mm時(shí)，挑取單菌落至新鮮SD/-Ura-Leu/AbA平板進(jìn)行二次篩選。以含pAbAi-p53與pGADT53m的酵母菌株為陽(yáng)性對(duì)照，含pAbAi-pHbMVD1與pGADT53m的酵母菌株為陰性對(duì)照。pGADT53m載體為課題組保存。

1.2.6" 陽(yáng)性克隆測(cè)序 "將陽(yáng)性菌落接種于SD/- Ura-Leu/AbAi的液體培養(yǎng)基，30nbsp;℃搖床震蕩培養(yǎng)。以pGADT7載體測(cè)序引物（F： TAATACGAC TCACTATAGGGC; R： TAAGAGTCACTTTAAAA TTTGTAT）進(jìn)行菌液PCR，取5 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，挑選條帶清晰的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.7" 表達(dá)譜數(shù)據(jù)提取" 從國(guó)家基因組數(shù)據(jù)中心下載橡膠樹(shù)形成層、樹(shù)皮內(nèi)層、初生膠乳、次生膠乳、雌花、雄花、葉片等7個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)序列號(hào)為PRJCA004986。利用Tophat程序，將所下載數(shù)據(jù)與橡膠樹(shù)熱研8-79基因組序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)Cufflink程序完成基因的相對(duì)表達(dá)（FPKM）值計(jì)算。提取目的基因?qū)?yīng)的FPKM值，經(jīng)log₂轉(zhuǎn)換后通過(guò)Genesis軟件進(jìn)行表達(dá)熱圖繪制。

1.2.8 "轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析" 以特異引物0800-F（GG GCGAATTGGGTACCTGTAGCATTGATGCAGCTT）和0800-R（AGGAATTCGATATCAAGCTTTAC AGCAAGCAACACACCA）擴(kuò)增pEASY-proHbM VD1質(zhì)粒，以特異引物2300-F（GACAGGGTA CCCGGGGATCCATGACTTCCAAAGTTCTC）和2300-R（ACCATGGTACTAGTGTCGACTTAGCT TTGGACAGGCTCTGC）擴(kuò)增含HbWRKY1基因的陽(yáng)性酵母菌。參照ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit同源重組試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，將擴(kuò)增片段分別連入pGreenⅡ0800-LUC載體和pCAM-BIA2300載體，獲得pGreenⅡ0800-proHbMVD1： LUC和pCAMBIA2300-HbWRKY1重組載體。將測(cè)序正確的pGreenⅡ0800-proHbMVD1-LUC和pCAMBIA2300-HbWRKY1重組載體，以及pCAMBIA2300空載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，挑選單菌落于YEP液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)（30"℃，220 r/min）。離心收集菌體并用YEP液體培養(yǎng)基重懸，按試驗(yàn)組（pGreenⅡ0800-"proHbMVD1-LUC∶pCAMBIA2300-HbWRKY1= 1∶1）和對(duì)照組（pGreenⅡ0800-proHbMVD1- LUC∶pCAMBIA2300=1∶1）進(jìn)行菌液混合并調(diào)整至OD₆₀₀=0.6，通過(guò)注射法注射煙草葉片。注射后的煙草暗培養(yǎng)48 h后噴施D-熒光素鉀鹽溶液，置于Princeton公司的活體植物發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：LumaZonepylon 2048B）中觀察。

1.2.9" 互作位點(diǎn)分析 "通過(guò)HelixFold3（https：// paddlehelix.baidu.com/？redirect=console）在線軟件

分析HbWRKY1與不同順式作用元件之間的相互作用，并進(jìn)一步利用PyMOL3.1軟件（Schr?dinger，美國(guó)）展示互作的氨基酸位點(diǎn)。

2" 結(jié)果與分析

2.1""HbMVD1啟動(dòng)子克隆及順式作用元件分析

提取橡膠樹(shù)熱研8-79基因組DNA作為模板，以HbMVD1啟動(dòng)子引物進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序分析，成功獲得長(zhǎng)度為1500 bp的HbMVD1啟動(dòng)子序列（圖1A）。將序列提交至PlantCARE在線網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果顯示，HbMVD1啟動(dòng)子除了常見(jiàn)的TATA-box和CAAT-box等核心元件外，還含有茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif）、乙烯響應(yīng)元件（ERE）、器械傷害響應(yīng)元件（WUN-motif）、MYC結(jié)合元件（MYC）、光響應(yīng)元件（Box 4）等（圖1B）。

2.2" pAbAi-pHbMVD1誘餌載體構(gòu)建

通過(guò)同源重組方式將HbMVD1構(gòu)建至pAbAi得到pAbAi-pHbMVD1誘餌載體，利用HbMVD1啟動(dòng)子F端引物和pAbAi載體通用R端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果顯示可以擴(kuò)增出1685 bp目的片段（1500 bp+185 bp），而以空載體為模板未擴(kuò)增出目的條帶（圖2）。

