海南萬(wàn)寧咖啡炭疽病菌Colletotrichum siamense的分離鑒定及LAMP快速檢測(cè)體系的建立

摘" 要：作為海南省萬(wàn)寧市特色農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)，興隆咖啡產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展正面臨炭疽病侵害的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。咖啡炭疽病可導(dǎo)致咖啡葉片焦枯、枝條潰瘍及漿果褐腐，是咖啡的主要病害之一。本研究在萬(wàn)寧咖啡主產(chǎn)區(qū)采集咖啡炭疽病樣品并分離病原菌，通過(guò)ITS、TUB2、CHS-1、ACT、GAPDH多基因聯(lián)合分析鑒定病原菌，并基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）建立快速檢測(cè)體系。結(jié)果表明：（1）采集典型病樣50份，經(jīng)組織分離純化獲得炭疽菌株24株；（2）明確萬(wàn)寧5個(gè)種植區(qū)的病原種群結(jié)構(gòu)包含4個(gè)炭疽菌種，即Colletotrichum tropicale、C. karstii、C. fructicola及優(yōu)勢(shì)種暹羅炭疽菌（C. siamense， 45.8%）。（3）基于TUB2基因特異區(qū)域，設(shè)計(jì)篩選得到特異性LAMP引物組Tub-L1，優(yōu)化反應(yīng)體系參數(shù)為63"℃恒溫?cái)U(kuò)增50 min，內(nèi)外引物濃度比為8∶1，Mg²⁺ 8 mmol/L，dNTPs 0.8 mmol/L，無(wú)需甜菜堿。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，該體系檢測(cè)靈敏度達(dá)100 pg/μL（為常規(guī)PCR的10倍）；對(duì)炭疽菌屬的7個(gè)近緣種（C. tropicale、C. fructicola、C. karstii等）及7種非靶標(biāo)植物病原菌[含咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）、菜豆間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）等]均無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)。采用優(yōu)化后的LAMP檢測(cè)體系對(duì)田間采集的病害葉片樣本進(jìn)行分析，所有樣品均成功檢測(cè)出暹羅炭疽菌，其結(jié)果與常規(guī)PCR檢測(cè)方法一致。綜上所述，本研究建立并優(yōu)化的咖啡炭疽病菌LAMP快速檢測(cè)體系具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高以及結(jié)果可視化等優(yōu)勢(shì)，適用于暹羅炭疽菌（C. siamense）的田間快速檢測(cè)。該體系為咖啡炭疽菌的精準(zhǔn)鑒定及高效檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)支撐，對(duì)咖啡炭疽病的早期預(yù)警、病害監(jiān)測(cè)及綜合防控具有重要的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：咖啡炭疽??；病原鑒定；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S435.712 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Isolation， Identification of Colletotrichum siamense Causing Coffee Anthracnose in Wanning， Hainan， and Development of a Rapid LAMP Detection System

WEN Siwei， GAO Shengfeng， TIAN Tian， LIU Shichao， GOU Yafeng， ZHANG Ruonan， XUE Chao^*，

SUN Shiwei^*

Institute of Spice and Beverage Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops / Key Laboratory of Genetic Resource Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract： Xinglong coffee， a pillar of the local characteristic agriculture in Wanning， faces severe threats to its sustainable production from anthracnose. This disease can cause leaf scorching， branch ulcers， and berry brown rot， making it one of the major diseases in the industry. In this study， samples of coffee anthracnose were collected from the main coffee-growing areas in Wanning and the pathogenic fungi were isolated. The pathogenic fungi were identified through the combined analysis of multiple genes， including ITS， TUB2， CHS-1， ACT and GAPDH. Furthermore， a rapid detection system based on the loop-mediated isothermal amplification （LAMP） technique was established. 50 typical disease samples were collected， and through tissue separation and purification， a total of 24 Colletotrichum isolates were obtained. The pathogen population structure in the five planting areas of Wanning was clarified to comprise four species of Colletotrichum spp.： C. tropicale， C. karstii， C. fructicola， and the dominant species was C. siamense （accounting for 45.8%）. Based on the specific region of TUB2 ， a specific LAMP primer set （Tub-L1） was designed and screened. The

optimized reaction parameters were established as follows： isothermal amplification at 63"℃ for 50 minutes，

outer-inner primer concentration ratio of 8∶1， Mg²⁺ 8 mmol/L， dNTPs 0.8 mmol/L， and without the need for betaine.

