木薯C3H基因鑒定及應答菜豆黃單胞菌侵染表達模式分析

摘" 要：木薯是世界三大薯類作物之一，同時也是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要糧食作物。木薯在生長發(fā)育過程中易遭受病蟲害影響，其中細菌性枯萎?。╟assava bacterial blight， CBB）是為害木薯的重要病害。CCCH（C3H）型鋅指蛋白廣泛存在于各種生物體內(nèi)，不僅參與植物生長發(fā)育、激素調(diào)控，同時也響應生物及非生物脅迫。在擬南芥、水稻、大豆、小麥、矮牽牛、棉花等植物中，部分C3H基因的功能已有報道，但木薯C3H基因功能還鮮有研究。本研究利用生物信息學工具分析木薯MeC3H基因家族成員的系統(tǒng)進化特征、染色體位置、基因結(jié)構(gòu)、啟動子順式作用元件和共線性等，并利用轉(zhuǎn)錄組和實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)研究木薯受病原菌（Xanthomonas phaseoli pv. manihotis， Xpm）侵染后，MeC3H基因的表達模式。結(jié)果表明：木薯共有89個MeC3H基因，命名為MeC3H01～MeC3H89，分布在18條不同的染色體上；系統(tǒng)進化樹顯示，這89個MeC3H蛋白分為4個亞家族；MeC3H基因啟動子含有逆境、植物激素以及植物生長發(fā)育響應元件；共線性分析發(fā)現(xiàn)，有39對木薯C3H基因具有同源關(guān)系，表明在進化過程中可能通過復制擴增基因家族成員；通過轉(zhuǎn)錄組和實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，在Xpm處理后，部分C3H基因表達發(fā)生顯著變化，其中MeC3H49、MeC3H42、MeC3H68的表達量顯著上調(diào)，MeC3H35、MeC3H77、MeC3H36、MeC3H31、MeC3H86的表達量顯著下調(diào)。本研究結(jié)果為進一步分析MeC3H基因的功能提供參考。

關(guān)鍵詞：木薯；C3H基因家族：基因表達：抗病響應：細菌性枯萎病中圖分類號：S533 """""文獻標志碼：A

Identification of Cassava C3H Genes and Analysis of the Expression Pattern in Response to Xanthomonas phaseoli pv. manihotis

LI Min， WEI Bingzheng， JIA Suhang， CHEN Yinhua， LI Chunxia^*

School of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University / Key Laboratory of Sustainable Utilization of Tropical Biological Resources， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： Cassava is one of the three major tuber crops in the world， and is also an important food crop in tropical and subtropical regions. Bacterial blight （CBB） is an important disease for cassava. CCCH （C3H）-type zinc finger proteins are widely present in most of organisms， not only involved in plant growth and development， hormone regulation， but also in response to biotic and abiotic stresses. Although the function of some C3H genes in other plants has been reported， but that in cassava has not been reported. In this study， we analyzed the phylogenetic characteristics， chromosome location， gene structure， promoter cis-acting elements and collinearity of cassava C3H genes. A total of 89 C3H genes （MeC3H01?MeC3H89） were identified in cassava， which were distributed on 18 chromosomes. The phylogenetic tree showed that 89 MeC3H proteins were classified into 4 subfamilies. The C3H gene promoters contains multiple stress， hormones， plant growth and development response elements. 39 pairs of cassava C3H genes had homologous relationships， indicating that these genes may be amplified by replication during evolution. We also analyzed the response expression pattern of C3H genes after cassava was infected by Xanthomonas phaseoli pv. manihotis （Xpm） by transcriptome and real-time quantitative PCR （qPCR） experiments. The expression levels of MeC3H49， MeC3H42 and MeC3H68 were significantly up-regulated， and those of MeC3H35， MeC3H77， MeC3H36， MeC3H31 and MeC3H86 were significantly down-regulated. In summary， we identified the cassava C3H gene family members and their expression patterns in response to Xpm infection， which lays a foundation for further analysis of the function of MeC3Hs.

