橡膠樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系品種云研73-477不同發(fā)育階段體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)效率比較

摘" 要：為了提高橡膠樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系品種云研73-477體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)效率，提高其正常成熟體胚與體胚植株獲得率，為該無(wú)性系品種體胚植株規(guī)?；瘮U(kuò)繁及遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。本研究將云研73-477不同發(fā)育階段花藥初生體細(xì)胞幼胚接種至附加不同種類及濃度的外源激素培養(yǎng)基中進(jìn)行成熟培養(yǎng)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)體胚成熟率、正常成熟體胚及體胚植株獲得率，綜合分析比較不同發(fā)育階段初生體細(xì)胞幼胚的成熟培養(yǎng)效率，優(yōu)選出適宜各發(fā)育階段花藥初生體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)的外源激素組合。結(jié)果表明：（1）云研73-477花藥初生體細(xì)胞幼胚的成熟培養(yǎng)效果隨其發(fā)育程度的增加呈升高趨勢(shì)，早期子葉胚的成熟培養(yǎng)效果最好，體胚成熟率均高于50%，變幅為50.74%～74.83%，總體均值高達(dá)（66.25± 6.98）%，且成熟體胚大都具有雙極性結(jié)構(gòu)，能正常萌發(fā)形成完整植株。正常成熟體胚獲得率變幅為35.0%～59.96%，總體均值為（47.80±6.89）%，體胚植株獲得率變幅為15.62%～49.17%，總體均值為（26.67±8.99）%。魚(yú)雷胚次之，心形胚最差，二者的體胚成熟率總體均值低于31%，分別為（30.05±12.68）%和（29.33±10.93）%，且成熟體胚大都畸形化，多為片狀、團(tuán)塊狀，不能正常萌發(fā)形成完整植株，正常成熟體胚獲得率僅分別為（15.64±7.01）%和（5.46±4.28）%，分別較早期子葉胚低32.16%和42.34%，體胚植株獲得率分別為（7.22±3.41）%和（0.83±0.80）%，僅為早期子葉胚的0.27倍和0.03倍。（2）不同發(fā)育階段花藥初生體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)對(duì)外源激素的需求不同，心形胚為6-BA 0.5"mg/L+NAA 0.15"mg/L+ KT"0.25 mg/L，魚(yú)雷胚為ABA 0.4 mg/L+GA₃ 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.15"mg/L，早期子葉胚為ABA"0.1"mg/L+GA₃ 1.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù)；成熟培養(yǎng)；體細(xì)胞幼胚；正常成熟體胚；體胚植株中圖分類號(hào)：S794.1 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Comparison of Somatic Embryo Maturation Efficiency at Different Developmental Stages of Rubber Tree Variety Yunyan 73-477

GUI Mingchun¹， YU Jingjuan^1*， FANG Fang¹， LUO Ronghui²， MIAO Jia¹， LI Ling¹， LIANG Guoping¹， SUN Xiaolong^1**， LIU Jin¹

1. Yunnan Institute of Tropical Crops / Yunnan Key Laboratory of Sustainable Utilization Research on Rubber Tree， Jinghong， Yunnan 666100， China; 2. College of Tea （Pu’er）， West Yunnan University of Applied Sciences， Pu’er， Yunnan 665000， China