Validation experiments demonstrated that the detection sensitivity of this system reached 100 pg/μL （10 times higher

than conventional PCR）. Furthermore， the system showed no positive reactions to seven closely related species within Colletotrichum spp. （including C. tropicale， C. fructicola， C. karstii） or seven non-target plant pathogens [including Hemileia vastatrix （coffee leaf rust）， Diaporthe phaseolorum， and others]. Using the optimized LAMP detection system， the diseased leaf samples collected from the field were analyzed. C. siamense was successfully detected in all samples， and the results were completely consistent with those obtained by conventional PCR methods. In summary， the LAMP-based rapid detection system for Colletotrichum sp. established and optimized in this study demonstrates significant advantages， including simplified operation， high reaction efficiency， strong specificity， enhanced sensitivity， and visualizable results， making it highly suitable for field-based rapid detection of C. siamense. This system would provide reliable technical support for the precise identification and efficient detection of coffee anthracnose fungus， and have important practical significance and application value for the early warning， disease monitoring， and integrated control of coffee anthracnose.

Keywords： coffee anthracnose; pathogen identification; loop-mediated isothermal amplification （LAMP）; detection

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.020

咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）的多年生常綠木本植物，作為熱帶與亞熱帶地區(qū)的關(guān)鍵經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)全球熱帶農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)具有重要戰(zhàn)略意義。海南地處熱帶作物優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，經(jīng)過(guò)百余年的栽培體系演化，現(xiàn)成為我國(guó)中粒種咖啡（Coffea canephora var. robusta）的核心生產(chǎn)區(qū)域。萬(wàn)寧市在海南咖啡產(chǎn)業(yè)布局中占核心地位，是當(dāng)前海南省咖啡種植和收獲面積最大的產(chǎn)區(qū)，其“興隆咖啡”憑借獨(dú)特的風(fēng)味特征和卓越的品質(zhì)表現(xiàn)，在國(guó)內(nèi)外咖啡市場(chǎng)中享有較高知名度，成功塑造了海南咖啡的地域品牌形象^[1-2]。

咖啡的生長(zhǎng)種植過(guò)程中易受到多種病原物的侵染，由炭疽菌屬（Colletotrichum spp.）引起的咖啡炭疽病是許多咖啡種植國(guó)咖啡高質(zhì)量生產(chǎn)的主要限制因素，我國(guó)云南、海南等咖啡種植區(qū)均有發(fā)現(xiàn)該病為害，且為害程度不斷加重^[3]?？Х忍烤也≈苣臧l(fā)生，病原菌能夠侵染咖啡植株的多個(gè)部位，包括嫩葉、枝條以及果實(shí)等，引發(fā)葉片脫落、枝條枯死、果實(shí)腐爛，嚴(yán)重時(shí)甚至整株死亡^[4]。例如漿果炭疽菌（Colletotrichum kahawae）對(duì)高海拔地區(qū)種植的小粒種咖啡（Coffea arabica）造成嚴(yán)重威脅，該病原菌已列入我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名單，該病原菌引起的咖啡漿果病致使非洲地區(qū)咖啡漿果產(chǎn)量損失高達(dá)80%^[5-7]?？Х忍烤也〉陌l(fā)病率與當(dāng)?shù)貧夂驐l件密切相關(guān)。研究表明，氣溫20"℃左右、相對(duì)濕度90%以上（持續(xù)7 h以上）的冷涼高濕環(huán)境為該病原菌侵染的最適條件，特別是長(zhǎng)期干旱后的連續(xù)降雨期間，咖啡炭疽病的發(fā)病率與病情指數(shù)往往達(dá)到最大值，常在9—11月達(dá)到峰值^[8-9]。