Keywords： cassava; C3H gene family; gene expression; disease resistance response; bacterial blight

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.08.002

鋅指蛋白家族是真核生物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其中CCCH（C3H）型鋅指蛋白是一類在生物體中廣泛存在的超家族蛋白，通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控植物的生長發(fā)育、激素響應及生物脅迫^[1]。C3H鋅指轉(zhuǎn)錄因子（zinc finger， Znf）由1～6個CCCH類型的鋅指基序組成，該基序由3個半胱氨酸和1個組氨酸組成^[1]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有68個C3H家族成員，主要參與植物對鹽、干旱等脅迫以及激素、光的響應，同時也調(diào)控花的發(fā)育^[2]。例如，擬南芥HUA1是一種與花發(fā)育相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白^[3]，而AtTZF1可以在細胞核和細胞質(zhì)間穿梭，與DNA、RNA均有結(jié)合活性，參與鹽、激素等響應^[4]。谷子（Setaria italica）SiC3H49是與干旱有關(guān)的鋅指蛋白，可能通過調(diào)控氣孔開放，在耐旱性中發(fā)揮關(guān)鍵作用^[5]；棉花（Gossypium hirsutum）GhZFP1與GZIRD21A、GZIPR5蛋白相互作用介導植物的抗逆性^[6]。在煙草（Nicotiana tabacum）中過表達GhZFP1可顯著增加其耐鹽性和抗病性^[6]。水稻（Oryza sativa） C3H蛋白OsDOS可調(diào)控茉莉酸信號轉(zhuǎn)導，過表達可延緩葉片衰老^[7]；OsLOL2通過調(diào)節(jié)赤霉素（gibberellins， GAs）生物合成、調(diào)控水稻生長^[8]。此外，C3H還參與植物的抗病響應。例如，水稻C3H基因OsBIRF轉(zhuǎn)入煙草后可增強煙草對花葉病毒、野火病毒和煙粉虱的抗性^[9]；擬南芥AtC3H18正調(diào)控水楊酸（salicylic acid， SA）和茉莉酸（jasmonic acid， JA）信號通路，從而增強對丁香假單胞菌（Pseudo-mo-nas syringae）的抗性^[10]；甘蔗（Saccharum officinarum）C3H基因Sc-zf受黑穗病菌誘導表達，可能調(diào)控植物黑穗病抗性^[11]。目前已在擬南芥、大豆（Glycine max）、水稻、小麥（Triticum aestivum）、棉花等植物中分析和鑒定出C3H基因家族成員^[6]，但在木薯中還未有詳細報道。

木薯（Manihot esculenta）是世界三大薯類作物之一，也是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的糧食和經(jīng)濟作物，有“地下糧倉”的譽稱^[12]。木薯起源于熱帶美洲，迄今已有4000多年的栽培歷史，具有耐干旱、耐貧瘠、生長快、產(chǎn)量高、用途廣等特點^[12]。木薯的塊根是其主要的營養(yǎng)器官，塊根中富含大量的淀粉，是理想的工業(yè)原料，常用于生物燃料、造紙以及紡織業(yè)等。自19世紀20年代引種以來，木薯已成為我國第六大熱帶作物^[13]。華南地區(qū)木薯已經(jīng)有200多年的栽培歷史，隨著我國經(jīng)濟發(fā)展以及對生物能源、糧食生產(chǎn)等方面的需求，木薯已成為我國華南地區(qū)一種重要的旱地經(jīng)濟作物^[12]，同時我國是世界上最大的木薯進口國。

近年來，病害一直是制約木薯產(chǎn)量的重要因素。由菜豆黃單胞菌木薯萎蔫致病變種（Xanth-o-m-onas phaseoli pv. manihotis，Xpm）引起的細菌性枯萎?。╟assava bacterial blight， CBB）是木薯的重要病害，病原菌侵染后通過堵塞維管束、誘發(fā)葉片壞死和系統(tǒng)性萎蔫^[14]，會造成葉片光合效率降低50%以上，嚴重時可使木薯減產(chǎn)20%～ 70%^[15]。當前抗CBB木薯品種極度匱乏，抗病種質(zhì)資源也很少，傳統(tǒng)育種已很難滿足產(chǎn)業(yè)需求，急需獲得新的抗病種質(zhì)或通過現(xiàn)代遺傳技術(shù)創(chuàng)制抗病種質(zhì)。了解木薯響應病原菌的防御機制，對抗病品種培育有重要作用。本研究首先運用生物信息學方法分析鑒定木薯MeC3H基因家族，從系統(tǒng)進化、染色體分布、Motif分析、啟動子順式作用元件、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)等方面分析木薯MeC3H蛋白家族成員的特性，利用轉(zhuǎn)錄組和實時熒光定量PCR等技術(shù)分析C3H基因響應病原菌侵染下的表達模式，為木薯C3H基因的功能解析及木薯抗病育種提供理論依據(jù)。

1 "材料與方法

1.1" 材料

供試材料為華南8號（South China 8，SC8）木薯，菜豆黃單胞菌木薯萎蔫致病變種（Xanthom-o-nas phaseoli pv. manihotis，Xpm）CHN11由本實驗室分離和保存。