2.3" AbA最小抑制濃度確定

取轉(zhuǎn)化pAbAi-pHbMVD1誘餌載體的YIH Gold酵母菌株涂布于不同濃度AbA的SD/-Ura固體培養(yǎng)基上，以含p53-AbAi載體的YIH Gold酵母菌株為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，p53-AbAi陽(yáng)性對(duì)照菌株在AbA濃度為200 ng/mL時(shí)生長(zhǎng)被抑制，而pAbAi-pHbMVD1測(cè)試菌株在AbA濃度為100 ng/mL時(shí)生長(zhǎng)就被抑制（圖3），因此AbA最小濃度為100 ng/mL。

2.4""酵母單雜交文庫(kù)篩選

將膠乳cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化至含有pAbAi-"pHbMVD1的酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于多個(gè)SD/- Ura-Leu篩選平板進(jìn)行文庫(kù)篩選（圖4A），并將候選陽(yáng)性克隆進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至新的SD/-Ura-Leu篩選平板培養(yǎng)，最終得到34個(gè)陽(yáng)性克隆，編號(hào)P1～P34（圖4B）。

2.5""克隆測(cè)序結(jié)果分析

將獲得的34個(gè)陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增測(cè)序，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)后共得到13個(gè)可能與HbMVD1啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白，包括注釋為磷脂酶（Hb15g055630）、細(xì)胞分裂周期因子

（Hb07g037490）、生長(zhǎng)素抑制蛋白（Hb04g-047470）、小分子熱休克蛋白（Hb04g052040）、蛋白酶抑制劑蛋白（Hb06g002380）、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（Hb07g028960）、磷脂酸磷酸酶（Hb07 g032180）、鐵硫簇組裝酶（Hb07g037260）、F-box蛋白（Hb12g001190）、橡膠延伸因子（Hb12 g002580）等10個(gè)蛋白。此外，還篩選到3個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子，分別是Hb18g010770（WRKY轉(zhuǎn)錄因子）、Hb13g050000（G-box結(jié)合因子）、Hb16 g003060（熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子）（表1）。

2.6""組織特異性表達(dá)分析

利用課題組保存的7個(gè)橡膠樹(shù)組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析13個(gè)蛋白編碼基因的組織特異性（圖5）。結(jié)果顯示，Hb15g055630和Hb07g037260在7個(gè)組織中均高豐度表達(dá)，Hb06g002380在7個(gè)組織中的表達(dá)豐度很低甚至不表達(dá)，Hb07g037490和Hb12g001190在膠乳中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織。此外，Hb13g050000、Hb07g028960、Hb12g 002580、Hb16g003060在開(kāi)割膠乳中的表達(dá)量高于初生膠乳。

2.7" HbWRKY1對(duì)HbMVD1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析及互作位點(diǎn)鑒定

Blast比對(duì)分析顯示，Hb18g010770序列與前人報(bào)道的橡膠樹(shù)HbWRKY1完全一致。為鑒定HbWRKY1對(duì)HbMVD1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，將攜帶proHbMVD1-0800重組載體（含熒光素酶報(bào)告基因）和pCAMBIA2300-HbWRKY1重組載體的農(nóng)桿菌注射煙草葉片。活體成像分析顯示，與空載組相比，HbWRKY1組熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)（圖6A），表明HbWRKY1可以在體內(nèi)激活HbMVD1啟動(dòng)子的表達(dá)。

為進(jìn)一步解析HbWRKY1與HbMVD1啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，本研究利用HelixFold3分析HbMVD1啟動(dòng)子上不同順式作用元件與HbWRKY1間的互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)僅WUN-motif與HbWRKY1存在相互作用，且在2埃距離范圍內(nèi)鑒定到11個(gè)與WUN-motif互作的氨基酸：Gln-101、Asn-224、Gly-292、Gly-396、Trp-405、Asn-406、Ser-409、Arg-433、Ser-434、Val-448和Ile-449（圖6B）。

3""討論

天然橡膠的生物合成大致可分為MVA途徑的IPP合成（pre-IPP）和橡膠鏈的聚合延伸（post-IPP）2個(gè)階段^[13]。近年來(lái)天然橡膠生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是橡膠樹(shù)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，先后有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能得到揭示，如HbMYC2結(jié)合并激活HbSRPP和HbFPS基因的啟動(dòng)子、HbCZF1結(jié)合并激活HbHMGR基因的啟動(dòng)子、HbMADS4結(jié)合并抑制HbSRPP基因的啟動(dòng)子等^[14-16]。MVD是橡膠生物合成途徑關(guān)鍵酶之一，目前對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚無(wú)報(bào)道。本研究克隆了橡膠樹(shù)HbMVD1啟動(dòng)子序列，并通過(guò)酵母單雜交文庫(kù)篩選獲得了3個(gè)與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子成員。