炭疽菌屬真菌廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。由于其寄主廣泛，侵染咖啡的炭疽菌種類呈高度多樣性，且優(yōu)勢(shì)病原種群分布與地理環(huán)境、寄主品種顯著相關(guān)^[3]。CRISTóBAL-MARTíNEZ等^[10]通過(guò)多基因系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)墨西哥小粒種咖啡的炭疽病菌進(jìn)行研究，鑒定出C. gigasporum、C. siamense、C. karstii、C. gloeosporioides和C. theobromicola五個(gè)種。CAO等^[3]在海南5個(gè)咖啡種植區(qū)（涵蓋小粒種與中粒種），共鑒定出8個(gè)炭疽菌種，包括C. fructicola、C. siamense、C. tropicale等。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于咖啡炭疽菌的病原鑒定與檢測(cè)研究中主要依賴于常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）、巢式PCR等方法。然而，這些技術(shù)存在操作流程復(fù)雜、設(shè)備要求高等局限性，難以滿足田間快速診斷病原的需求。因此，開(kāi)發(fā)一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）的高靈敏度、高特異性的快速檢測(cè)方法，對(duì)于實(shí)現(xiàn)咖啡炭疽病的早期預(yù)警和精準(zhǔn)防控具有重要的實(shí)踐意義。

LAMP是由NOTOMI等^[11]于2000年研發(fā)的新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便（無(wú)需熱循環(huán)儀器）、特異性強(qiáng)、靈敏度高等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在植物真菌、細(xì)菌、病毒的檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，顯著提升了田間病原物的診斷效率^[12]。馬駿^[13]基于比較基因組學(xué)篩選出果生炭疽菌（C. fructicola）的特異性分子標(biāo)記，成功建立了針對(duì)山核桃（Carya cathayensis）葉部病原真菌的LAMP快速檢測(cè)體系，該體系可在接種病原菌72"h后準(zhǔn)確檢測(cè)出山核桃葉片病斑中的病原菌。汪涵^[14]針對(duì)甘蔗褐銹病菌（Puccinia melanocephal）和咖啡葉銹病菌（Hemileia vastatrix）ITS基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物構(gòu)建LAMP體系，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，該體系對(duì)2種病原物的檢測(cè)效率均高于普通PCR。秦艷紅等^[15]以SYBR Green Ⅰ為熒光指示劑，建立了針對(duì)地黃花葉病毒（ReMV）的逆轉(zhuǎn)錄LAMP（RT-LAMP）體系，陽(yáng)性檢出率達(dá)98.3%，遠(yuǎn)高于常規(guī)RT-PCR（75.0%）。

炭疽菌屬因種內(nèi)遺傳多樣性豐富，受到環(huán)境因子、寄主差異等因素的影響，基于表型特征（菌落形態(tài)、培養(yǎng)性狀及致病性等）的傳統(tǒng)分類體系存在穩(wěn)定性缺陷。本研究以咖啡炭疽病樣品為研究對(duì)象，開(kāi)展多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析，明確了暹羅炭疽菌（C. siamense）為咖啡炭疽病的優(yōu)勢(shì)致病種，進(jìn)而針對(duì)其β-tubulin（TUB2）基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化、特異性驗(yàn)證及靈敏度檢測(cè)，系統(tǒng)構(gòu)建LAMP快速檢測(cè)體系，以期為咖啡炭疽病的早期診斷與田間預(yù)警提供高效檢測(cè)技術(shù)。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1 "供試材料" 于2022年對(duì)海南省萬(wàn)寧市的3個(gè)咖啡種植園與中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所的2個(gè)試驗(yàn)基地（分別為興隆熱帶植物園與大路試驗(yàn)示范基地）開(kāi)展咖啡病害發(fā)生情況的實(shí)地調(diào)查。在調(diào)查過(guò)程中，采用隨機(jī)法、五點(diǎn)取樣法，采集具有咖啡炭疽病典型癥狀（如出現(xiàn)黑點(diǎn)、萎縮病變等）的枝條樣本，將其裝入樣本袋后帶回實(shí)驗(yàn)室，在4"℃條件下保存。共采集50份樣本進(jìn)行菌株的分離、純化。所有分離獲得的菌株均保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所。

1.1.2" 主要試劑 "Taq酶、Bst DNA酶以及配套的Buffer、MgSO₄、dNTPs購(gòu)自南京諾維贊生物科技股份有限公司；甜菜堿（betaine）與熒光指示劑SYBR Green Ⅰ（10 000×）購(gòu)自索萊寶科技有限公司（北京）；DL2000 DNA marker與DL2000 plus marker購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.2" 方法