Abstract： The study investigated the effects of different exogenous hormones on somatic embryo maturation to improve the maturation efficiency of somatic embryos and increase the yield of normal mature embryos and embryo-derived plantlets in the rubber tree variety Yunyan 73-477. Primary somatic embryos from anthers at different developmental stages were cultured on media supplemented with various types and concentrations of exogenous hormones. The maturation rates， normal mature embryo rates， and plantlet conversion rates were comprehensively analyzed to compare maturation efficiencies and optimize hormone combinations for different developmental stages. The maturation efficiency increased with embryo developmental progression， with cotyledon embryos showing optimal results. The maturation rates exceeded 50% [range： 50.74%?74.83%， mean： （66.25±6.98）%]. Most mature embryos displayed bipolar structure and could normally germinate into complete plantlets， with normal mature embryo rates ranging from 35.0%? 59.96% [mean： （47.80±6.89）%] and plantlet conversion rates ranging from 15.62%?49.17% [mean： （26.67±8.99）%]. Torpedo-shaped embryos showed intermediate performance， while heart-shaped embryos performed the poorest， both with maturation rates below 31% [means： （30.05±12.68）% and （29.33±10.93）%， respectively]. Most mature embryos from the stages were malformed （leaf-like or callus-like） and failed to develop into complete plantlets. The normal mature embryo rates were only （15.64±7.01）% and （5.46±4.28）%， respectively， 32.16% and 42.34% lower than cotyledon embryos. Plantlet conversion rates were （7.22±3.41）% and （0.83±0.80）%， merely 0.27-fold and 0.03-fold of cotyledon embryos. Optimal exogenous hormones varied with developmental stages： heart-shaped embryos required 6-BA 0.5"mg/L+NAA 0.15"mg/L+KT 0.25"mg/L， torpedo-shaped embryos needed ABA 0.4"mg/L+GA₃"0.5"mg/L+6-BA 2.0"mg/L+NAA 0.15 mg/L， and cotyledon embryos performed best with ABA 0.1"mg/L+GA₃"1.0"mg/L+6-BA 1.5"mg/L+NAA 0.2 mg/L.

Keywords： Hevea brasiliensis; maturation culture; somatic embryos; normal mature embryos; embryo-derived plantlets

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.008

橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）體胚植株（又稱自根幼態(tài)無(wú)性系）與同無(wú)性系品種的老態(tài)芽接苗相比，具有生長(zhǎng)迅速、抗逆性強(qiáng)、林相整齊度及產(chǎn)膠量高等優(yōu)點(diǎn)^[1-4]，被稱為優(yōu)勢(shì)種植材料，應(yīng)用前景十分廣闊，尤其是在老舊、低產(chǎn)低質(zhì)膠園更新改造中具有重大意義。二代膠園經(jīng)過(guò)約35～40 a的種植生長(zhǎng)，土壤板結(jié)，自然肥力低下，增施有機(jī)肥、精細(xì)管理等措施是保障二代膠園生產(chǎn)能力的有效舉措，但這無(wú)疑使生產(chǎn)成本大幅增加，在目前膠價(jià)低迷的大環(huán)境中，這些措施難以落地生根。在同等管理水平下，體胚植株的生長(zhǎng)、抗逆性、產(chǎn)膠量均優(yōu)于同無(wú)性系品種的老態(tài)芽接苗，據(jù)此，采用體胚植株代替老態(tài)芽接苗進(jìn)行二代膠園更新改造，無(wú)疑是保障天然橡膠產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定健康發(fā)展的有效舉措之一。

