水稻早期響應(yīng)稻瘟菌侵染的激素變化及基因表達(dá)分析

中圖分類號： 5435.111.4⁺1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）11-0105-06

稻瘟病是影響我國水稻生產(chǎn)的重要真菌病害之一，據(jù)統(tǒng)計，每年我國由于稻瘟病菌侵染造成的水稻產(chǎn)量損失可達(dá)50萬t以上[]。當(dāng)前，化學(xué)農(nóng)藥的使用對環(huán)境造成了污染，對動植物的生存造成了潛在威脅。因此，選育和種植抗病品種是防治病害的最經(jīng)濟(jì)有效的措施之一。利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得的Pi21和Bsr-d1功能缺失水稻突變體，增強了對稻瘟病菌的抗性[2]。通過篩選在沙融山羊草（Aegilopssharonensis）和高大山羊草（Aegilopslongissima）中鑒定的 Yr87/Lr85 能夠同時提高小麥對葉銹病和條銹病的抗性[3]。當(dāng)前，已鑒定出大量R基因用于作物抗病，包括 Xa2I，Xa23，Pia，Pik 等[4-7]。大量的相關(guān)研究集中在水稻抗產(chǎn)平衡上。例如，Qiu等通過大量篩選鑒定到一個延緩衰老的激活突變體 desI-D ，其在籽粒成熟后期葉片明顯持綠，不僅增加了單株產(chǎn)量，同時也對稻瘟病和白葉枯病的抗性明顯增強[8]。在水稻中鑒定的理想株型基因 1（IPAI） ，在稻瘟病菌侵染時，會被磷酸化，與病原體防御基因WRKY45的啟動子結(jié)合，激活其表達(dá)，從而增強抗病性；但在感染后 ^48h 內(nèi)， IPAI 會恢復(fù)到非磷酸化狀態(tài)，恢復(fù)支持高產(chǎn)所需的生長[

激素在植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。植物激素在植物組織中充當(dāng)信使傳遞信息并協(xié)調(diào)整個生物體的反應(yīng)[10]。尤其是在植物免疫方面，植物激素是植物免疫力的中央調(diào)節(jié)因子[1]。研究最多的2種防御激素是茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）。PTI和ETI免疫是植物中的2道關(guān)鍵防御途徑，已有研究表明PTI和ETI都可以提高水楊酸的生物合成，進(jìn)而介導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）[12]。OsWRKYI3通過該介導(dǎo)水楊酸和茉莉酸通路及下游基因的表達(dá)賦予水稻對稻瘟病菌和白葉枯菌的抗病性[13]。除這2種激素外，其余激素也在植物免疫中發(fā)揮作用。例如，外源IAA處理可增加獼猴桃超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等的活性，進(jìn)而抑制灰霉病的侵染[14]；在小麥中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TaASR2L、TaSR30可以促進(jìn)ABA積累和抗性相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強小麥對Pst的抗性，外施ABA能增強小麥對條銹菌的抗性[15]

激素在植物的生長和發(fā)育中發(fā)揮重要的作用，因此，探究水稻早期響應(yīng)稻瘟病菌侵染的激素變化，對于挖掘抗產(chǎn)平衡相關(guān)基因具有重要意義。在本研究中，通過對稻瘟病菌侵染水稻早期的不同激素含量進(jìn)行分析，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對激素的生物合成通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行挖掘，為激素在植物病原菌早期互作研究提供參考，為水稻抗病育種提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 水稻的種植和培養(yǎng)

本研究所選取的水稻品種為C039，在2023年5月3日種植于江蘇徐州生物技術(shù)學(xué)院人工氣候溫室中，使用正常的稻田泥土放置于溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光一暗周期為 ，溫度為 28^°C 。選用的稻瘟病菌菌株為Guy11，培養(yǎng)條件： 28°C 避光條件下，使用燕麥番茄（OTA）培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2激素含量分析

使用代謝組方法對樣品中的激素含量進(jìn)行分析。代謝組樣品分別為稻瘟病菌侵染水稻27、 ^72h 的水稻葉片。稻瘟病菌接種方法參考Bi等的研究方法[16]。首先將培養(yǎng)7d左右的稻瘟病菌進(jìn)行孢子收集，在平板中加入 1mL 的無菌水，使用移液器吹打，將孢子從菌絲中釋放出來。使用2層擦鏡紙進(jìn)行過濾，隨即得到稻瘟病菌的孢子懸浮液，將稻瘟病菌的孢子懸浮液濃度調(diào)至 1×10⁵CFU/mL ，使用噴霧器將孢子液均勻噴灑至生長3周齡的水稻幼苗的葉片上。分別在接種27、72h時收集水稻葉片，將葉片置于液氮中保存，代謝組委托武漢邁維代謝生物科技股份有限公司進(jìn)行測定及激素含量分析。