1.2.1 "多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育鑒定 "選取ITS、TUB2、GAPDH、CHS-1、ACT^[16-19]5個(gè)保守序列基因位點(diǎn)的通用引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，包括DNA模板2"μL，2×Taq Master Mix 25 μL，10 μmol/L正反向引物各2 μL，ddH₂O 19 μL。PCR反應(yīng)程序：95"℃預(yù)變性 3 min；95"℃變性15 s，55"℃退火15 s，72"℃延伸1 min，循環(huán)30次；72"℃終延伸5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將獲得的測(cè)序結(jié)果提交至NCBI GenBank進(jìn)行BLASTn同源性比對(duì)，篩選同源性gt;98%的參考菌株序列。所有供試菌株及參考菌株序列均通過(guò)MEGA 7軟件的CustalW模塊進(jìn)行多序列比對(duì)，利用TBtools 2軟件截取過(guò)濾低質(zhì)量位點(diǎn)，最終采用最大似然法（maximum likelihood， ML）構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（最佳模型：TN93+G，bootstrap：1000）。

1.2.2 "LAMP體系的建立與可視化結(jié)果" 基于LAMP初步反應(yīng)體系（表2），參照Bst DNA Polymerase Large Fragment說(shuō)明書(shū)設(shè)置等溫?cái)U(kuò)增參數(shù)：60"℃恒溫反應(yīng)60 min，80"℃滅活10 min終止反應(yīng)。顯色檢測(cè)時(shí)加入2 μL SYBR Green Ⅰ（終濃度1×），觀察反應(yīng)溶液的顏色變化。陽(yáng)性擴(kuò)增的反應(yīng)液呈黃綠色熒光，陰性對(duì)照保持橙色；同步通過(guò)瓊脂糖凝膠驗(yàn)證其擴(kuò)增特異性，陽(yáng)性產(chǎn)物顯示梯形條帶，陰性樣本無(wú)條帶。試驗(yàn)全程設(shè)立陰性對(duì)照（無(wú)模板DNA）以確保檢測(cè)特異性。

1.2.3 "LAMP引物設(shè)計(jì)" 基于咖啡暹羅炭疽（C. siamense）菌株TUB2的種內(nèi)多序列比對(duì)結(jié)果，尋找序列特異區(qū)域。采用Primer Explorer V5（http：// primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）對(duì)保守差異片段進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，包括外部引物對(duì)F3和B3、內(nèi)部引物對(duì)FIP和BIP、環(huán)引物L(fēng)oopF和LoopB；參照自由能（ΔG≤-4.0 kcal/mol）與GC含量（40%～60%）等條件進(jìn)行篩選，篩選獲得2組候選引物（表3），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物驗(yàn)證同1.2.2，進(jìn)行熒光顯色（SYBR Green I）與瓊脂糖凝膠電泳（1%）。針對(duì)常規(guī)PCR中TUB2通用引物（Bt2a/Bt2b）種間特異性不足的問(wèn)題，通過(guò)Primer Primier 6設(shè)計(jì)物種特異性TUB2引物，用于后續(xù)靈敏度分析及田間樣本特異性驗(yàn)證。

1.2.4 "LAMP體系反應(yīng)條件的優(yōu)化" 為確定LAMP反應(yīng)的最佳溫度，設(shè)置6個(gè)反應(yīng)溫度，分別為54、57、60、63、65、70"℃，在各設(shè)定溫度下進(jìn)行反應(yīng)。同時(shí)，為優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間，選擇8個(gè)反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)（20～90 min，間隔10 min）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

在時(shí)間與溫度優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)體系組分進(jìn)行優(yōu)化。首先是內(nèi)外引物配比優(yōu)化，設(shè)定內(nèi)外引物比分別為8∶1、6∶1、4∶1、2∶1；鑒于Mg²⁺濃度影響DNA聚合酶活性，試驗(yàn)分別設(shè)置2、3、4、6、8、10、12 mmol/L Mg²⁺濃度梯度。而dNTPs作為擴(kuò)增反應(yīng)的原料，優(yōu)化其濃度（測(cè)試濃度為0～1.6 mmol/L，以0.2 mmol/L遞增），避免因其過(guò)少限制擴(kuò)增效率或過(guò)多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。此外，甜菜堿能夠促進(jìn)DNA解鏈并減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，在LAMP反應(yīng)中作為輔助劑，通過(guò)0～1.6 mmol/L（間隔0.2 mmol/L）濃度梯度進(jìn)行甜菜堿的用量?jī)?yōu)化。分析流程參照1.2.2。