1.2 "方法

1.2.1 "MeC3H家族成員篩選與鑒定 "從Phyto-zo-me（https：//phytozome.jgi. doe.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取木薯SC8參考基因組以及擬南芥TAIR10基因組數(shù)據(jù)；從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫下載C3H蛋白的結(jié)構(gòu)域模型PF00642，使用HMMER軟件從木薯數(shù)據(jù)庫中搜索C3H蛋白（E-valuelt;10^?5），初步篩選出木薯MeC3H家族成員，再通過NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/cdd/）、SMART（https：smart.embl.de/）等數(shù)據(jù)庫驗證候選蛋白。

1.2.2 "MeC3H蛋白亞細胞定位預測 "通過Wolf Post Ⅱ（https：//www.genscript.com）在線軟件預測木薯C3H蛋白的亞細胞定位^[2]。

1.2.3" MeC3H家族系統(tǒng)進化分析 "通過MEGA 11.0軟件^[16]（Pennsylvania State University， 美國）中的Muscle功能對木薯和擬南芥C3H蛋白進行序列比對分析，并且采用臨近-連接法（Neighbor- Joining algorithm，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap重復值為1000，用p-distance方法進行計算。對MeC3H家族成員進行亞家族分類，使用Evolview（https：//www.evolgenius.info//evolv-ie-w-v2）在線網(wǎng)站美化。

1.2.4" MeC3H基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析 "根據(jù)木薯基因組注釋文件中MeC3H家族成員結(jié)構(gòu)信息，使用TB tools v2.152^[17]軟件進行結(jié)構(gòu)可視化分析。通過MEME軟件預測C3H蛋白的保守基序（motif數(shù)為15，其他參數(shù)使用默認值），使用TB tools v2.152^[17]軟件可視化motif結(jié)果。

1.2.5 "MeC3H基因啟動子順式作用元件預測" 通過TB tools從木薯基因組序列中提取MeC3H家族成員轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000 bp的序列，利用PlantCARE（http：//bioinfor matics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）在線軟件預測啟動子區(qū)域的順式作用元件^[18]。

1.2.6 "MeC3H基因的染色體定位及共線性分析 "從木薯基因組注釋文件中獲取MeC3H基因家族成員信息，使用TB tools v 2.152^[17]軟件將木薯C3H基因定位在染色體上。采用TB tools軟件的MCScanX工具分析木薯與擬南芥、木薯與煙草C3H基因的共線性。

1.2.7" MeC3H基因的表達模式分析" 為了解MeC3H家族基因受Xpm侵染的誘導表達模式，利用課題組前期獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)，獲得病原菌侵染不同時間點MeC3H家族成員的轉(zhuǎn)錄本FPKM（fragments per kilobase of exon per million reads mapped）值，并利用TBtools v2.152軟件對MeC3H基因表達水平進行聚類分析以及熱圖繪制，挑選16個表達趨勢顯著的MeC3H基因進行qPCR驗證。將生長30 d左右的SC8木薯葉片接種Xpm CHN11菌株^[19]，對照組（CK）用滅菌?ddH₂O替代病原菌懸浮液，其他步驟與試驗組相同，在不同時間點（8、24、50"h）取樣，使用SteadyPure植物RNA快速提取試劑盒（艾科瑞，AG21040）提取總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計以及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性、濃度。利用EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾科瑞，AG11728）合成cDNA。在qTower3實時熒光定量PCR儀（耶拿，美國）上進行PCR。所用引物序列見表1，反應程序為預變性（95"℃，30"s）；變性（95"℃，10 s）、退火延伸（60"℃，30"s），40個循環(huán)。采用2^?ΔΔCt法計算基因相對表達水平^[8]。利用GraphPad Prism 9軟件（GraphPad Software，美國）繪圖，并使用t檢驗比較數(shù)據(jù)間的差異。本試驗包含3個生物學重復和3個技術(shù)重復。

2 "結(jié)果與分析

2.1" MeC3H蛋白亞細胞定位預測

通過全基因組分析發(fā)現(xiàn)，在木薯中共有89個MeC3H家族成員，根據(jù)其在染色體上的位置將其命名為MeC3H01～MeC3H89。據(jù)預測，MeC3H30、MeC3H43、MeC3H60、MeC3H72等4個蛋白定位于細胞質(zhì)；MeC3H01、MeC3H08、MeC3H18、MeC3H20、MeC3H31、MeC3H39、MeC3H44、MeC3H50、MeC3H58等9個蛋白定位于葉綠體；其余76個蛋白定位于細胞核。亞細胞定位預測結(jié)果表明，大部分MeC3H家族成員可能在細胞核中發(fā)揮作用。