橡膠樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)是繁育其體胚植株的唯一途徑，其中花藥組織培養(yǎng)是主要技術(shù)途徑之一，也是研究與應(yīng)用最為廣泛的橡膠樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)，亦是世界公認(rèn)的難題之一，且培養(yǎng)效果在基因型間存在極大差異^[5]，目前僅有少數(shù)無(wú)性系品種如熱研73397可通過(guò)體胚循環(huán)增殖技術(shù)實(shí)現(xiàn)規(guī)模化量產(chǎn)^[5-6]，推廣利用效果較好，已在海南、云南及廣東三大天然橡膠主產(chǎn)區(qū)推廣種植超2000"hm²。而云研80-1983、云研77-4、云研77-2及云研73-46等云南自育橡膠樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系品種的花藥組織培養(yǎng)技術(shù)尚未攻克，未建立高效穩(wěn)定的體胚植株再生技術(shù)體系或?qū)崿F(xiàn)零突破。至今，在云南自育橡膠樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系品種中，僅建立了云研73-477的花藥體胚植株再生技術(shù)體系^[7]，在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，云研73-477的雄蕊極易脫分化產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率高達(dá)87.33%，且所得愈傷胚性強(qiáng)，能再分化產(chǎn)生體胚，體胚發(fā)生率達(dá)76.0%^[7]，但體胚畸形化嚴(yán)重，這一技術(shù)瓶頸嚴(yán)重制約了該無(wú)性系品種體胚植株規(guī)模化量產(chǎn)及推廣應(yīng)用。前期研究發(fā)現(xiàn)：云研73-477體胚發(fā)育完整過(guò)程與譚德冠等^[8]報(bào)道的一致，可分為球形胚→心形胚→魚(yú)雷胚→子葉胚共4個(gè)階段，且其體胚發(fā)生及發(fā)育不具同步性，在體胚分化過(guò)程中，同一塊胚性愈傷組織中往往存在多個(gè)心形胚、魚(yú)雷胚及早期子葉胚中2種或2種以上不同發(fā)育階段的初生體細(xì)胞胚。過(guò)去，繁育云研73-477體胚植株時(shí)，體胚分化培養(yǎng)30～40"d后，通常將同一塊胚性愈傷組織分化而來(lái)的全部幼胚分離后轉(zhuǎn)接到同一種培養(yǎng)基中進(jìn)行成熟培養(yǎng)，成熟效果較差，不僅體胚成熟率低，且成熟體胚畸形嚴(yán)重。這是否由不同發(fā)育階段體細(xì)胞幼胚正常發(fā)育所需的外源激素不同而造成，還不得而知。據(jù)此，本研究以云研73-477不同發(fā)育階段花藥初生體細(xì)胞幼胚為外植體，在附加不同外源激素及濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行成熟培養(yǎng)，分析比較不同發(fā)育階段體細(xì)胞幼胚的成熟培養(yǎng)效率，優(yōu)選出適宜各發(fā)育階段花藥初生體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)的外源激素組合，以期提高正常成熟體胚及體胚植株獲得率，為該無(wú)性系品種體胚植株規(guī)?；a(chǎn)及遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 "材料與方法

1.1 "材料

本研究于2023年7月至2024年11月在云南省熱帶作物科學(xué)研究所橡膠研究中心完成，其中驗(yàn)證試驗(yàn)于2024年7—11月進(jìn)行。

外源激素采購(gòu)于上海生物工程技術(shù)有限公司，其他試劑采購(gòu)于云南泰朗宣科技有限公司。培養(yǎng)基中均添加蔗糖70 g/L，瓊脂粉6 g/L，椰子汁50"mL/L，活性炭1"g/L。pH于高溫高壓滅菌前調(diào)至5.8～6.2，解剖刀及鑷子等試驗(yàn)工具均用接種加熱器徹底滅菌。體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)階段用帶有透氣膜的培養(yǎng)皿（直徑為8"cm），每皿分裝培養(yǎng)基30"mL，接種后置于溫度為（24±0.5）℃的培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)；體胚植株誘導(dǎo)階段用帶有透氣膜的試管，每管分裝培養(yǎng)基35～40 mL，接種后置于溫度為（26±0.5）℃的培養(yǎng)室中光培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為1000～1500 lx，光照時(shí)間為10 h/d）。

1.2" 方法

1.2.1 "初生體細(xì)胞幼胚的誘導(dǎo)" 以橡膠樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系品種云研73-477花藥初生心形胚、魚(yú)雷胚及早期子葉胚為供試材料。花藥外植體采自于云南省熱帶作物科學(xué)研究所江北實(shí)驗(yàn)基地，滅菌方法同管艷等^[7]報(bào)道的一致?；ㄋ幱鷤M織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D 1.5"mg/L+NAA 0.25"mg/L+KT 0.5"mg/L；初生體細(xì)胞幼胚分化培養(yǎng)基為MS+ ABA 0.2"mg/L+GA₃ 0.6"mg/L+6-BA 0.8"mg/L+ NAA 0.25 mg/L+KT 0.5 mg/L。

1.2.2" 體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)" 以改良MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，外源激素ABA（A）、GA₃（B）、6-BA（C）、NAA（D）和KT（E）為試驗(yàn)因子，按L₁₆（4⁵）正交試驗(yàn)表進(jìn)行，各因子水平及濃度配比見(jiàn)表1、表2。