1.2.5" LAMP體系靈敏度與特異性驗(yàn)證" 將已知濃度為10 ng/μL的咖啡炭疽菌DNA模板進(jìn)行系列稀釋，設(shè)置濃度梯度為10"ng/μL、1"ng/μL、100"pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL，將不同濃度的模板加入體系中進(jìn)行反應(yīng)，以確認(rèn)該體系的最低檢測(cè)限。在特異性驗(yàn)證中，選取咖啡葉片以及已鑒定的7種植物病原菌：黑孢菌（Nigrospora oryzae）、菜豆間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）、茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）、咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）、咖啡尾孢菌（Cercospora coffeicola）、線淺孔菌（Grammothele lineata）、首都葉點(diǎn)霉（Phyllosticta capitalensis）。提取上述樣品DNA加入LAMP體系中進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)結(jié)合常規(guī)PCR擴(kuò)增靶標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序。分析方法同1.2.2。

1.2.6 "優(yōu)化后的LAMP體系對(duì)田間咖啡病原物的檢測(cè) "提取田間采集疑似炭疽病感染的咖啡病葉組織DNA，并將其作為模板引入優(yōu)化后的LAMP檢測(cè)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)加入非炭疽菌樣品進(jìn)行檢測(cè)。分析方法同1.2.5。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 炭疽病樣本采集及病原菌分離

田間調(diào)查表明，在5個(gè)咖啡種植園中，均為中粒種咖啡呈現(xiàn)明顯感病性（圖1）。炭疽病侵染葉片呈現(xiàn)多階段病理特征：初期葉表出現(xiàn)黃褐色至黑褐色壞死斑；進(jìn)展期病斑擴(kuò)展，邊緣可見(jiàn)暗褐色同心輪紋；后期癥狀嚴(yán)重，發(fā)展為帶有黑色膿腫同心環(huán)的凹陷壞死病變。該病表現(xiàn)出全生育期侵染特性，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期、果實(shí)發(fā)育期均可造成典型病癥。

對(duì)采集的病葉樣本進(jìn)行組織分離，共分離純化獲得24個(gè)炭疽菌株，其地理分布信息見(jiàn)表4。在PDA培養(yǎng)基上，各菌株菌落均呈現(xiàn)典型形態(tài)特征：菌落直徑35～48 mm（培養(yǎng)第5天），中央?yún)^(qū)域?yàn)槊扌鯛畎咨z體，邊緣呈波狀或纖毛狀擴(kuò)展，并逐漸過(guò)渡為灰色至炭黑色，難以依據(jù)菌落形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分組，部分菌落形態(tài)見(jiàn)圖2。

2.2 "多基因聯(lián)合鑒定結(jié)果

采用MEGA軟件構(gòu)建基于最大似然法（maximum likelihood， ML）的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)目標(biāo)基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)及修剪。分析的基因片段順序及長(zhǎng)度如下：ITS（1～502 bp）、TUB2（503～885 bp）、CHS-1（886～1076 bp）、ACT（1077～1289 bp）、GAPDH（1290～1475 bp）。24株炭疽病菌被劃分為C. tropicale、C. karstii、C. fructicola、C. siamense 4個(gè)類群（圖3）。其中，C. siamense分支包含11個(gè)菌株（占總數(shù)的45.8%），且該分支菌株廣泛分布于5個(gè)采樣地點(diǎn)，顯示出顯著的地理分布優(yōu)勢(shì)。

2.3" LAMP體系引物的篩選

基于TUB2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的LAMP引物特異性評(píng)估顯示，Tub-L1引物有且僅對(duì)C. siamense產(chǎn)生典型LAMP擴(kuò)增特征，而其余7個(gè)炭疽菌屬菌株樣品（包括C. fructicola、C. gloeosporioides等）均未檢測(cè)到特異性擴(kuò)增條帶（圖4A、圖4B）；Tub-L2引物組在2號(hào)（C. siamense）和4號(hào)（C. fructicola）樣本中引發(fā)特異性擴(kuò)增（圖4C、圖4D）?；谠囼?yàn)效率及引物特異性驗(yàn)證，最終選定Tub-L1引物（圖5）作為后續(xù)檢測(cè)體系的試驗(yàn)引物。

