棘椒不同果色突變材料中 β -胡蘿卜素羥化酶基因克隆及表達(dá)分析

中圖分類號：S641.301;S641.303.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）10-0042-10

面積逐年擴(kuò)大，也越來越受到育種家的關(guān)注和喜愛[1]。辣椒果實(shí)顏色作為直觀和重要的商品性狀之一，目前已選育出綠色、棕色、乳白色、紫色、黃色、紅色等不同顏色的新品種[2-3]。有大量的研究表明，辣椒果實(shí)顏色的形成與色素類物質(zhì)的生物合成和代謝密切相關(guān)[4-5]，在辣椒綠熟期，決定果實(shí)顏色的主要色素有花青素和葉綠素等[6。隨著果實(shí)的發(fā)育，類胡蘿卜素各組分和含量逐漸提高，成熟時(shí)果實(shí)顏色的形成主要由類胡蘿卜素起主導(dǎo)作用[]。類胡蘿卜素在自然界存在較廣泛的色素群體之一，它顏色范圍較廣，是辣椒呈現(xiàn)不同顏色的主要色素物質(zhì)。類胡蘿卜素廣泛存在于植物、藻類以及各種細(xì)菌和真菌當(dāng)中，其功能主要包括光收集、防止氧化損傷以及作為動(dòng)物和昆蟲的引誘劑[8]。植物類胡蘿卜素是一種脂溶性色素，在光合組織的葉綠體和一些物種的果實(shí)、花、根和塊莖的著色體中合成[9]

β- 胡蘿卜素羥化酶（ β - carotene hydroxylase，CRTZ）是植物中類胡蘿卜素合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它在植物中催化了β-胡蘿卜素經(jīng)中間產(chǎn)物β- 隱黃素合成玉米黃素。玉米黃素是 β- 胡蘿卜素的一種直接生化衍生物。CRTZ基因通過在β- 胡蘿卜素的每個(gè)環(huán)上添加1個(gè)羥基形成玉米黃素。隨著研究的深人，目前已經(jīng)明確CRTZ是負(fù)責(zé)將 β- 胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為玉米黃素的唯一酶，CRTZ基因已經(jīng)從南豐蜜橘、雨生紅球藻、擬南芥、甜椒、龍膽草等植物中分離得到[10-15]。有研究發(fā)現(xiàn)β－隱黃素和玉米黃素是果實(shí)呈色的主要來源，在甜橙中將CRTZ基因進(jìn)行沉默，會(huì)導(dǎo)致其果實(shí)顏色為深黃色，并且果汁中的 β -胡蘿卜素含量顯著增加。CRTZ基因過量表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致玉米黃素的增加，進(jìn)一步提高類胡蘿卜素的含量[16-19]。擬南芥中，Johson等將CRTZ基因過量表達(dá)，導(dǎo)致玉米黃素含量升高了2倍[20]。CRTZ 基因過表達(dá)的擬南芥植物表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受強(qiáng)烈光脅迫的能力[21-22]

本研究通過對辣椒不同果色材料中CRTZ基因的克隆，以及對其生物信息學(xué)和不同時(shí)期、不同部位表達(dá)量的分析，為更好地了解該基因在辣椒果實(shí)類胡蘿卜素合成過程中的作用提供理論依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步深人解析辣椒果色形成機(jī)制及辣椒不同果色新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為紅色野生型辣椒品系PC01、SP01及其橙色和黃色突變體PC02、SP02以及觀賞椒Z1，供試材料由青海省農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所和西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜生物技術(shù)與種質(zhì)資源創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供。2023年3月初將供試種播種在青海大學(xué)園藝創(chuàng)新基地，2023年4—5月將辣椒幼苗移栽入基地溫室大棚內(nèi)。根據(jù)花后不同時(shí)間（daysafterflowering，DAF）將果實(shí)發(fā)育分為5個(gè)時(shí)期：I期（15DAF）、Ⅱ期（25DAF）、Ⅲ期（35DAF）、V期（45DAF）、V期（55DAF（圖1）。試驗(yàn)時(shí)間為2023年7一12月，試驗(yàn)地點(diǎn)為青海大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，采集不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)及成熟期（55DAF）根、莖、葉、花等不同組織的樣品，及時(shí)液氮速凍后-80°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1辣椒CRTZ全長基因克隆采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取5個(gè)辣椒品種嫩葉組織基因組DNA，利用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物，基因克隆和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）引物見表1。PCR反應(yīng)體系總體積為 50μL ，反應(yīng)程序?yàn)椋?8^9C 變性 10s，55°C 退火 15s，72‰ 延伸 2min ，共