分別將發(fā)育階段處于心形胚、魚(yú)雷胚和早期子葉胚的花藥初生體細(xì)胞幼胚（圖1）從愈傷組織中切割分離后轉(zhuǎn)接至16個(gè)處理中（表2），每個(gè)處理接5皿，每皿接12個(gè)幼胚。培養(yǎng)至45"d時(shí)，調(diào)查體細(xì)胞幼胚的成熟培養(yǎng)情況，統(tǒng)計(jì)體胚成熟率[體胚成熟率=成熟體胚總數(shù)/接種體細(xì)胞幼胚總數(shù)×100%]及正常成熟體胚獲得率[正常成熟體胚獲得率=正常成熟體胚總數(shù)/接種體細(xì)胞幼胚總數(shù)×100%]，正常成熟體胚的判定標(biāo)準(zhǔn)同李淑雅^[9]的報(bào)道一致。正常成熟體胚繼續(xù)培養(yǎng)至50"d時(shí)，轉(zhuǎn)入體胚植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行體胚植株誘導(dǎo)，光培養(yǎng)60"d后統(tǒng)計(jì)體胚植株獲得率[體胚植株獲得率=體胚植株總株數(shù)/接種體細(xì)胞幼胚總數(shù)× 100%]。體胚植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基為4/5"MS+GA₃ 1.0"mg/L+IAA 0.25"mg/L+KT"0.5"mg/L+VB₂ 2.0"mg/L+ 蔗糖50"g/L+瓊脂5.8"g/L+活性炭1.0"g/L。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2016軟件和SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 不同發(fā)育階段花藥體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

將云研73-477花藥初生心形胚、魚(yú)雷胚和早期子葉胚分別接種至16種附加不同外源激素的體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)基中（圖2），暗培養(yǎng)20 d后，3種不同發(fā)育階段的體細(xì)胞幼胚大部分均明顯長(zhǎng)大，但未發(fā)育至成熟，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，體細(xì)胞幼胚繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，培養(yǎng)至45"d時(shí)，大部分幼胚已發(fā)育至成熟。成熟培養(yǎng)效果在3種不同發(fā)育階段體細(xì)胞幼胚間存在較大差異：早期子葉胚的效果最好，大部分幼胚已發(fā)育至成熟，且多為雙子葉或多子葉的正常體胚，少部分體胚已長(zhǎng)出幼根，繼續(xù)培養(yǎng)至50"d，將正常成熟體胚轉(zhuǎn)入體胚植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～25"d后，胚根發(fā)育形成粗壯的主根，胚芽萌發(fā)出新芽（圖3），繼續(xù)培養(yǎng)至40～50"d后便可獲得具有根、莖、葉的完整體胚植株；魚(yú)雷胚的次之，雖然大部分幼胚能發(fā)育至成熟，但畸形化嚴(yán)重（圖2），正常成熟體胚很少；心形胚的最差，僅有少部分幼胚能夠發(fā)育至成熟，且成熟體胚大都為團(tuán)狀、長(zhǎng)筒狀等畸形胚，不能進(jìn)一步發(fā)育形成完整植株，大部分幼胚雖有長(zhǎng)大，但未發(fā)育至成熟，甚至有個(gè)別幼胚生長(zhǎng)停滯，其形態(tài)與大小和轉(zhuǎn)接時(shí)無(wú)差異。

由表3可知，云研73-477體細(xì)胞幼胚的成熟培養(yǎng)效果隨其發(fā)育程度的增加呈升高趨勢(shì)。 具體表現(xiàn)為：早期子葉胚的培養(yǎng)效果最好，體胚成熟率（Ⅰ）的變幅為50.74%～74.83%，總體均值高達(dá)（66.25±6.98）%，正常成熟體胚獲得率（Ⅱ）的變幅為（35.0～59.96）%，總體均值為（47.80±6.89）%，體胚植株獲得率（Ⅲ）的變幅為15.62%～49.17%，總體均值為（26.67±8.99）%；魚(yú)雷胚的次之，體胚成熟率，正常成熟體胚和體胚植株獲得率的變幅分別為5.85%～50.28%、1.67%～30.48%和1.67%～ 15.0%，總體均值分別為（30.05±12.68）%、（15.64± 7.01）%和（7.22±3.41）%；心形胚的最差，雖體胚成熟率的總體均值為（29.33±10.93）%，僅比魚(yú)雷胚的低0.72%，但所獲成熟體胚多為畸形胚，不能進(jìn)一步發(fā)育形成體胚植株，正常成熟體胚和體胚植株獲得率的總體均值分別僅為（5.46±4.28）%和（0.83%±0.80）%，較早期子葉胚的低42.34%和25.84%。這與試驗(yàn)過(guò)程中觀察的結(jié)果（圖2）相一致。