2.4" LAMP體系的優(yōu)化

2.4.1" LAMP體系溫度與反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 "如圖6所示，LAMP擴(kuò)增體系在60～65"℃的溫度范圍內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增，均呈現(xiàn)明顯的黃綠色陽(yáng)性顯色反應(yīng)，其中63"℃條件下擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶最清晰，表明該溫度為最適反應(yīng)溫度。

基于上述溫度參數(shù)，通過(guò)時(shí)間梯度試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果表明，40 min反應(yīng)體系就可檢測(cè)到典型梯形條帶，其擴(kuò)增效率與90 min組無(wú)明顯差異（圖7）。鑒于LAMP技術(shù)快速檢測(cè)的特性，綜合檢測(cè)靈敏度與時(shí)效性，選擇50 min作為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)時(shí)間。對(duì)于低拷貝樣本，建議適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至60 min以提高產(chǎn)物積累量，此時(shí)體系仍能保持良好擴(kuò)增特異性。

2.4.2" LAMP體系各組分最適濃度篩選" 通過(guò)引物濃度配比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體系內(nèi)外引物比（F3/ B3∶FIP/BIP）為2∶1時(shí)無(wú)擴(kuò)增條帶，而4∶1、6∶1、8∶1組均能產(chǎn)生特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，8∶1組擴(kuò)增條帶亮度明顯高于其他組（圖8），故維持初始引物濃度比（8∶1）。

針對(duì)Mg²⁺濃度的梯度試驗(yàn)表明，4～8 mmol/L范圍內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)擴(kuò)增，其中8 mmol/L組擴(kuò)增效率最高，產(chǎn)物梯形條帶亮度明顯（圖9）。dNTPs濃度優(yōu)化結(jié)果顯示，0.8～1.8 mmol/L濃度區(qū)間均可完成有效擴(kuò)增，但0.8 mmol/L濃度擴(kuò)增效率與高濃度組無(wú)明顯差異（圖10），且低濃度的dNTPs能有效降低焦磷酸鎂沉淀風(fēng)險(xiǎn)。

甜菜堿濃度（0.8～1.6 mmol/L）的梯度試驗(yàn)表明，其濃度變化對(duì)擴(kuò)增效率及產(chǎn)物積累量無(wú)明顯影響（圖11），證實(shí)該體系對(duì)甜菜堿無(wú)依賴性。基于成本效益分析，最終確立TUB2靶標(biāo)檢測(cè)咖啡炭疽菌的優(yōu)化體系為：8 mmol/L Mg2?、0.8"mmol/L dNTPs，且無(wú)需添加甜菜堿。

2.4.3" LAMP體系反應(yīng)靈敏度與特異性驗(yàn)證" 對(duì)梯度稀釋模板進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證顯示，該體系檢測(cè)限為100 pg/μL，模板濃度為10 pg/μL時(shí)無(wú)條帶（圖12）。值得注意的是，常規(guī)PCR在相同模板濃度（1 ng/μL）下僅產(chǎn)生微弱條帶，而100 pg/μL時(shí)完全無(wú)擴(kuò)增結(jié)果，證實(shí)LAMP的靈敏度較PCR至少提升1個(gè)數(shù)量級(jí)。

采用7種植物病原菌及健康咖啡葉片DNA進(jìn)行特異性驗(yàn)證，如圖13所示，SYBR Green Ⅰ熒光染色顯示僅咖啡暹羅炭疽菌（C. siamense）反應(yīng)體系呈現(xiàn)黃綠色熒光，其余樣本均保持橙色本底。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步證實(shí)，僅目標(biāo)菌株出現(xiàn)階梯狀條帶，空白對(duì)照與其他病原菌均無(wú)擴(kuò)增條帶。綜合2.3引物篩選結(jié)果及上述試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的咖啡炭疽菌C. siamense LAMP反應(yīng)體系具有高度特異性。