2.2" MeC3H基因的染色體定位分析

89個MeC3H基因分布在18條染色體和1條Scaffold上，主要分布于Chr2（8個）、Chr1（7個）、Chr6（7個）、Chr8（7個）、Chr14（7個）、Chr3（6個）、Chr10（6個）、Chr11（6個）、Chr12（5個）、Chr9（4個）、Chr15（4個）、Chr16（4個），其余6條染色體上C3H基因數(shù)量為2～3個（圖1）。除Chr1、Chr2、Chr6、Chr8、Chr14染色體上的C3H基因分布比較集中外，其余染色體上C3H基因分布比較分散。

2.3" MeC3H家族基因系統(tǒng)進化分析

根據(jù)擬南芥（AtC3Hs， 68個）和木薯（MeC3Hs， 89個）C3H蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2）。2個物種C3H蛋白可歸為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個組。Ⅰ組包含34個MeC3H，28個AtC3H；Ⅱ組包含12個MeC3H，12個AtC3H；Ⅲ組包含17 個MeC3H，12個AtC3H；Ⅳ組包含26個MeC3H，16個AtC3H；其中Ⅰ組還可劃分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc 3個亞類，分別包含16、16、2個MeC3H家族成員。大多數(shù)MeC3H分布在Ⅰ組和Ⅳ組。

2.4" MeC3H基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

為進一步預測MeC3H蛋白的功能，運用MEME軟件進行保守基序預測。結(jié)果顯示，15個保守基序的長度范圍為15（第9個基序）～50個（第1、4、7、8、13、15個基序）氨基酸（圖3）。木薯MeC3H基因的內(nèi)含子數(shù)為0～27，其中有12個基因（MeC3H35、MeC3H52、MeC3H40、MeC3H44、MeC3H68、MeC3H04、MeC3H13、MeC3H36、MeC3H48、MeC3H28、MeC3H02、MeC3H09）含有1個內(nèi)含子，7個基因不含內(nèi)含子（MeC3H63、MeC3H30、MeC3H17、MeC3H81、MeC3H19、MeC3H80、MeC3H43）。

2.5" MeC3H基因共線性分析

39對MeC3H基因具有共線性關(guān)系，如MeC-3-H02與MeC3H09、MeC3H03與MeC3H10、Me-C---3H04與MeC3H13、MeC3H05與MeC3H15、MeC-3H07與MeC3H22，其余成員間不存在共線性關(guān)系（圖4）。因此，MeC3H基因家族存在基因復制的現(xiàn)象，在進化過程中可能復制擴增C3H家族成員。

為進一步探索MeC3H基因家族成員之間的進化關(guān)系，研究木薯與擬南芥、水稻的C3H家族之間的共線性，構(gòu)建了兩兩物種之間的關(guān)系圖（圖5）。木薯與擬南芥、水稻中存在同源基因?qū)?，其中木薯與擬南芥之間的同源基因?qū)?shù)量遠多于木薯與水稻之間的同源基因?qū)ΑＲ虼?，相較于木薯與水稻，木薯與擬南芥的C3H基因家族具有更相近的同源進化關(guān)系。

2.6" MeC3H基因啟動子順式作用元件預測

通過對木薯C3H家族成員轉(zhuǎn)錄起始位點上游對2000 bp左右啟動子區(qū)域的分析發(fā)現(xiàn)，其啟動子區(qū)域包含多種類型的順式作用元件，除常見的TATA-box、CAAT等主要的順式作用元件外，還包含了具有響應功能的順式作用元件。按照功能分為光響應元件（G-Box、Box 4、GT1-motif、TCT-motif、GATA-motif）、逆境響應元件（ABRE、ARE、MBS、LTR、CGTCA-motif、TCA-element、TGACG-motif）和生長發(fā)育元件（CAT-box、TGA-element）（圖6）。絕大多數(shù)MeC3H基因的啟動子含有與光響應相關(guān)的順式作用元件，光響應元件在全部89個MeC3H基因中存在數(shù)量最多，有1052個；其次是非生物脅迫響應元件有784個，其中脫落酸響應元件269個，占非生物脅迫響應元件的34%，抗氧化反應元件有259個，占非生物脅迫響應元件的33%；數(shù)量最少的順式作用元件是植物生長發(fā)育響應元件（157個）。這表明MeC3H可能與光響應有關(guān)，同時在植物生長發(fā)育、生物脅迫以及非生物脅迫中也發(fā)揮重要作用。