35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后 保溫。用天根生化科技（北京）有限公司的DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收，對回收的PCR產(chǎn)物加入聚腺苷酸聚合酶（polA），將自的片段與測序載體相連，然后轉(zhuǎn)入 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過PCR驗(yàn)證后，送至北京華大怡和生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2生物信息學(xué)分析在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得其他植物的CRTZ基因序列，采用ExPASy軟件對氨基酸基本成分、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)、進(jìn)行生物學(xué)信息分析，亞細(xì)胞的定位預(yù)測以及跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測分別在Softberry和TMHMM在線軟件進(jìn)行分析，蛋白的二級以及三級結(jié)構(gòu)分別在Swiss-Model軟件中進(jìn)行分析，利用NCBIBLAST中在線比對，在蛋白質(zhì)保守區(qū)數(shù)據(jù)庫中其進(jìn)行預(yù)測蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。使用MEGA對系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行測試和編輯。

1.2.3CRTZ基因表達(dá)分析采用天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒（TiangenRNAprepPurePlantKit）提取各組織RNA，采用FastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒[KR106，天根生化科技（北京）有限公司]完成cDNA的制備，實(shí)時(shí)熒光定量引物及內(nèi)參基因引物見表1。擴(kuò)增體系共20μL ，上下游引物各 0.8μL ，cDNA 模板 1μL （ 100ng/μL ），Unique AptamerTM qPCR SYBR GreenMasterMix 10μL，ddH₂O7.4μL_o 反應(yīng)程序： 95^°C 3 min;95 ℃ 30 s ， 5 8 ～ ，循環(huán)45次；72°C2min 。對基因進(jìn)行熒光定量分析，重復(fù)3次，得出相應(yīng)數(shù)據(jù)后，采用 方法處理。

1.2.4總類胡蘿卜素提取采用 95% 乙醇提取法，對PC01、PC02、SP01、SP02和Z1品種測定類胡蘿卜素含量，試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[23]，重復(fù)3次。并將所得數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與計(jì)算。

2結(jié)果分析

2.1辣椒CRTZ 基因的克隆

采用同源克隆策略，辣椒CM334為參考基因，以辣椒PCO1、PC02、SP01、SP02和Z1葉片DNA為模板，擴(kuò)增CRTZ基因全長。電泳結(jié)果（圖2-A）表明，在5個(gè)品種的材料中均能擴(kuò)增到 2 025bp 左右基因片段，與預(yù)期大小相符（圖2-B），將目的基因純化、克隆測序后進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示CRTZ基因在PC01、PC02、SP01、SP02和Z1及參考基因組CM334中的序列均高度一致?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖3）表明，CRTZ基因含有6個(gè)內(nèi)含子、7個(gè)外顯子，編碼315個(gè)氨基酸。

