雪茄煙葉發(fā)酵過程中化學成分與酶的變化及相關(guān)性分析

中圖分類號： TS44⁺4 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2025）11-0172-07

在發(fā)酵過程中，雪茄煙葉的香氣風格、化學成分發(fā)生了顯著轉(zhuǎn)變，眾多大分子物質(zhì)通過一系列的生化反應(yīng)經(jīng)過降解或轉(zhuǎn)化生成香氣物質(zhì)，從而提升雪茄煙葉的品質(zhì)。如含氮化合物，在未處理時可能會產(chǎn)生令人不愉悅的氨臭，但在發(fā)酵過程中逐漸分解，轉(zhuǎn)化為有機酸和氨氣，這一變化有助于改善煙葉的整體風味；糖類、醇類與多酚類化合物之間的相互作用能夠形成糖苷，它在水解過程中為雪茄煙葉釋放了多元的香氣層次；同時，還原糖與游離氨基酸之間的美拉德反應(yīng)還會賦予煙草獨特的沉香氣息，該過程對于形成雪茄煙葉特有的風味特性至關(guān)重要。Frankenburg等認為，在雪茄煙葉醇化過程中，其化學物質(zhì)發(fā)生了一系列生物化學反應(yīng)，可見雪茄煙葉的發(fā)酵過程實際上是一個生物化學反應(yīng)過程，涉及底物與微生物和酶的相互作用[1-2]。目前，雪茄發(fā)酵機理有3個作用假設(shè)，即氧化作用、微生物作用和酶作用[3-4]。雪茄煙葉在發(fā)酵過程中的酶作為生物催化劑起到了重要作用，它促使雪茄煙中的化學成分發(fā)生變化，并產(chǎn)生特殊的香味和口感，其中蛋白酶和淀粉酶可以催化糖類、蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)發(fā)生變化。在雪茄煙葉醇化過程中，這些酶催化原煙中的物質(zhì)發(fā)生了一系列的生物化學變化，如多酚氧化酶催化多酚的氧化反應(yīng)，減少多酚含量，進而影響雪茄煙葉的品質(zhì)。此外，還有研究表明，多酚氧化酶和過氧化物酶可以催化有機酸和多元酸的代謝反應(yīng)[5-7]。前人關(guān)于化學成分與酶活性的研究主要集中在外源酶制劑對雪茄煙葉化學成分的影響上，而關(guān)于雪茄煙葉發(fā)酵過程中內(nèi)源酶對化學成分變化影響的研究較少見。因此，本研究通過探究發(fā)酵過程中雪茄煙葉的化學成分和酶活性的變化規(guī)律，對二者之間進行相關(guān)性分析，探討煙葉中的化學成分含量對酶活性變化的響應(yīng)，并指出雪茄煙葉適宜的發(fā)酵溫度，以期為進一步完善雪茄煙葉的發(fā)酵工藝提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于湖南省郴州市，供試品種為QX208，供試材料為茄芯中部煙葉，試驗于2022年在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所質(zhì)量安全中心開展。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗條件本試驗采用人工發(fā)酵方式，發(fā)酵開始前將雪茄煙葉放置于恒溫恒濕箱中進行回潮，煙葉含水率穩(wěn)定在 20% 后開始發(fā)酵，發(fā)酵時將恒溫恒濕箱濕度設(shè)置為 70% ，初始溫度為 32^°C ，在此溫度下直接進行取樣并升溫 2°C ，隨后依次升溫 29C 10d ，每升溫1次為1個階段，分別為FA（ 未發(fā)酵）、FB（ 34°C ，10d）、FC（ 36°C ，10d）、FD（ 38^°C ，10d）、F E（40^°C，10d ）、 FF（42°C，10d） ！FG（44^°C，10d） ） ，F(xiàn)H（46^°C，10d） 人 FI（48^°C，10d） 共9個階段，共發(fā)酵 80d 。

升溫的同時進行取樣，每次在發(fā)酵袋的中間位置隨機取出3把并分別抽取若干張煙葉，去除主脈后分別保留稱葉片樣品 200g ，用于3次生物學重復。取 100g 樣品烘干粉碎后過60目篩，放于密封袋用于化學成分含量的測定。取 100g 樣品于密封袋并放置于 4‰ 冰箱保存，用于酶活性的測定。