1.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析

下載稻瘟病菌侵染水稻0、18、27、36、45、72h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，項目編號為PRJNA179498。首先使用eggNOG - Mapper[17]（http：//eggnog - mapper.embl.de/）數(shù)據(jù)庫對水稻全基因組蛋白質(zhì)進(jìn)行功能預(yù)測，使用KEGG對水稻基因組的功能進(jìn)行注釋[18]，通過 map04075 和 map01070 對水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的激素相關(guān)基因進(jìn)行篩選。

1.4MapMan激素通路分析

將水稻的蛋白質(zhì)序列文件提交到Mercator[19]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能預(yù)測。隨后將水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提交到MapMan[20]進(jìn)行功能分析并進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的激素含量分析為了分析水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染早期的激素水平變化，使用代謝組檢測了稻瘟病菌侵染水稻27、72h 的激素水平變化，包括生長素（auxin，IAA）、赤霉素（gibberellin，GA）、水楊酸（salicylicacid，SA）脫落酸（abscisicacid，ABA）、茉莉酸（jasmonicacid，JA）和茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）（圖1）。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水楊酸、脫落酸、茉莉酸和茉莉酸甲酯在稻瘟病菌侵染水稻后含量增加，其中水楊酸含量在 ^27，72h 的相對含量約為 2.1×10⁷ 、2.3×10⁷ ，分別約為野生型的1.4、1.5倍，對照組的相對含量僅為 1.5×10⁷ 。茉莉酸和茉莉酸甲酯在稻瘟菌侵染后含量顯著上升，在 27h 時，茉莉酸、茉莉酸甲酯相對含量分別約為對照組的1.6、4.9倍，^72h 時分別約為對照組的4.9、9.4倍。生長素和赤霉素僅在接種 72h 時大量積累，相對含量分別約為對照組的2.4、1.8倍。

2.2水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的激素相關(guān)基因鑒定

利用轉(zhuǎn)錄組對水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的激素相關(guān)基因進(jìn)行分析。利用MapMan對生物響應(yīng)途徑進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，SA、IAA和ABA等激素在生物響應(yīng)通路中被注釋（圖2）。隨后利用KEGG數(shù)據(jù)庫對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的激素生物合成和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因進(jìn)行篩選?？偣茶b定到49個激素生物合成和39個激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，其中生物合成通路中JA相關(guān)基因數(shù)量最多，為12個，約占總數(shù)的24.49% ，其次是IAA數(shù)量為8個，約占總數(shù)的16.33% ；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，乙烯和油菜素內(nèi)酯的基因數(shù)量較多，均為7個，約占總數(shù)的 17.95% （圖3-A、圖3-B）。對水稻響應(yīng)稻瘟病菌的激素相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，結(jié)果（圖3-C、圖3-D）發(fā)現(xiàn)，在水稻受到稻瘟病菌侵染后，激素生物合成基因相較于對照組表達(dá)量顯著增加，約有38個激素生物合成和17個激素信號響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)表達(dá)，激素生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上調(diào)相關(guān)基因主要集中在侵染 18、27、72h 。其中，水楊酸在侵染^18h 時相關(guān)基因表達(dá)量增加，而茉莉酸整個侵染過程表達(dá)量均持續(xù)上升，尤其是在侵染 ^72h ω_s02gO2I8700 編碼的丙二烯氧化物合酶（AOS）基因約為對照組的193倍。該結(jié)果表明，激素在水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染早期發(fā)揮重要作用，其中水楊酸在早期響應(yīng)較早。

2.3茉莉酸和生長素生物合成基因鑒定

通過植物激素含量分析和轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，JA和IAA在水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染中顯著積累。對JA和IAA的生物合成通路基因進(jìn)行詳細(xì)分析鑒定發(fā)現(xiàn)，參與JA合成的1個脂氧化酶（LOX）基因（Os03t0179900）2個丙二烯氧化物合酶（A0S）基因（ OsO3gO225900 和 ?s?2g02I8700） 、1個丙二烯氧化物環(huán)化酶（A0C）基因（Os03g0438100）、2個12-氧代植物二烯酸還原酶（OPR）基因（Os06g0215900和 ω_s02g0559400 和3個乙酰輔酶A氧化酶基因（Os06g0354500、0s06g0103500 和 0s11g0605500）在稻瘟病菌侵染后表達(dá)量上升（圖4-A）。同時鑒定到4個 AUX 基因（Os01g0856500、Os03g0244600、Osl0g0147400和Os11g0169200）、2個YUC基因（ OsOIgO273800 和Os01g0770200）、1個CYP79B2基因（ OsO9gO440300 ）和1個NIT1基因（Os02g0635000）在稻瘟病菌侵染后表達(dá)量增加（圖4-B）。該結(jié)果表明，茉莉酸和生長素在水稻受到稻瘟病菌侵染后均被誘導(dǎo)，相關(guān)生物合成基因表達(dá)量持續(xù)增加。