2.2辣椒CRTZ蛋白的理化性質(zhì)分析

ExPASy-ProtParam預(yù)測結(jié)果表明CRTZ蛋白分

子式為 C₁₆₁₂H₂₄₇₅N₄₃₁O₄₃₄S₁₅ ，分子量為 35317.91u ，理論等電點(diǎn)為5.45，編碼315個(gè)氨基酸，其中帶負(fù)電荷氨基酸的殘基數(shù)為32個(gè)，帶正電荷氨基酸的殘基數(shù)則為35個(gè)，親水性平均系數(shù)為0.012，不穩(wěn)定性系數(shù)為54.43，CRTZ為疏水蛋白，是一種不穩(wěn)定蛋白。SignaIP4.1和TMHMM分析結(jié)果則表明，該蛋白無信號肽（圖4）。CRTZ蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜中、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體上的 K 值依次為9、2和1，因此細(xì)胞質(zhì)膜上的可能性更大。

2.3辣椒CRTZ氨基酸疏水性親水性預(yù)測

利用DNAMAN8.O，對辣椒CRTZ蛋白氨基酸順序進(jìn)行了親水性/疏水性分析，結(jié)果（圖5）顯示，第115位的纈氨酸（Val）是CRTZ蛋白疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)，親水性最強(qiáng)位點(diǎn)為第106位的賴氨酸（Lys）。

2.4辣椒CRTZ的蛋白結(jié)構(gòu)分析

采用SOPMA對CRTZ蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果（圖6）顯示，CRTZ的二級結(jié)構(gòu)主要由∝- 螺旋 （45.08% ）、β-折疊（ （15.24% ）β-轉(zhuǎn)角L （5.4% ）和無規(guī)卷曲（ 34.28% ）組成；并使用Swiss-Model軟件分析蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖6。

2.5辣椒CRTZ的保守域分析與同源性序列比對

在NCBI保守域數(shù)據(jù)庫中將辣椒CRTZ的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對，表明CRTZ屬于FA羥化酶超家族（圖7）。

將辣椒CRTZ氨基酸序列分別同番茄（Solanumlyoopersicum，NP_001265981.1）、枸杞（Lyciumchinense，AHE41418．1）、黑果枸杞（Lyciumruthenicum，AIX87523.1）、胡蘿卜（Daucuscarotasubsp.sativus，NP_001316105.1）馬鈴薯（Solanumtuberosum，ADF28628.1）、釀酒葡萄（Vitisvinifera，RVW41947．1）、寧夏枸杞（Lycium barbarum，AIX87499.1）、彭氏番茄（Solanumpennellii，XP_56. 04% 、55. 62% 、36.09. % 、53. 01% 、 55.65% 、51. 92% ;共同一致性達(dá)到 64.81% ，表明辣椒CRTZ氨基酸序列與這13中物種具有較高的同源性。

2.6 進(jìn)化樹分析

利用MEGA軟件，將辣椒與其他12種植物的相關(guān)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖9），辣椒與同屬茄科的番茄（Solanumlycopersicum）、彭氏茄（Solanumpennelfi）、馬鈴薯（Solanumtuberosum）、寧夏枸杞（Solanumbarbarum）屬于同一分支，其中與茄科茄屬的番茄、彭氏茄在進(jìn)化關(guān)系上最為接近。

99 彭氏番茄Solanumpennelli 100 番茄 Solanum lyoopersicum 48 92 馬鈴薯Solanum tuberosum 99 寧夏枸杞Lyciumbarbarum 辣椒Capsicum annuum 65 擬茸毛煙草Nicotiana tomentosiformi 枸杞Lyciumchinense 93 三裂葉牽牛Ipomoeatriloba 木樨欖Olea europeea 100 河岸葡萄Vitisriparia 釀酒葡萄Vitisvinifera 51 胡蘿卜Daucus carota subsp.sativus 68 蕓臺Brassica campestris