1.2.2常規(guī)化學成分測定總糖、還原糖、總植物 堿、氯、鉀、淀粉、總氮、蛋白質(zhì)、多元酸、色素、多酚 等常規(guī)化學成分含量的測定，參考的標準是YC/T 159—2019《煙草及煙草制品水溶性糖的測定》、 YC/T468—2021《煙草及煙草制品總植物堿的測 定》、YC/T162—2011《煙草和煙草制品 氯的測 定》、YC/T217—2007《煙草和煙草制品 鉀的測 定》、YC/T216—2007《煙草和煙草制品 淀粉的測 定》、YC/T166—2003《煙草和煙草制品總蛋白質(zhì) 含量的測定》、YC/T288—2009《煙草及煙草制品 多元酸的測定》、YC/T382—2010《煙草及煙草制品

質(zhì)體色素的測定》、YC/T202—2006《煙草及煙草 制品多 多酚類化合物的測定》[8-9]。 。

采用HPLC-MS/MS測定雪茄煙葉中的氨基酸含量。稱取 0.1g 煙末樣品，加入提取液 50% 乙腈水 10mL ，渦旋 30min ，離心 10min ，過 0.22μm 濾膜。柱子：生物殼聚糖BioZenglycan 2.6μm× 100mm×2.1mm 柱子；流動相：A為 2mmol/L 甲酸銨 95% 乙腈水，B為 2mmol/L 甲酸銨 ，3% 甲酸水；標準儲備溶液的制備：稱取 10.00g 氨基酸標準品于 100mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.10g/mL 的混合標準儲備溶液；定容超聲處理10min 后置于 4^°C 冰箱中存放。標準工作溶液的制備：取 0.10g/mL 標準儲備液添加適量流動相稀釋成一系列質(zhì)量濃度 4.00μg/mL ）的標準工作溶液。

采用HPLC-MS/MS測定雪茄煙葉中糖醇的含量。稱取 0.1g 煙末樣品，加入提取液 50% 乙腈水10mL ，渦旋 30min ，離心 10min ，過 0.22μm 濾膜。柱子：ACQUITY 超高效液相色譜 BEH色譜柱 C₁₈ 1.7μm×2 ： 1mm×100mm 柱子；流動相：A為0.2% 三乙胺乙腈，B為 0.2% 三乙胺水；標準儲備溶液的制備及標準工作溶液的制備同氨基酸。

采用GC－MS測定雪茄煙葉中揮發(fā)性有機酸含量。稱取 1.0000g 樣品于 30mL 玻璃管中，準確加入 15mL 丙酮溶液，加人 150μL 內(nèi)標萃取溶液，置于振蕩器上 1000r/min 條件下 30min ，靜置后取上清液過 0.45μm 有機相濾膜待測。

1.2.3酶活性的測定煙葉樣品中蛋白酶、淀粉酶、多酚氧化酶和過氧化物酶活性的測定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司酶試劑盒（酸性蛋白酶ACPT-2-W，中性蛋白酶NPT-2-W，堿性蛋白酶ALPT-2-W， α- 淀粉酶DFMA-2-Y，γ-淀粉酶 THM-2-G，β- 淀粉酶DFMB-2-Y，多酚氧化酶PPO-2-Y，過氧化物酶POD-2-Y），酶活性的測定依據(jù)試劑盒中的說明書進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)用SPSS27軟件處理，用 0rigin 2019 軟件作圖，試驗結(jié)果以“平均值 ± 標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1不同發(fā)酵階段雪茄煙葉化學成分分析2.1.1不同發(fā)酵階段雪茄煙葉常規(guī)化學成分由圖1可知，與FA相比，經(jīng)過一段時間的發(fā)酵，總糖、還原糖、淀粉含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。其中，總糖含量在FF發(fā)酵階段達到最大值，為2.0mg/g ;還原糖含量在FF發(fā)酵階段達到最大值，為 1.5mg/g ;淀粉含量在FG發(fā)酵階段達到最大值，為 2.7mg/g 。鉀、總氮、蛋白質(zhì)含量變化不顯著。氮和總植物堿含量變化較波動，無明顯規(guī)律。鉀氯比、糖堿比、糖氮比、氮堿比一直作為評判煙葉品質(zhì)的重要指標。鉀氯比整體上升，最大值出現(xiàn)在FH發(fā)酵階段，最小值出現(xiàn)在FE發(fā)酵階段;糖堿比和糖氮比總體呈先增加后下降的趨勢，各個發(fā)酵階段氮堿比差異不顯著（圖2）。