2.7" MeC3H基因響應Xpm的表達模式分析

為了解MeC3H基因受Xpm侵染后的表達模式，將生長30"d左右的SC8木薯苗接種Xpm CHN11菌株。本研究根據(jù)本實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果（圖7），挑選16個表達趨勢顯著的基因（MeC3H01、MeC3H03、MeC3H06、MeC3H07、MeC3H31、MeC3H36、MeC3H39、MeC3H42、MeC3H46、MeC3H49、MeC3H58、MeC3H68、MeC3H71、MeC3H77、MeC3H86）作為檢測對象，進一步利用qPCR技術(shù)分析MeC3Hs基因的表達模式。結(jié)果表明，MeC3H49、MeC3H03、MeC3H42、MeC3H68、MeC3H01、MeC3H35、MeC3H36、MeC3H71、MeC3H31、MeC3H86基因的表達量均與RNA-seq結(jié)果一致，MeC3H58、MeC3H39、MeC3H77、MeC3H07、MeC3H06、MeC3H46這6個基因的qPCR與RNA-seq表達模式不一致?？赡苁?種技術(shù)檢測范圍和靈敏度不一致造成的。MeC3H49、MeC3H42、MeC3H68的表達量顯著上調(diào)，MeC3H35、MeC3H77、MeC3H36、MeC3H31、MeC3H86的表達量顯著下調(diào)（圖8）。以上結(jié)果表明部分MeC3H基因可能在木薯抗病響應中有比較重要的作用。

3" 討論

C3H基因廣泛存在于多種真核生物中，如酵母、植物和哺乳動物等^[20]，在植物的生長發(fā)育、生物脅迫以及非生物脅迫等方面具有重要的調(diào)控作用。盡管C3H基因家族在擬南芥、水稻、楊樹、番茄等植物中已有較深入的研究，但關(guān)于木薯C3H基因家族的研究還鮮有報道。

本研究從木薯基因組中成功鑒定到89個MeC3H基因家族成員，它們定位在18條染色體上和1條Scaffold上。除Chr1、Chr2、Chr6、Chr8、Chr14染色體上的C3H基因分布比較集中外，其余染色體上C3H基因分布比較分散。基于89個木薯C3H蛋白和68個擬南芥C3H蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)果，可將C3H蛋白劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個亞族，同一個亞族內(nèi)MeC3H基因家族成員關(guān)系較近，有較高的同源性，同源基因發(fā)生復制時可能來自同一個祖先，推測其具有相似的功能。

基因啟動子區(qū)域的順式作用元件可以為后續(xù)該基因功能研究提供重要的方向指引。本研究鑒定到MeC3H基因啟動子區(qū)域有大量光響應元件、逆境響應元件、激素響應元件，推測其成員廣泛參與木薯抗逆和生長發(fā)育等重要途徑^[21]。內(nèi)含子是高等生物基因組成的重要特征，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、表達和可變剪接等方面有重要作用。如在擬南芥部分SAPs基因中內(nèi)含子缺失可增強轉(zhuǎn)錄效率^[22]?；蛟谶M化過程中會出現(xiàn)內(nèi)含子增加或缺失的現(xiàn)象^[23]。在MeC3H基因家族有7個成員不含內(nèi)含子，可能與更快合成應激相關(guān)蛋白，調(diào)控應激響應有關(guān)。通過對MeC3H家族成員的基因結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，同一亞家族成員的外顯子-內(nèi)含子數(shù)量、保守基序特征相似，可能與同一亞族成員的生物學功能相似有關(guān)。木薯共有39對MeC3H同源基因之間存在共線性關(guān)系，表明在進化過程中基因可能通過復制方式擴增C3H家族成員。

通過SC8木薯在病原菌Xpm侵染下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及實時熒光定量qPCR分析表明，部分MeC3H基因如MeC3H07、MeC3H68、MeC3H77等在Xpm侵染后快速表達，而MeC3H06、MeC3H31、MeC3H36、MeC3H71、MeC3H86等的表達則被Xpm抑制。說明這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可能在木薯抵御細菌性枯萎病菌侵染中發(fā)揮重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)C3H基因參與調(diào)控植物的抗病響應，如OsBIRF、OsLOL2、OsDOS等調(diào)控水稻的抗病力，AtC3H18調(diào)控擬南芥抗細菌病害的能力以及Sc-zf調(diào)控甘蔗抗病力等^[8-11]。綜上推測，C3H基因可能參廣泛參與木薯的抗病響應，調(diào)控木薯與病原菌的互作。

本研究通過對MeC3H基因家族進行生物信息學分析和對部分MeC3H基因在病原菌侵染下的調(diào)控機制分析，為進一步研究C3H基因在木薯抗細菌性枯萎病方面的功能奠定基礎(chǔ)。

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