2.7 CRTZ基因在不同組織的表達(dá)分析

對PC01、PC02、SP01、SP02、Z15個(gè)品種辣椒不同組織部位進(jìn)行CRTZ基因相對表達(dá)量研究。結(jié)果（圖10）表明，CRTZ基因在5個(gè)品種辣椒的根、莖、葉、花組織中都有表達(dá)，在根組織中表達(dá)最低，在葉中表達(dá)量最高，最高表達(dá)量在PC01品種中，最低表達(dá)量在SPO1中，就不同材料而言，CRTZ基因在橙色突變體PC02的莖和花中表達(dá)量高于野生型PC01，然而在黃色突變體SP02中，其表達(dá)量低于野生型SP01，Z1材料中CRTZ基因在各個(gè)組織中的表達(dá)模式較為平穩(wěn)，同樣最高值出現(xiàn)在葉片組織中。

2.8 CRTZ基因在辣椒果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

對CRTZ基因在PC01 ?PC02 SP01、SP02、Z1果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)量進(jìn)行分析。PC01、PC02、SP01、Z1中CRTZ基因的表達(dá)量均在成熟后期（果V期）達(dá)到最大值。就不同材料而言，在果實(shí)發(fā)育不同階段，CRTZ基因在橙色突變體PC02中的總表達(dá)量要高于野生型PC01，黃色突變體SP02表達(dá)量除果實(shí)發(fā)育V期外，其他時(shí)期的表達(dá)量均高于野生型SP01品種的表達(dá)量。在Z1中，CRTZ基因的表達(dá)隨果色發(fā)育，呈現(xiàn)上升趨勢，并在果實(shí)發(fā)育第V期達(dá)到最大值。總之，CRTZ基因在果實(shí)中的表達(dá)量為黃色突變體SP02表達(dá)總量高于SP01，橙色突變體PC02表達(dá)總量高于野生型PC01（圖11）。

2.9總類胡蘿卜素含量分析

對PC01、PC02、SP01、SP02、Z1這5個(gè)品種辣椒成熟后期果實(shí)，進(jìn)行總類胡蘿卜素測定，結(jié)果（圖12）表明，PC01、PC02、SP01、SP02和Z1中，類胡蘿卜素含量分別為0.026、0.078、0.017、0.045、0.005mg/g ，PCO2總類胡蘿卜素含量最高，高于野生型PC01和其他幾個(gè)材料。黃色突變體SP02的類胡蘿卜素含量也高于野生型SP01，Z1總類胡蘿卜素最低。這和辣椒成熟期CRTZ基因在辣椒品種的表達(dá)趨勢基本一致，推測CRTZ基因的表達(dá)和果實(shí)中總類胡蘿卜素的含量具有一定的相關(guān)性。

3討論和結(jié)論

類胡蘿下素是植物所必需的次生代謝產(chǎn)物，對植物不同顏色有著重要影響。截至目前，已鑒定并了解其結(jié)構(gòu)的天然類胡蘿卜素共計(jì)750多種，比如β- 胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃素、番茄紅素、紫黃質(zhì)[24-26]。高等植物的果實(shí)和花的著色與其類胡蘿卜素的含量高低密切相關(guān)[27]。例如紅色辣椒果實(shí)成熟時(shí)，主要影響顏色的類胡蘿卜素是辣椒玉紅素和辣椒紅素[28-29]，橙色果實(shí)中類胡蘿卜素的含量與玉米黃素和紫黃素有密切關(guān)系，而在黃色果實(shí)中，類胡蘿卜素與紫黃素、葉黃質(zhì)以及玉米黃素等有著重要聯(lián)系[30-32] 。