2.4茉莉酸和生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因鑒定

對水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的茉莉酸和生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行分析（圖5-A、圖5-B），在水稻的茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中鑒定到1個F-box蛋白COI1（Os01g0853400）、1個JAZ（Os03g0180800）和1個MYC2（Os10g0575000）在受到稻瘟病菌侵染后表達(dá)量增加（圖5-A）。在水稻的生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中鑒定到1個AUX1基因（Os01g0856500）、1個TIR1基因（Os05g0150500）、1 個 AUX/IAA（Os01g0178500）、1個ARF（ OsOIgO236300 ）1個GH3（Os01g0221100）和1個SAUR（Os01g0924966）基因在受到稻瘟病菌侵染后表達(dá)量增加（圖5-B）。該結(jié)果表明，水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染后茉莉酸和生長素信號途徑被激活。

3討論與結(jié)論

植物內(nèi)源激素的動態(tài)變化在植物與病原體的相互作用中起著重要作用?？共〖に胤肿铀畻钏岷蛙岳蛩嵋言谥参锟共№憫?yīng)中被廣泛研究。水楊酸

在抗真菌、細(xì)菌、卵菌和病毒中均有被報到[21-24] 。本研究分析水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染的激素動態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，在稻瘟病菌侵染后，水楊酸、茉莉酸和生長素相關(guān)基因表達(dá)被誘導(dǎo)，其中茉莉酸和生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因在早期也上調(diào)表達(dá)。Fan等在不同品種的柿子上接種炭疽菌后，枝條中的水楊酸含量顯著增加，發(fā)現(xiàn)水楊酸在抗病品種的早期反應(yīng)中起作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸和生長素在稻瘟病菌侵染初期基因表達(dá)水平相較于未接種時也顯著增加。茉莉酸合成途徑中的脂氧化酶（LOX）、丙二烯氧化物合酶（AOS）、丙二烯氧化物環(huán)化酶（AOC）、12-氧代植物二烯酸還原酶（OPR）和乙酰輔酶A氧化酶基因在稻瘟病菌侵染后表達(dá)量上升，生長素生物合成途徑主要以吲哚乙酰胺途徑和吲哚乙醛肟途徑為主。Hao等在黃花胡椒抗辣椒疫霉菌的研究中，利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組均在早期檢測出茉莉酸合成途徑被誘導(dǎo)[26]。同時茉莉酸也被報道在水稻抗條紋病毒的早期響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)感染了水稻條紋病毒（RSV）的水稻中茉莉酸的含量大約是對照組的30倍，轉(zhuǎn)錄組測序也發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因在JA反應(yīng)的生物學(xué)過程中富集[27]

同時，本研究也發(fā)現(xiàn)生長素含量在水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染過程中被激活。生長素被報道廣泛參與組織分化、器官發(fā)生、形態(tài)建成、向性反應(yīng)和頂端優(yōu)勢等生理過程[28]。同時，生長素在植物響應(yīng)非生物脅迫和生物脅迫中的功能也被發(fā)現(xiàn)。在棉花中，敲除生長素GhGH3-5會降低超氧化物歧化酶含量，并降低棉花對干旱和鹽脅迫的耐受性[29]。在水稻中，過表達(dá)OsIAA6 基因可提高耐旱性[30]。同時，生長素也被報道在植物免疫中發(fā)揮重要作用。但生長素在植物免疫中功能較為復(fù)雜，既與抗病有關(guān)，又能促進(jìn)病原菌侵染。例如，在玉米和玉米黑粉菌（Ustilagomaydis）的研究中發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)蛋白Nkd1可與生長素信號的轉(zhuǎn)錄共抑制因子TPL/TPRs結(jié)合并阻止其招募植物的轉(zhuǎn)錄抑制因子，從而釋放生長素信號，加劇病原菌對植物的感染[31]。但在蘋果與蘋果炭疽葉枯病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)生長素/吲哚-3-乙酸基因MdIAA24能提高蘋果抗炭疽葉枯病能力。在水稻與矮縮病毒（ricedwarfvirus，簡稱RDV）的互作中也發(fā)現(xiàn)，水稻在感染RDV時積累了更多的生長素，外源生長素處理提高了水稻對RDV感染的耐受性。外源生長素處理降低了OsIAA10蛋白水平，從而釋放出一組與OsIAA10相互作用的OsARF，介導(dǎo)下游的抗病毒反應(yīng)[32]。本研究發(fā)現(xiàn)生長素和茉莉酸基因在稻瘟病菌侵染時含量和相關(guān)基因均增加，分析生長素可能在水稻早期響應(yīng)稻瘟病菌侵染過程中發(fā)揮積極作用。

本研究通過激素含量分析和相關(guān)基因表達(dá)鑒定發(fā)現(xiàn)，在水稻響應(yīng)稻瘟病菌侵染早期，茉莉酸、生長素和水楊酸等均呈誘導(dǎo)表達(dá)的特征。激素間的相互串?dāng)_共同調(diào)控了水稻的早期響應(yīng)，但具體的分子機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。本研究對激素在水稻早期響應(yīng)稻瘟病菌中的動態(tài)變化進(jìn)行了分析，為改良水稻抗病性提供了理論依據(jù)。

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