2.4.4 "LAMP體系檢測(cè)田間病原菌 "結(jié)果如圖14所示，田間采集的12份咖啡病葉樣本經(jīng)LAMP檢測(cè)顯示，樣品2、4、5反應(yīng)體系出現(xiàn)明顯黃綠色顯色反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)清晰梯形條帶；其余7份均保持橙色，電泳無(wú)擴(kuò)增條帶。同步進(jìn)行的PCR驗(yàn)證試驗(yàn)（引物Tub-CS-L）表明，陽(yáng)性樣本2、4、5在173 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與LAMP檢測(cè)結(jié)果一致。研究證實(shí)優(yōu)化后的LAMP體系可成功檢測(cè)田間樣本中的咖啡暹羅炭疽菌（C. siamense），且檢測(cè)周期較常規(guī)PCR縮短62%（LAMP為50 min，PCR為130 min），滿足田間樣本快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)需求。

3 "討論

作為植物病原真菌的重要類群之一，炭疽菌屬真菌對(duì)多種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶作物（特別是水果和觀賞植物）造成嚴(yán)重危害，包括咖啡、胡椒、橡膠、菠蘿蜜等^[20-23]。其中暹羅炭疽菌（C. siamense）最初常被誤鑒定為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides），后經(jīng)學(xué)者系統(tǒng)修訂，確認(rèn)為獨(dú)立物種^[24]。本研究基于多基因系統(tǒng)發(fā)育分析方法，對(duì)24株咖啡炭疽菌分離株進(jìn)行分離鑒定，其中11株鑒定為暹羅炭疽菌（占分離株總數(shù)的45.8%），且分布最廣，為優(yōu)勢(shì)種群。這一結(jié)果與前期研究一致，如鞏佳莉^[25]從云南、海南收集的74株咖啡炭疽菌中鑒定出7個(gè)炭疽菌種，其中暹羅炭疽菌占比最高（32%）；陸英等^[26]對(duì)55株咖啡炭疽病菌的分類研究也顯示暹羅炭疽菌為優(yōu)勢(shì)種，占比達(dá)43.64%。值得注意的是，暹羅炭疽菌不僅是海南咖啡、橡膠和檳榔3種重要熱帶作物的主要病原菌，且因其在寄主間具有交叉感染能力，加之海南多年連作或相鄰種植的栽培模式，導(dǎo)致該病原菌潛伏感染的風(fēng)險(xiǎn)加劇，嚴(yán)重阻礙了田間咖啡炭疽病害的有效防控^[27]。因此，建立基于LAMP技術(shù)的早期檢測(cè)體系，結(jié)合病原菌種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，對(duì)實(shí)施精準(zhǔn)防控和降低咖啡炭疽病流行風(fēng)險(xiǎn)具有重要的實(shí)踐價(jià)值。

LAMP技術(shù)是基于特異性引物的多重識(shí)別機(jī)制，通過(guò)設(shè)計(jì)4～6條靶向基因保守區(qū)的引物實(shí)現(xiàn)高精度擴(kuò)增，其特異性源于引物與靶標(biāo)序列的嚴(yán)格互補(bǔ)匹配，若存在核苷酸錯(cuò)配或缺失，則擴(kuò)增無(wú)法進(jìn)行，從而確保檢測(cè)的高度特異性。相較于傳統(tǒng)PCR技術(shù)對(duì)熱循環(huán)儀器的依賴，LAMP技術(shù)因其恒溫?cái)U(kuò)增特性，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)流程并降低了設(shè)備需求；同時(shí)，該技術(shù)兼具擴(kuò)增效率高、結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，因此更適用于基層實(shí)驗(yàn)室或資源受限場(chǎng)景的快速檢測(cè)需求^{[12， 28]}。