2.1.2不同發(fā)酵階段雪茄煙葉的多酚由圖3可知，隨著雪茄煙葉發(fā)酵溫度的升高，綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸含量逐漸升高再逐漸降低，變化的“拐點\"出現(xiàn)在FF階段;蕓香苷、茛蓉亭含量在FB發(fā)酵階段后逐漸降低，除FA、FB階段含量最高外，F(xiàn)F階段含量次之。

2.1.3不同發(fā)酵階段雪茄煙葉的揮發(fā)性有機酸由圖4可知，雪茄煙葉發(fā)酵中，發(fā)酵過程中揮發(fā)性有機酸總量增加，在FH發(fā)酵階段含量最高。其中含量最高的揮發(fā)性有機酸是3-甲基戊酸、甲酸、乙酸和異戊酸。3-甲基戊酸、乙酸和異戊酸含量在FH發(fā)酵階段含量達到最大值，分別為 350，57，40mg/g ：甲酸含量變化不顯著。

2.1.4不同發(fā)酵階段雪茄煙葉的多元酸由圖5可知，在雪茄煙葉發(fā)酵中，多元酸總量總體降低，除丁二酸及亞麻酸外，在FF發(fā)酵階段含量均有顯著性降低。含量最高的多元酸是草酸、檸檬酸、蘋果酸和丙二酸。檸檬酸含量在FB發(fā)酵階段后變化不顯著，草酸和蘋果酸含量變化較波動，無明顯規(guī)律。

2.1.5不同發(fā)酵階段雪茄煙葉的氨基酸及糖醇由圖6可知，隨著發(fā)酵的進行，氨基酸總量總體呈現(xiàn)先增后降的趨勢，在FH發(fā)酵階段含量最高，其中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸含量最高。由圖7可知，隨著發(fā)酵的進行，糖醇含量總體呈上升趨勢，其中丙三醇、果糖、葡萄糖、甘露糖和肌醇的含量最高。丙三醇含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，F(xiàn)H發(fā)酵階段含量最高；甘露糖和果糖含量變化不顯著，F(xiàn)G發(fā)酵階段含量最高；葡萄糖和肌醇含量在FF發(fā)酵階段最高。

2.1.6不同發(fā)酵階段雪茄煙葉的色素由圖8可知，在發(fā)酵過程中，色素含量整體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，葉黃素含量的提高較明顯，其次為 β- 胡蘿卜素。隨著發(fā)酵的進行，雪茄煙葉中葉綠素a和葉綠素b含量都呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；葉黃素和β -胡蘿卜素含量變化趨勢相似，在發(fā)酵前期呈逐漸下降的趨勢，在FG發(fā)酵階段上升。

2.2不同發(fā)酵階段雪茄煙葉的酶活性

由圖9可知，雪茄煙葉發(fā)酵過程中，酶活性較高的為過氧化物酶、多酚氧化酶和 β- 淀粉酶，而酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶活性較低。酸性蛋白酶活性在FB至FI階段呈降低-增加-降低趨勢，F(xiàn)G階段活性最高。堿性蛋白酶活性先增后降，F(xiàn)E階段活性最高。中性蛋白酶活性波動較大，F(xiàn)G階段有上升。α-淀粉酶活性變化不明顯，γ-淀粉酶和 β- 淀粉酶活性先升后降，其中FC和FD階段酶活性較高。過氧化物酶和多酚氧化酶活性整體呈降低趨勢，但在FD和FF階段有所上升。氧化酶活性整體呈現(xiàn)降低趨勢，只有在FF階段輕微增加。

