榿葉唐棣火疫病的發(fā)生與鑒定

摘要

2023年6月，在新疆伊犁地區(qū)新源縣改良場果園種植的榿葉唐棣Amelanchier alnifolia，觀察到疑似感染梨火疫病的癥狀。采集疑似病組織進(jìn)行室內(nèi)分離、純化，對分離菌株進(jìn)行形態(tài)特征鑒定、致病性測定、煙草過敏性反應(yīng)以及特異性引物PCR擴(kuò)增及序列分析。結(jié)果表明，分離菌株的菌落形態(tài)特征與梨火疫病菌Erwinia amylovora一致，室內(nèi)榿葉唐棣葉片針刺接種結(jié)果顯示，病菌沿葉片主葉脈向四周擴(kuò)散侵染，葉柄處有菌膿產(chǎn)生;煙草過敏性反應(yīng)明顯;系統(tǒng)發(fā)育分析顯示分離菌株與梨火疫病菌位于同一分支，支持率達(dá)99%。綜上可確定榿葉唐棣上分離到的菌株為梨火疫病菌。此為榿葉唐棣火疫病在中國的首次發(fā)生報道。

關(guān)鍵詞

中國新疆; 榿葉唐棣; 梨火疫病菌; PCR檢測

中圖分類號：

S 436.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024505

Occurrence and identification of fire blight on Amelanchier alnifolia

HAN Lili1， CHEN Weimin1*， WANG Jiehua2， LEI Rong3， WU Pinshan3*

（1. Yili Key Laboratory of Invasive Alien Pest Monitoring and Control， Yili Vocational and Technical College，

Yining 835000， China; 2. Institute of Agricultural Sciences， Yili Prefecture， Yining 835000， China;

3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100176， China）

Abstract

In June 2023， suspected symptoms of fire blight were observed on Amelanchier alnifolia planted in an orchard at the Gailiangchang Experimental Station in Xinyuan county， Yili prefecture， Xinjiang. Suspected diseased tissues were collected for laboratory isolation and purification. The isolates were identified based on colony morphology， pathogenicity tests， hypersensitive reaction on Nicotiana benthamiana， and PCR amplification using specific primers followed by sequence analysis. The results showed that the colony morphology of the isolates matched that of Erwinia amylovora， the causal agent of fire blight. Inoculation of A.alnifolia leaves by pinprick led to symptom development along the main leaf veins and bacterial ooze at the petiole. A clear hypersensitive response was observed in tobacco.

Phylogenetic analysis revealed that the isolated strains and E.amylovora clustered in the same clade with a bootstrap support of 99%. These findings confirm that the isolated strain from A.alnifolia is E.amylovora， and this represents the first report of fire blight on A.alnifolia in China.

Key words

Xinjiang， China; Amelanchier alnifolia; Erwinia amylovora; PCR identification

榿葉唐棣Amelanchier alnifolia （Nutt.） Nutt. ex M.Roem.原產(chǎn)地北美洲， 是一種落葉灌木或小喬木，果實(shí)為漿果，屬薔薇科唐棣屬，是北美洲內(nèi)陸的重要經(jīng)濟(jì)林樹種［1］。其果實(shí)為梨果狀漿果，風(fēng)味獨(dú)特，口感清香甜美，營養(yǎng)豐富，每100 g鮮果含鈣88 mg，其鈣含量居百果之首，故稱之為“高鈣植物”［2］，果實(shí)中還含有大量人體必需的總膳食纖維， 富含 18 種氨基酸，其含有的胡蘿卜素、原花青素、花色素苷、綠原酸等成分，具有抗氧化、降血脂、預(yù)防癌癥、降糖等保健作用［35］。近年來，隨著對榿葉唐棣果實(shí)中活性物質(zhì)組成、含量及功能性研究的逐步深入，榿葉唐棣的種植及果實(shí)深加工技術(shù)也得到了迅速發(fā)展［6］。 果實(shí)除鮮食外，也適合加工，主要用于釀酒、制作果醬、果醋等，也是高級食品、飲品、藥品、保健品的理想原料；嫩葉可用于制茶或提取天然色素［711］，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。 榿葉唐棣除具有食用價值外，也可作為園林綠化樹種栽培，其適應(yīng)性強(qiáng)，具有喜光、抗寒、耐旱的特點(diǎn)，大多數(shù)土壤類型如栗鈣土、黑鈣土、褐色土和棕壤等都適宜其生長［12］。且樹形飽滿，花量繁多，極具園林觀賞價值。我國最早的引種單位是中國科學(xué)院植物所，大量引種是在 20 世紀(jì) 90 年代， 并逐步開展區(qū)域性試驗(yàn)［13］。新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗(yàn)場于2015 年秋季從黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所引進(jìn)榿葉唐棣種苗在烏魯木齊種植［14］。榿葉唐棣的根系萌蘗能力強(qiáng)，側(cè)根十分發(fā)達(dá)，呈網(wǎng)狀分布于土壤上層，具有較強(qiáng)的水土保持功能，屬于水土保持高效樹種［10］，具有較高的推廣應(yīng)用及開發(fā)價值。