體胚成熟率、正常成熟體胚獲得率及體胚植株獲得率的變異系數(shù)大小在3種體細(xì)胞幼胚中均表現(xiàn)為：體胚植株獲得率gt;正常成熟體胚獲得率gt;體胚成熟率，這說(shuō)明體胚植株獲得率對(duì)5種外源激素組合發(fā)生改變而產(chǎn)生的響應(yīng)較體胚成熟率及正常成熟體胚獲得率更敏感。

2.2 "外源激素對(duì)不同發(fā)育階段花藥體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)的影響

2.2.1 "外源激素對(duì)心形胚成熟培養(yǎng)效果的影響" 由表4可知，在云研73-477花藥初生心形胚成熟培養(yǎng)中，5種外源激素影響的主次順序和水平優(yōu)組合在體胚成熟率、正常成熟體胚獲得率及體胚植株獲得率間存在差異。對(duì)體胚成熟率影響的因素順序?yàn)椋築gt;Agt;Egt;Dgt;C，即GA₃的影響最大，ABA次之，6-BA最小，水平較優(yōu)組合為A₁B₃C₃D₂E₁；對(duì)正常成熟體胚獲得率影響的因素順序?yàn)椋築gt;Egt;Cgt;Agt;D，即GA₃的影響最大，KT次之，NAA最小，水平較優(yōu)組合為A₂B₂C₁D₃E₃；對(duì)體胚植株獲得率影響的因素順序?yàn)椋築gt;Dgt;Agt;Cgt;E，即GA₃的影響最大，NAA次之，KT最小，水平較優(yōu)組合為A₁B₁C₁D₃E₂。由此可知，5種外源激素對(duì)上述3個(gè)指標(biāo)因素影響的順序雖有差異，但影響最大的均為GA₃，說(shuō)明在心形胚成熟培養(yǎng)中，GA₃是最重要的外源激素，隨其濃度的增加，體胚成熟率及正常成熟體胚獲得率均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，分別在B₃和B₂達(dá)最大值，而體胚植株獲得率則表現(xiàn)出先降低后增加再降低的趨勢(shì)，無(wú)明顯規(guī)律性，這可能與外源激素間存在交互作用有關(guān)。

2.2.2" 外源激素對(duì)魚(yú)雷胚成熟培養(yǎng)效果的影響" 由表5可知，試驗(yàn)所涉5種外源激素對(duì)魚(yú)雷胚發(fā)育成熟影響的主次順序及水平較優(yōu)組合在體胚成熟率、正常成熟體胚獲得率及體胚植株獲得率間存在差異。體胚成熟率的主次順序?yàn)椋篈gt;Bgt;Dgt;Egt;C，即ABA的影響最大，GA₃次之，6-BA最小，水平較優(yōu)組合為A₁B₂C₁D₃E₃；正常成熟體胚獲得率的主次順序?yàn)椋篈gt;Cgt;Dgt;Bgt;E，即ABA的影響最大，6-BA次之，KT最小，水平較優(yōu)組合為A₁B₂C₁D₁E₄；體胚植株獲得率的主次順序?yàn)椋篍gt;Dgt;Bgt;Agt;C，即KT的影響最大，NAA次之，6-BA最小，水平較優(yōu)組合為A₄B₂C₄D₃E₁。

2.2.3" 外源激素對(duì)早期子葉胚成熟培養(yǎng)效果" 由表6可知，5種外源激素對(duì)早期子葉胚發(fā)育成熟的影響效應(yīng)及水平較優(yōu)組合在體胚成熟率、正常成熟體胚獲得率及體胚植株獲得率間存在差異。體胚成熟率順序表現(xiàn)為：Bgt;Cgt;Agt;Egt;D，即GA₃的影響最大，6-BA次之，NAA最小，水平較優(yōu)組合為A₁B₃C₄D₄E₁；正常成熟體胚獲得率順序表現(xiàn)為：Bgt;Agt;Egt;Cgt;D，即GA₃的影響最大，ABA次之，NAA最小，水平較優(yōu)組合為A₃B₃C₂D₄E₄；體胚植株獲得率順序表現(xiàn)為：Bgt;Dgt;Cgt;Egt;A，即GA₃的影響最大，NAA次之，ABA最小，水平較優(yōu)組合為A₂B₃C₃D₄E₁。