編碼G-box結(jié)合因子的Hb13g050000屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族。bZIP是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其特征是bZIP結(jié)構(gòu)域高度保守^[17]。前人研究顯示，bZIP轉(zhuǎn)錄因子可以與ABRE、H-box、G-box、GLM、ACE等順式作用元件相結(jié)合，廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫等生物學(xué)過(guò)程^[18]。有研究表明bZIP也參與植物次生代謝物的合成調(diào)控，刺五加的3個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子可以與刺五加皂苷合成關(guān)鍵基因（EsFPS，"EsSS，"EsSE）啟動(dòng)子結(jié)合并激活其表達(dá)^[19]；擬南芥的bZIP轉(zhuǎn)錄因子HY5可以結(jié)合萜類(lèi)合成關(guān)鍵基因AtTPS03的啟動(dòng)子并激活其表達(dá)^[20]。作為高分子萜類(lèi)化合物，天然橡膠的合成途徑屬于典型的次生代謝。G-box結(jié)合因子的鑒定為深入研究HbMVD1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factor， HSF）是植物中研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其結(jié)構(gòu)可以分為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、寡聚化結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)、核輸出信號(hào)和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域等5個(gè)部分，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)與啟動(dòng)子上的順式作用元件結(jié)合，廣泛調(diào)控植物對(duì)多種非生物脅迫尤其是低溫/高溫脅迫的響應(yīng)^[21]。在橡膠樹(shù)中，李言等^[22]分析了30個(gè)HbHSF家族成員在低溫脅迫下抗寒品種和不抗寒品種中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)成員在抗寒品種中的表達(dá)量顯著高于不抗寒品種。有研究表明HSF也參與植物次生代謝物的合成調(diào)控。KUMAR等^[23]將HvHSFA2e基因在大麥中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的黃酮和萜類(lèi)代謝主要基因的表達(dá)量顯著上調(diào)；ZHANG等^[24]發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)的CsHSFA1b和CsHSFA2可以通過(guò)激活茉莉酸途徑抑制因子CsJAZ6的表達(dá)進(jìn)而減少兒茶素的積累。本研究鑒定到1個(gè)HSF成員與HbMVD1啟動(dòng)子結(jié)合，為進(jìn)一步解析HSF對(duì)天然橡膠的調(diào)控機(jī)制提供新的思路。

WRKY是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，其特征是含有1～2個(gè)高度保守的WRKYGQK基序以及1個(gè)鋅指基序^[25]。通過(guò)與啟動(dòng)子序列上的順式作用元件結(jié)合，WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及響應(yīng)生物/非生物脅迫的生物學(xué)過(guò)程^[26]。前人從橡膠樹(shù)基因組中鑒定到81個(gè)HbWRKY成員，其中HbWRKY27結(jié)合并激活HbFPS基因的啟動(dòng)子，HbWRKY1結(jié)合并抑制HbSRPP基因的啟動(dòng)子^[27-29]。本研究通過(guò)酵母單雜交篩庫(kù)發(fā)現(xiàn)HbWRKY1也可以結(jié)合HbMVD1啟動(dòng)子，進(jìn)一步的活體成像試驗(yàn)證明HbWRKY1可以激活HbMVD1啟動(dòng)子的表達(dá)?；贛VD是pre-IPP階段關(guān)鍵酶而SRPP是post-IPP階段的關(guān)鍵酶，推測(cè)HbWRKY1在天然橡膠生物合成的不同階段起不同的調(diào)控作用，這可能是一種精細(xì)的調(diào)控模式，進(jìn)而控制天然橡膠的生物合成。

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域的靶向順式作用元件結(jié)合進(jìn)而調(diào)控功能基因的表達(dá)。本研究對(duì)HbMVD1啟動(dòng)子序列分析鑒定到多個(gè)順式作用元件，如CGTCA-motif、ERE、WUN-motif、MYC、ARE等。分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)僅WUN-motif與HbWRKY1存在互作，且在2埃范圍內(nèi)鑒定到11個(gè)潛在的互作氨基酸。WUN-motif是一種與傷害反應(yīng)相關(guān)的作用元件，通過(guò)響應(yīng)機(jī)械傷害來(lái)激活目標(biāo)基因的表達(dá)^[30]。在生產(chǎn)中，割膠是收獲橡膠樹(shù)天然橡膠的唯一方式。割膠不僅可以提高天然橡膠合成效率，還可以激活橡膠合成相關(guān)基因如HbMVD1等的表達(dá)^[16]?？紤]到割膠也是一種嚴(yán)重的機(jī)械傷害，推測(cè)割膠后HbWRKY1可能通過(guò)與HbMVD1啟動(dòng)子上的WUN-motif順式作用元件結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)天然橡膠的生物合成。

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