LAMP技術(shù)的關(guān)鍵核心在于靶標(biāo)基因的精確篩選，需優(yōu)先選擇種內(nèi)高保守，且種間多態(tài)性顯著的基因區(qū)段。除常規(guī)應(yīng)用的ITS、TUB2基因外，近年相關(guān)研究拓展至16S rDNA、CYP51C、CYP450等基因位點(diǎn)^[29-31]。如王賢達(dá)等^[32]基于葡萄炭疽病菌（C. gloeosporioides）的ITS特異區(qū)域構(gòu)建的LAMP體系，該體系對(duì)葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、桃褐腐病菌（Monilinia laxa）等菌株無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)。ARAVINDARAM等^[33]基于辣椒炭疽菌（C. capsici）的TUB2基因構(gòu)建了LAMP體系，該體系對(duì)菜豆殼球孢菌（Macrophomina phaseolina）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）等8種病原菌均無(wú)擴(kuò)增。王冠華^[34]開(kāi)發(fā)了蘋(píng)果炭疽病菌（C. gloeosporioides）TUB靶向檢測(cè)體系，該體系對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病菌（Alternaria alternaria）、蘋(píng)果霉心病菌（Trichothecium roseum）等常見(jiàn)病原體具有嚴(yán)格特異性。本研究以TUB2特異性區(qū)域序列為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)LAMP特異性引物組。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，該體系對(duì)黑孢菌（Nigrospora oryzae）、咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）等7種非靶標(biāo)菌株無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)對(duì)炭疽屬內(nèi)7個(gè)近緣種（C. tropicale、C. fructicola、C. karstii等）亦無(wú)交叉反應(yīng)。此外，對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)一步排除了咖啡葉片基因組DNA對(duì)檢測(cè)結(jié)果的潛在干擾，證實(shí)了該LAMP檢測(cè)體系的特異性與可靠性。

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的可視化檢測(cè)常采用熒光指示劑，如利用SYBR Green Ⅰ、鈣黃綠素-錳離子復(fù)合物、羥基萘酚藍(lán)（HNB）等進(jìn)行驗(yàn)證。研究表明，HNB與SYBR Green Ⅰ的檢測(cè)靈敏度顯著優(yōu)于其他指示劑；然而，HNB的顯色機(jī)制依賴于反應(yīng)過(guò)程中焦磷酸鎂沉淀導(dǎo)致的pH變化，其濃度需精確調(diào)控，濃度過(guò)高會(huì)抑制Bst DNA聚合酶活性^[13]。本研究選擇SYBR Green Ⅰ作為指示劑，其雙鏈DNA結(jié)合特性可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增終產(chǎn)物的即時(shí)熒光檢測(cè)，但傳統(tǒng)開(kāi)蓋加樣操作易產(chǎn)生氣溶膠污染，需嚴(yán)格執(zhí)行分區(qū)操作（樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、檢測(cè)區(qū)的物理隔離）并配合紫外臭氧滅菌。為規(guī)避污染風(fēng)險(xiǎn)，可借鑒閉管檢測(cè)策略，即把SYBR Green Ⅰ預(yù)加至PCR管蓋內(nèi)壁，擴(kuò)增結(jié)束后通過(guò)高速離心實(shí)現(xiàn)染料與反應(yīng)液的充分混合，該方法可有效降低假陽(yáng)性率^[35]。

病原物檢測(cè)體系的靈敏度是決定田間早期診斷效能的重要參數(shù)。本研究建立的咖啡炭疽病菌暹羅炭疽菌（C. siamense）LAMP體系，經(jīng)梯度稀釋模板驗(yàn)證，其最低檢測(cè)限為100 pg/μL。該靈敏度與已報(bào)道的向日葵核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）^[36]、余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病菌（Diaporthe phoenicicola）^[37]等體系相當(dāng)。不同研究體系間其靈敏度存在差異，王賢達(dá)等^[32]基于葡萄炭疽病設(shè)計(jì)的檢測(cè)體系靈敏度達(dá)500 fg/μL，汪少麗等^[35]基于蘋(píng)果炭疽菌基因構(gòu)建的LAMP體系其靈敏度突破至1 ag/μL，靈敏度的差異可能與靶標(biāo)基因拷貝數(shù)、核酸純化方法有關(guān)。盡管本體系的靈敏度處于中等水平，但仍優(yōu)于常規(guī)PCR技術(shù)。

病原菌的精準(zhǔn)快速鑒定是咖啡炭疽病綜合防控體系的核心環(huán)節(jié)，直接影響病害預(yù)警的時(shí)效性及防控決策的科學(xué)性。本研究基于暹羅炭疽菌（C. siamense）的TUB2基因特異區(qū)域，成功構(gòu)建了基于比色變化、快速精確的LAMP檢測(cè)體系。該體系的建立突破了傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法周期長(zhǎng)、分子檢測(cè)依賴精密儀器等的技術(shù)瓶頸，為咖啡炭疽病的早期診斷及其精準(zhǔn)防控策略的實(shí)施提供技術(shù)支撐，同時(shí)為咖啡的抗病育種及綜合防治提供理論依據(jù)，也為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上其他病害的快速診斷提供重要參考。

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