2.2.4" 外源激素優(yōu)組合的篩選" 上述分析并不能得到適宜心形胚、魚(yú)雷胚及早期子葉胚成熟培養(yǎng)的外源激素水平較優(yōu)組合，需對(duì)5個(gè)因子對(duì)體胚成熟率、正常成熟體胚獲得率及體胚植株獲得率3個(gè)指標(biāo)的影響情況進(jìn)行逐一分析，方可獲得外源激素較優(yōu)組合。相對(duì)于心形胚而言，A因子較優(yōu)水平分別為A₁、A₂和A₁，且由表3可知，變異系數(shù)體胚植株獲得率（96.05%）gt;正常成熟體胚獲得率（78.40%）gt;體胚成熟率（37.26%），表明體胚植株獲得率對(duì)A因子水平改變而產(chǎn)生的響應(yīng)較體胚成熟率及正常成熟體胚獲得率更敏感，故A因子的較優(yōu)水平應(yīng)為A₁，同理，B、C、D、E因子的較優(yōu)水平分別為B₁、C₁、D₃、E₂，因此，適宜云研73-477心形胚成熟培養(yǎng)的外源激素水平較優(yōu)組合為A₁B₁C₁D₃E₂；以此類推，可得出適宜魚(yú)雷胚與早期子葉胚成熟培養(yǎng)的外源激素水平較優(yōu)組合分別為A₄B₂C₄D₃E₁和A₂B₃C₃D₄E₁。

2.2.5" 適宜體胚成熟培養(yǎng)最佳幼胚的篩選" 綜上所述，云研73-477不同發(fā)育階段花藥初生體細(xì)胞幼胚的成熟培養(yǎng)效果在3種不同發(fā)育階段間存在較大差異，成熟效果隨幼胚發(fā)育程度的增加表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，即早期子葉胚gt;魚(yú)雷胚gt;心形胚。由此可知，在云研73-477花藥體胚植株繁育中，當(dāng)花藥初生體胚發(fā)育階段處于早期子葉胚時(shí)，將其單獨(dú)分離出進(jìn)行成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)效果較好，體胚成熟率達(dá)（66.25±6.98）%，正常成熟體胚獲得率為（47.80±6.98）%，體胚植株獲得率為（26.67±8.99）%，因此，早期子葉胚是最適宜用于體胚成熟培養(yǎng)的幼胚；選出適宜早期子葉胚成熟培養(yǎng)的外源激素組合（ABA 0.1"mg/L+GA₃ 1.0"mg/L+6-BA 1.5"mg/L+ NAA 0.20 mg/L）在試驗(yàn)所設(shè)的16個(gè)處理中未出現(xiàn)，為了驗(yàn)證最佳外源激素濃度，將早期子葉胚分別接種于附加ABA 0.1"mg/L+GA₃ 1.0"mg/L+ 6-BA 1.5"mg/L+NAA 0.20 mg/L（記為S₁₇）和ABA 0.4"mg/L+GA₃ 1.0"mg/L+6-BA 1.0"mg/L+NAA 0.20 mg/L（S₁₅）2種成熟培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)早期子葉胚在S₁₇中暗培養(yǎng)45 d，體胚成熟率為（72.50±2.20）%，正常成熟體胚獲得率為（64.86±1.68）%，體胚植株獲得率為（57.22± 0.96）%，分別較S₁₅的高5.42%、7.53%和8.05%。因此，成熟培養(yǎng)基中附加ABA 0.1"mg/L+GA₃ 1.0"mg/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L時(shí)最優(yōu)，利于云研73-477早期子葉形胚成熟培養(yǎng)。