梨火疫病是由解淀粉歐文氏菌Erwinia amylovora引起，該病最初在美國東南部暴發(fā)，現(xiàn)已廣泛分布于60個國家和地區(qū)［15］。梨火疫病菌的寄主范圍廣泛［16］，主要有梨屬Pyrus、山楂屬Crataegus、蘋果屬M(fèi)alus、榅桲屬Cydonia、唐棣屬Amelanchier、栒子屬Cotoneaster等，其中已報道最易感病的是梨、蘋果、山楂、栒子、榅桲等屬的植物［17］。梨火疫病于2015年首次在新疆伊犁地區(qū)霍城縣蘋果上發(fā)生，到2020年在新疆發(fā)生為害的寄主有梨Pyrus spp.、蘋果Malus pumila、山楂Crataegus pinnatifida、海棠Malus spectabilis、榅桲Cydonia oblonga、杏Prunus armeniaca等 7種［1819］。截至2023年上半年，梨火疫病在我國新疆、甘肅的58個縣（市區(qū)）發(fā)生，其中在新疆的22個縣（市、區(qū)）已得到根除［20］。新疆唐棣屬植物上尚無火疫病發(fā)生的報道。

2023年6月，在新疆伊犁地區(qū)新源縣改良場果園種植的榿葉唐棣上觀察到葉片初呈水浸狀，后失綠、萎蔫、火燒狀向內(nèi)翻卷壞死的癥狀，疑似梨火疫病，為進(jìn)一步證實(shí)，對罹病榿葉唐棣做了病原菌鑒定和致病性測定研究。梨火疫病屬于重大檢疫性病害，具有傳播快、危害大的特點(diǎn)，一旦在榿葉唐棣上發(fā)生，可能會迅速擴(kuò)散，導(dǎo)致榿葉唐棣生長受阻甚至整株死亡。因此，及時發(fā)現(xiàn)并控制病害，對于保護(hù)榿葉唐棣的健康生長至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

在新疆伊犁地區(qū)新源縣改良場果園（43°25′N，83°33′E）種植的榿葉唐棣上，采集疑似發(fā)病癥狀的枝條、葉片組織帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于4℃冰箱。

陽性菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院胡白石教授提供，菌株編號為E.a YZ003，寄主為蘋果。

1.2 病菌分離

將染病榿葉唐棣莖組織（剪成0.5～1 cm的小段）、葉片組織（1 cm×1 cm左右的方塊）用75%乙醇表面消毒30 s，1%次氯酸鈉浸泡1 min，無菌水清洗3次，用滅菌吸水紙吸干水分。然后將染病莖葉組織放入碾缽，加入PBS緩沖液碾磨。接菌環(huán)蘸取碾磨液，在加 5%蔗糖的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA+5% 蔗糖）和選擇性培養(yǎng)基（Zeller培養(yǎng)基）上三級稀釋劃線分離。于光周期為L∥D=12 h∥12 h，28℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長情況。挑取乳白色、表面光滑且凸起、有光澤的單菌落劃線培養(yǎng)，純化3次后編號為ZGXJTD1、ZGXJTD2，用于后續(xù)試驗(yàn)。