CRTZ是類胡蘿卜素合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶，可以將合成代謝途徑中產(chǎn)生的含 β -環(huán)的類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成 β- 隱黃素和玉米黃素，β-隱黃素和玉米黃素都屬于類胡蘿卜素中的葉黃素[3]。葉黃素與玉米黃素共同存在，是構(gòu)成蔬菜、水果、花卉等植物的主要顯色組成成分，葉黃素在很多領(lǐng)域方面都有著重要作用，在食品中加入一定量葉黃素，可以防治器官衰老，在醫(yī)療上已經(jīng)被應(yīng)用于癌癥預(yù)防、心臟病發(fā)作的抑制劑，同時(shí)葉黃素可以作為飼料添加劑，應(yīng)用于家禽肉蛋的著色等[34]。萬壽菊顏色多樣，有亮黃色、橙黃色、橘黃色、橘紅色，顏色不一，導(dǎo)致這種差異主要取決于葉黃素在植物中含量的高低[35]。Galpaz等研究發(fā)現(xiàn)，番茄白色花朵的形成，是由于CRTZ基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致葉黃素?zé)o法積累[36]。Romer等利用含有編碼玉米黃素環(huán)氧化酶的cDNA片段的sense（編碼蛋白）和antiseuse（阻斷表達(dá)）結(jié)構(gòu)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，其中的2個(gè)馬鈴薯品系積累了大量的玉米黃素，由于玉米黃素的積累，該位點(diǎn)的等位基因?qū)е铝顺壬螯S色塊莖的形成，而第3個(gè)品系不含玉米黃素，表現(xiàn)出典型的淡黃色果實(shí)[37-41]。在辣椒中，CRTZ 基因突變導(dǎo)致 β- 胡蘿卜素在辣椒果實(shí)中積累，使辣椒果實(shí)顏色從紅色變?yōu)槌壬玔42]。本研究在辣椒葉片中都克隆到CRTZ基因全長，且序列無差異，推測不同果實(shí)顏色的形成，不是由于CRTZ基因結(jié)構(gòu)變異所致。

CRTZ基因的不同表達(dá)模式是造成不同果色形成的重要因素之一。在胡夢卜中的研究表明，將CRTZ基因過表達(dá)使胡蘿卜主根的顏色從橙色變?yōu)辄S色[43]。在柑橘的愈傷組織中CRTZ基因超表達(dá)，與空載體愈傷組織相比（白色），CRTZ基因過表達(dá)株系全部變成淺黃色，類胡蘿下素組成和含量測定結(jié)果表明，過表達(dá)株系中類胡蘿卜素含量增加，葉黃素含量也有一定程度的提高，說明株系顏色的變化可能與基因的過表達(dá)有關(guān)[44]。在藏紅花中的研究結(jié)果也表明，CRTZ基因的過表達(dá)有助于細(xì)胞中玉米黃素的積累，在成熟過程中CRTZ基因的表達(dá)升高，細(xì)胞內(nèi)也逐漸開始積累了大量玉米黃素，玉米黃素含量與CRTZ基因表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系[45-46]，本研究在辣椒果實(shí)成熟期 PC02 與野生型PC01中CRTZ基因表達(dá)量高，類胡蘿卜素含量也隨之升高的研究結(jié)果與之基本一致。本試驗(yàn)中CRTZ基因在辣椒葉、花、果實(shí)中均有表達(dá)，但在葉組織中的表達(dá)量最高，這與CRTZ基因在弼猴桃、馬鈴薯、番茄和甘藍(lán)中葉的表達(dá)量都相對較高的研究結(jié)果[47-50]相似。

本研究選用的5個(gè)品種不同組織中CRTZ基因均有表達(dá)，其中在成熟果實(shí)中的表達(dá)量最高，葉組織次之，根組織中表達(dá)量最低；在辣椒果實(shí)不同發(fā)育階段，CRTZ基因隨著果實(shí)成熟，其表達(dá)量整體呈現(xiàn)上升趨勢，在果實(shí)成熟后期（ N～V 期）表達(dá)量趨向于平穩(wěn)。5個(gè)品種中均能克隆到完整的CRTZ基因且基因序列無差異，但在不同品種、不同組織以及果實(shí)不同發(fā)育階段，其表達(dá)量存在顯著差異，說明CRTZ基因不同的表達(dá)模式，可能與果色密切相關(guān)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果為進(jìn)一步解析CRTZ基因參與辣椒果色的形成，提供了試驗(yàn)依據(jù)和理論支撐，對辣椒分子輔助育種工作以及篩選高類胡蘿卜素辣椒品種具有重要意義。

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