3 "討論

3.1 "體胚成熟培養(yǎng)具有重要意義

在植物組織培養(yǎng)中，體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)是為了促進(jìn)體胚進(jìn)一步發(fā)育，減少異常體胚（生長(zhǎng)停滯、發(fā)育不全、畸形等）的產(chǎn)生，提高體胚質(zhì)量及萌發(fā)形成完整植株的能力，體胚成熟程度及其質(zhì)量顯著影響其在后續(xù)培養(yǎng)中能否萌發(fā)形成完整植株。橡膠樹(shù)花藥初生體胚發(fā)育至成熟需經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚(yú)雷胚、子葉胚共4個(gè)不同發(fā)育階段^[8]，此發(fā)育過(guò)程先后順序是嚴(yán)格且不可逾越的^[10]，而每個(gè)發(fā)育階段所需時(shí)間長(zhǎng)短則與體胚基因型、成熟培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件等緊密相關(guān)。有研究表明^[8，11]，橡膠樹(shù)花藥初生體胚發(fā)育過(guò)程中存在以下不良現(xiàn)象：幼胚易在球形胚與魚(yú)雷胚時(shí)停滯生長(zhǎng)或褐化；心形胚不能進(jìn)一步發(fā)育成魚(yú)雷胚，在后續(xù)培養(yǎng)中產(chǎn)生畸形胚；魚(yú)雷胚或子葉胚基部會(huì)分化產(chǎn)生叢生次生體胚；子葉胚出現(xiàn)發(fā)育不全、褐化、子葉肥大或愈傷化。上述不良現(xiàn)象對(duì)體胚正常發(fā)育成熟是極其不利的，致使大部分無(wú)性系品種的花藥體胚植株再生效率低下，無(wú)法進(jìn)行規(guī)?；瘮U(kuò)繁，目前僅有熱研73397和熱研917可工廠化生產(chǎn)^[12-13]。據(jù)此，攻克橡膠樹(shù)體胚成熟培養(yǎng)技術(shù)已勢(shì)在必行，是實(shí)現(xiàn)體胚植株工廠化生產(chǎn)與推廣應(yīng)用急需解決的問(wèn)題之一。本研究分析比較云研73-477不同發(fā)育階段初生體細(xì)胞幼胚的成熟培養(yǎng)效率，篩選出適宜各發(fā)育階段花藥初生體細(xì)胞幼胚成熟培養(yǎng)的外源激素組合，并證實(shí)了早期子葉胚是進(jìn)行體胚成熟培養(yǎng)的最佳材料，使體胚成熟率、正常體胚及體胚植株獲得率顯著提高，分別高達(dá)（72.50±2.20）%、（64.86±1.68）%和（57.22±0.96）%，所獲植株生勢(shì)強(qiáng)，練苗后易移栽成活，成活率在75%以上，且在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中未出現(xiàn)停滯生長(zhǎng)的現(xiàn)象，本研究結(jié)果為該無(wú)性系品種體胚植株工廠化生產(chǎn)與推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

此外，在試驗(yàn)觀察中發(fā)現(xiàn)，心形胚和魚(yú)雷胚的成熟培養(yǎng)效果極差，雖有約30%的幼胚能發(fā)育至成熟，但大都為畸形胚，能正常萌發(fā)成苗的極少。本研究是將心形胚和魚(yú)雷胚從愈傷組織中單獨(dú)分離出進(jìn)行成熟培養(yǎng)，因胚體太小，分離時(shí)易被切傷，且自身儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)十分有限，致使部分幼胚在成熟培養(yǎng)前期因營(yíng)養(yǎng)匱乏而停滯生長(zhǎng)或褐化死亡，若將兩類幼胚連同其基部少許愈傷組織一起分離進(jìn)行培養(yǎng)，待二者的發(fā)育階段進(jìn)入早期子葉胚后再單獨(dú)分離轉(zhuǎn)入本研究篩選的外源激素優(yōu)組合中培養(yǎng)，或許是提高體胚成熟培養(yǎng)效率的有效舉措。