2.3發(fā)酵過程中雪茄煙葉酶活性與化學成分含量相關(guān)性分析

由表1可知，揮發(fā)性有機酸、多元酸和色素物質(zhì)與多酚氧化酶和過氧化物酶存在顯著相關(guān)性，多酚氧化酶和過氧化物酶與葉綠素a存在極顯著正相關(guān)，多酚氧化酶與甲酸、蘋果酸之間存在顯著負相關(guān)，與丙二酸、檸檬酸、草酸之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系；過氧化物酶與異戊酸、蘋果酸、乙酸、3-甲基戊酸之間存在顯著負相關(guān)。氨基酸與 γ- 淀粉酶與中性蛋白酶存在顯著相關(guān)性。γ-淀粉酶與常規(guī)化學成分的鉀和淀粉之間存在顯著負相關(guān)。

3討論

相關(guān)性分析結(jié)果表明，酶活性與氨基酸、多元酸及揮發(fā)性有機酸類指標存在重要相關(guān)性，可能是因為雪茄煙葉中的酶與氨基酸、多元酸及有機酸指標之間存在復雜的生物化學代謝關(guān)系。在 44^°C 發(fā)酵60d氨基酸含量呈先上升后降低趨勢，這可能是因為高溫高濕條件下提高了相關(guān)微生物和酶的活性，導致其與糖醇類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生香氣。另外，過氧化物酶與核糖呈極顯著正相關(guān)，并在此階段呈顯著性升高，另一種可能是在發(fā)酵過程中煙葉中蛋白質(zhì)含量下降而氨基酸含量增加較明顯[10] O

非揮發(fā)性有機酸總量整體呈現(xiàn)出降低的趨勢，這與宋鵬飛等的研究結(jié)果相似[1]，可能是因為持續(xù)高溫條件下煙葉呼吸消耗作用過強，相關(guān)次生代謝強度相應(yīng)較高，因而積累的有機酸含量較多，反之，含量較低[12]。相關(guān)性分析結(jié)果表明，揮發(fā)性有機酸物質(zhì)主要與過氧化物酶及多酚氧化酶具有顯著負相關(guān)關(guān)系，原因可能是這些物質(zhì)能夠抑制酶的活性或降低其表達水平。如它們可能通過競爭性抑制的方式發(fā)揮作用：第一，競爭性地占據(jù)酶的活性位點，從而阻止底物與酶結(jié)合，降低酶的催化活性。第二，與酶的非活性位點結(jié)合，改變酶的構(gòu)象或穩(wěn)定性，從而降低酶的催化活性。第三，它們還可能作為底物或產(chǎn)物參與酶催化反應(yīng)的代謝途徑，當其濃度達到一定水平時，通過負反饋機制抑制酶的產(chǎn)生或活性，以維持代謝平衡[13-15] 。

本研究結(jié)果表明，發(fā)酵后期溫度升高，蘋果酸含量較高，表明高溫條件下有利于蘋果酸的積累，但發(fā)酵時間過長，蘋果酸可能會過多的向延胡索酸轉(zhuǎn)化，進而降低含量。在變溫發(fā)酵處理后，檸檬酸含量下降后趨于平穩(wěn)，表明高溫對檸檬酸的影響較小。草酸在整個發(fā)酵后期過程中含量降低，與杜佳等的研究結(jié)果一致[16]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)多元酸與多酚氧化酶和 γ- 淀粉酶主要存在顯著正相關(guān)關(guān)系，原因可能是這些物質(zhì)能夠促進酶的活性或增加其表達水平。具體而言，第一，它們可以激活轉(zhuǎn)錄因子，如核因子-KB（NF-KB）和Nrf2，來促進基因表達。第二，通過抗氧化作用，它們可以減少細胞內(nèi)氧化應(yīng)激，從而保護酶的活性。第三，它們還可以促進細胞信號傳導激活通路，如MAPK和PI3K/Akt通路，來增強酶的活性[17-18] 。

4結(jié)論

為了探究雪茄煙葉在發(fā)酵過程中化學成分與酶活性變化之間的相關(guān)性，通過不同發(fā)酵階段對雪茄煙葉中的化學成分及酶活性進行測定，探究其相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明，在本試驗條件下，雪茄煙葉在42°C 發(fā)酵50d和在 44^°C 發(fā)酵60d發(fā)酵階段化學成分含量及酶活性變化較顯著。通過對酶活性和化學物質(zhì)含量進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，蛋白酶、淀粉酶、多酚氧化酶和過氧化物酶的活性與氨基酸、多元酸和揮發(fā)性有機酸含量存在顯著的相關(guān)關(guān)系。

參考文獻：

[1]FrankenburgWG.Chemical changes in theharvested tobacco leaf.