NA+5% 蔗糖培養(yǎng)基配方：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蔗糖5 g，水1 000 mL，pH為7.3。

Zeller培養(yǎng)基配方：牛肉膏8 g，蔗糖50 g，放線菌酮50 mg，0.5%溴百里酚藍(lán)9 mL，0.5%中性紅2.5 mL，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH為7.4。

1.3 煙草過敏性反應(yīng)檢測

將菌株ZGXJTD1、ZGXJTD2于NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于光周期L∥D=12 h∥12 h，28℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h。挑取單菌落于NB液體培養(yǎng)基中，28℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，將OD600為0.4的菌液作為接種菌懸液。

使用一次性注射器，將菌液注射至本氏煙Nicotiana benthamiana葉肉中進(jìn)行接種，接種1～2 d后觀察有無白色壞死斑出現(xiàn)，以接種無菌水為對照［21］。

1.4 致病性測定

用75%乙醇消毒健康的榿葉唐棣葉片，試驗(yàn)共設(shè)2個不同菌株接種處理和1個無菌水處理作為對照，每處理5片葉，重復(fù)3次;采用針刺接種法，接種菌株ZGXJTD1、ZGXJTD2的濃度為107 cfu/mL。接種后的葉片放入墊有滅菌濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿上，28℃，光周期L∥D=12 h∥12 h人工氣候箱中培養(yǎng)。觀察記錄發(fā)病情況，并對發(fā)病葉片的病健組織交界處進(jìn)行病菌的再分離和鑒定。

1.5 特異性引物檢測及序列分析

提取菌株ZGXJTD1、ZGXJTD2 基因組DNA，用梨火疫病菌特異引物P29A/P29B檢測，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為900 bp［22］。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR mix 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、DNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL;PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán);72℃ 延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取陽性PCR產(chǎn)物送武漢天一華煜基因科技有限公司雙向測序，測定序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀

在田間，病原菌首先侵染榿葉唐棣的花序，造成花序萎蔫、褐色壞死，形成花腐;隨后再沿主葉脈侵染葉片，造成葉片變成灰黑色，邊緣向葉正面內(nèi)卷萎蔫枯死，形成葉枯（圖1a，b）。幼莖初呈淺褐色，繼續(xù)向下發(fā)展造成枝條黑褐色彎鉤狀（牧羊鞭狀），干枯死亡，稱為“枝枯”（圖1c，d）。幼果初侵染時，表面出現(xiàn)水漬狀病斑而后變黑紅褐色壞死，形成僵果，稱為“果腐”（圖1e）。

2.2 分離病菌菌落形態(tài)特征

分離病菌在NA+5%蔗糖的培養(yǎng)基上菌落呈乳白色至奶油色，圓形，邊緣整齊，隆起，有黏性，表面光滑，有光澤（圖2a）。在Zeller培養(yǎng)基上菌落呈橙紅色，圓形，高度隆起，有黏性，中心色深，有蛋黃狀中心環(huán)，邊緣整齊（圖2b）。顯微鏡下菌體為直桿短鏈狀，有莢膜，鞭毛多根周生，能運(yùn)動（圖2c）。

2.3 煙草過敏性反應(yīng)

本氏煙接種菌株ZGXJTD1、ZGXJTD2，3 d后，葉片上出現(xiàn)白色壞死斑，引起煙草過敏性反應(yīng)（圖3a），對照用無菌水接種，未出現(xiàn)壞死斑（圖3b）。

2.4 致病性測定結(jié)果

榿葉唐棣葉片接種菌株ZGXJTD1、ZGXJTD2，2 d后開始發(fā)病，病菌沿葉脈向四周擴(kuò)散侵染，葉柄有菌膿產(chǎn)生;對照未見發(fā)病。對葉片發(fā)病部位的病健交界處進(jìn)行病菌再分離，分離后得到的病菌菌落性狀與接種病菌的特征一致，分子鑒定結(jié)果也證實(shí)為同一種菌。