3.2" 外源激素對(duì)橡膠樹(shù)花藥離體培養(yǎng)的影響

在橡膠樹(shù)花藥離體培養(yǎng)中，外源激素是不可或缺的，其愈傷組織誘導(dǎo)，體細(xì)胞胚分化、成熟、萌發(fā)成苗等培養(yǎng)基中均需附加適宜的外源激素種類、濃度及配比^{[10-11， 14]}。其中生長(zhǎng)素類（NAA、2，4-D等）和細(xì)胞分裂素類（6-BA、KT等）貫穿于整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程，而2，4-D常用于愈傷組織誘導(dǎo)階段，其誘導(dǎo)效果優(yōu)于NAA、IAA^[15]，且在體細(xì)胞胚分化前期發(fā)揮了促進(jìn)作用，但在體胚發(fā)育后期易起到抑制作用^[16]，致使體細(xì)胞胚成熟率低下，不適宜用于橡膠樹(shù)體胚成熟培養(yǎng)。脫落酸（ABA）大都用于體胚分化及成熟培養(yǎng)階段，赤霉素（GA₃）則常用于體胚分化、成熟及萌發(fā)成苗階段。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探索在橡膠樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中常用的5種外源激素（ABA、GA₃、6-BA、NAA及KT）對(duì)云研73-477花藥初生體細(xì)胞胚（心形胚、魚(yú)雷胚及早期子葉胚）成熟培養(yǎng)的影響效應(yīng)，結(jié)果表明不同發(fā)育階段體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)所需外源激素種類及濃度存在差異，6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.15 mg/L、KT"0.25 mg/L利于心形胚成熟，6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.15 mg/L、ABA 0.4 mg/L，GA₃ 0.5 mg/L促進(jìn)魚(yú)雷胚成熟，而6-BA 1.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L、ABA 0.1mg/L及GA₃ 1.0"mg/L對(duì)早期子葉胚的成熟有益。由此可知，低濃度NAA和ABA對(duì)體細(xì)胞胚正常成熟具有促進(jìn)作用；而KT僅在體胚發(fā)育初期（心形胚）發(fā)揮促進(jìn)作用，在體胚發(fā)育后期則起到抑制作用；6-BA在整個(gè)體胚發(fā)育過(guò)程起到關(guān)鍵作用，6-BA 0.5～ 2.0"mg/L利于體胚正常發(fā)育成熟；體胚發(fā)育初期（心形胚）不需附加外源激素GA₃，而在體胚發(fā)育后期（魚(yú)雷胚、早期子葉胚）分別附加GA₃ 0.5 mg/L和GA₃ 1.0 mg/L利于體胚正常發(fā)育，這可能因?yàn)榛ㄋ庴w胚在前期分化培養(yǎng)時(shí)積累的內(nèi)源GA₃處于較高水平，所以無(wú)需添加外源GA₃也能保證體胚進(jìn)一步發(fā)育至魚(yú)雷胚。此外，本研究?jī)?yōu)選得到適宜早期子葉胚成熟培養(yǎng)的6-BA、NAA及ABA最適濃度與李玲等^[10]的試驗(yàn)結(jié)果存在差異，這可能是由二者采用的無(wú)性系品種和體胚的來(lái)源不同而造成，李玲等^[10]的最佳濃度是基于無(wú)性系品種熱墾525，且體胚為次生幼胚，而本研究的參試無(wú)性系品種為云研73-477，體胚為花藥初生幼胚。同時(shí)，數(shù)據(jù)還表明，除魚(yú)雷胚外，5種外源激素影響體胚成熟率、正常成熟體胚及體胚植株獲得率的主次順序雖有差異，但均表現(xiàn)為GA₃的影響最大，這表明GA₃是影響云研73-477花藥初生體細(xì)胞幼胚正常發(fā)育成熟的關(guān)鍵外源激素。

諸多研究表明^{[9， 17-20]}，外源激素、碳源、PEG、培養(yǎng)方式等均對(duì)植物體胚成熟發(fā)育和正常萌發(fā)有影響。本研究?jī)H探討了外源激素對(duì)云研73-477花藥初生體胚成熟培養(yǎng)的影響情況，其他因子對(duì)該無(wú)性系品種花藥初生體胚的正常發(fā)育成熟是否有影響，影響效果又如何，還不得而知，為了實(shí)現(xiàn)該無(wú)性系品種體胚植株產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，開(kāi)展其他因子對(duì)體胚成熟培養(yǎng)的影響效應(yīng)很有必要。

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