II. Chemical and enzymic conversions during fermentation and aging[J].Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry，1950，10：325 - 441.

[2]Rizzato G，Scalabrin E，Radaeli M，et al.A new explorationoflicorice metabolome[J]. Food Chemistry，2017，221：959-968.

[3]賈云，胡婉蓉，呂晉雄，等.雪茄煙葉發(fā)酵過程中微生物群落及功能微生物分析[J].輕工學報，2023，38（1）：71-78，89.

[4]喬保明，田煜利，劉學兵，等．發(fā)酵溫度對雪茄煙茄芯煙葉質(zhì)量影響分析[J]．中國科技信息，2018（8）：39-40.

[5]張倩穎，羅誠，李東亮，等.雪茄煙葉調(diào)制及發(fā)酵技術(shù)研究進展[J]．中國煙草學報，2020，26（4）：1-6.

[6]王瑞新.煙草化學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：60-65.

［7]黎旺姐.不同生長溫度和施氮量對煙草葉片中游離氨基酸含量及其代謝的效應(yīng)［D]．昆明：云南師范大學，2016：7－10.

[8]杜詠梅，郭承芳，張懷寶，等.水溶性糖、煙堿、總氮含量與烤煙吃味品質(zhì)的關(guān)系研究[J]．中國煙草科學，2000，21（1）：7-10.

[9]常愛霞，杜詠梅，付秋娟，等．烤煙主要化學成分與感官質(zhì)量的相關(guān)性分析[J]．中國煙草科學，2009，30（6）：9－12.

[10]劉琳琳，蘆柯，胡延奇，等．工業(yè)發(fā)酵雪茄煙葉霉變微生物的分離鑒定及生物學特性研究[J]．中國煙草科學，2023，44（6）：100 -105.

[11]宋鵬飛，王蘿萍，錢穎穎，等．不同產(chǎn)地、品種、倉儲地點烤煙片煙陳化中化學成分的變化[J]．西南農(nóng)業(yè)學報，2018，31（3）：488-493.

[12]柳文鳳，涂云，權(quán)佳峰，等.烤煙成熟期不同溫度對煙葉有機酸積累傾向的影響[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2018，46（7）：30-33.

[13]Surh YJ，ChunKS，Cha HH，etal.Molecular mechanismsunderlying chemopreventiveactivitiesof anti-inflammatoryphytochemicals：down -regulation of COX -2 and iNOS throughsuppression of NF-KB activation[J]. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，2OO1，480：243-268.

[14]Das L，Vinayak M. Long term effect of curcumin in restoration oftumour suppressor p53 and phase -II antioxidant enzymesviaactivation of Nrf2 signalling and modulationofinflammation inprevention of cancer[J].PLoSOne，2015，10（4）：e0124000.

[15]Wu X，Hu YQ，Wang Q，et al.Study on the correlation between thedominantmicroflora and themain flavor substances inthefermentationprocess ofcigar tobacco leaves[J].FrontiersinMicrobiology，2023，14：1267447.

[16]杜佳，徐世杰，徐麗芬，等．海南茄衣人工發(fā)酵過程中非揮發(fā)性有機酸的變化[J]．西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2017，45（6） ：83 -88.

[17]WangP，ChenZ G，Xu C S，etal.Effects of enzymatic browningand leaf browning inhibitorson tobacco[J].Journal of BiobasedMaterials and Bioenergy，2021，15（6）：766-773.

[18]WangHY，ZhaoMM，YangB，etal.Identification of polyphenolsin tobacco leaf and their antioxidant and antimicrobial activities[J].Food Chemistry，2008，107（4） ：1399-1406.