2.5 特異引物擴(kuò)增結(jié)果及序列分析

用特異引物對分離的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條與陽性對照大小一致的900 bp片段，陰性對照無擴(kuò)增（圖5），GenBank登錄號為CP050241.1，將測序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST。選擇相似性最高的菌株序列，采用MEGA軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）?？梢钥闯觯蛛x的菌株ZGXJTD1、ZGXJTD2與Erwinia amylovora （HF560644.1、HG793097.1、KJ457299.1、KJ457294.1、KJ457296.1、MK217352.1、CP056035.1）等7個模式菌株位于同一個分支上，支持率達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)特征與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，確定分離菌株ZGXJTD1、ZGXJTD2為梨火疫病菌Erwinia amylovora。

3 結(jié)論與討論

2023年6月，在榿葉唐棣采集疑似梨火疫病組織，經(jīng)田間癥狀、菌落特征、煙草過敏性反應(yīng)、致病性測定、特異性PCR檢測以及序列分析的結(jié)果，分離菌株ZGXJTD1、ZGXJTD2鑒定為梨火疫病菌Erwinia amylovora，這是中國首次發(fā)現(xiàn)梨火疫病在榿葉唐棣上自然發(fā)生。

自2015年6月梨火疫病首次在新疆伊犁霍城縣蘋果樹上發(fā)生，到2020年梨火疫病菌在新疆已為害的果樹寄主有梨、蘋果、山楂、杜梨、海棠、榅桲、杏7種，未發(fā)現(xiàn)為害其他寄主。梨火疫病傳播方式多，具有高度的傳染性和破壞性，能夠迅速在感病區(qū)域擴(kuò)散、傳播。在榿葉唐棣火疫病樣本采集地周邊，有零星種植的梨樹并有梨火疫病發(fā)生，這可能是導(dǎo)致榿葉唐棣火疫病發(fā)生的原因。

梨火疫病菌的遠(yuǎn)距離傳播方式主要依賴于果樹苗木運(yùn)輸和候鳥的遷徙，這兩種途徑使得病菌能夠在廣闊的地理范圍內(nèi)傳播。同一地區(qū)內(nèi)，蜜蜂、鳥類以及風(fēng)雨等自然因素也扮演著重要的傳播角色。這種病菌的自然擴(kuò)散能力相當(dāng)驚人，每年可以達(dá)到16 km的距離［2324］。而新疆野果林主要分布在伊犁和塔城地區(qū)，也稱西天山野果林，包括新源野果林、鞏留野果林和霍城野果林，是天山第三紀(jì)古溫帶闊葉林成分與北方森林草甸成分相結(jié)合的珍貴產(chǎn)物［2526］。野果林中木本植物資源共有121種隸屬于23科40屬，其中主要分布的科是薔薇科Rosaceae，有12個屬，分別是杏屬Armeniaca、稠李屬Padus、櫻桃屬Cerasus、山楂屬Crataegus、栒子屬Cotoneaster、李屬Prunus、懸鉤子屬Rubus、花楸屬Sorbus等［27］。除大面積成片分布的野蘋果、野杏外，還伴生著野生山楂、野生櫻桃李、野生歐洲李、野生稠李、天山花楸、天山櫻桃、繡線菊等薔薇科植物，以及沙棘、黑穗醋栗等野生小漿果林，因此，也是新疆天然的果樹種質(zhì)資源基因庫［2829］。病樣采集地距新源野果林10 km，梨火疫病很有可能傳播到新源野果林中，將對許多野生薔薇科植物種質(zhì)資源構(gòu)成重大威脅，造成不可估量的損失，因此，該病害的研究對保護(hù)新疆天山野果林生態(tài)安全，具有重大意義。

參考文獻(xiàn)

［1］ 陳國山， 郭浩， 步兆東， 等. 榿葉唐棣引種栽培試驗(yàn)初報［J］. 水土保持科技情報， 2004（4）：1314.

［2］ 于強(qiáng)波.榿葉唐棣生物學(xué)特性及栽培技術(shù)［J］.山西果樹， 2017（5）： 3233.

［3］ 張東為， 王占龍， 王玉峰.榿葉唐棣國內(nèi)研究進(jìn)展［J］.遼寧林業(yè)科技， 2020（4）： 4346.

［4］ 蘇小丹， 張卓睿， 孟慶繁， 等.榿葉唐棣中花色苷提取工藝的研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016（11）： 43 46.

［5］ 溫晉芳， 姜在民， 苑文柯.唐棣果黃酮類化合物的提取及抗氧化性研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報， 2017（2）： 3942.

［6］ 王占龍. 榿葉唐棣果實(shí)中多酚類物質(zhì)研究進(jìn)展［J］. 遼寧林業(yè)科技， 2020（2）： 6163.

［7］ 王占龍.榿葉唐棣果實(shí)加工利用及功能性成分研究現(xiàn)狀［J］.林業(yè)科技通訊， 2020（9）： 5052.

［8］ 張卓睿， 郝闖， 李玲， 等.榿葉唐棣米酒的釀造及抗氧化性研究［J］.中國釀造， 2016（10）： 4346.

［9］ 連翔， 孔繁軾， 步兆東， 等.高鈣榿葉唐棣果醬及其制作方法： CN101904463A ［P］. 20101208.

［10］曹麗娟， 王傍， 薛艷麗， 等.響應(yīng)面法優(yōu)化榿葉唐棣果酒發(fā)酵工藝的研究［J］. 中國釀造， 2018， 37（6）： 145149.

［11］于杰， 韓菁， 姜貴全， 等.榿葉唐棣果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化及有機(jī)酸和揮發(fā)性成分分析［J］.中國釀造， 2021， 40（8）： 145149.

［12］張治明. 北美喬灌木植物的引種［M］∥中國植物學(xué)會植物園分會編輯委員會. 植物引種馴化集刊：第7集. 北京：科學(xué)出版社， 1990：2532.

［13］高文韜， 孟慶繁， 楊春波， 等.榿葉唐棣引種試驗(yàn)［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2007， 35（1）： 1618.

［14］任向榮， 藺國倉， 回經(jīng)濤， 等. 新興小漿果樹種榿葉唐棣在烏魯木齊的引種栽培［J］. 農(nóng)村科技， 2022（3）： 4649.

［15］VEN DER Z T. Present worldwide distribution of fire blight ［J］. Acta Horticulturae， 1996， 411： 78.

［16］VAN DER ZWET T， KEIL H L， BLIGHT F. A bacterial disease of rosaceous plants ［M］. Washington： US Science and Education Administration1， 1979.

［17］胡白石， 許志剛， 周國梁， 等. 梨火疫病的進(jìn)境風(fēng)險分析［J］. 植物保護(hù)學(xué)報， 2001， 28（4）： 303308.

［18］李曉妹， 韓麗麗， 何亞南， 等. 20個蘋果品種（類型）對梨火疫病菌的抗病性評價［J］. 植物檢疫， 2022， 36（4）： 612.

［19］韓麗麗， 荊珺， 王杰花， 等. 杏樹梨火疫病在中國首次發(fā)生［J］. 植物檢疫， 2022， 36（6）： 49.

［20］中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第26號： 全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物分布行政區(qū)名錄［EB/OL］. （20230822） ［20240926］. http：∥www.moa.gov.cn/govpublic/ZZYGLS/202309/t202309046435699.htm.

［21］東秀珠， 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］. 北京： 科學(xué)出版社， 2001： 350351.

［22］賈平喬， 周國梁， 吳杏霞， 等. 進(jìn)境蘋果果實(shí)中梨火疫病菌的套式PCR檢測［J］. 植物病理學(xué)報， 2009， 39（3）： 449457.