急性氨影響副溶血弧菌的基因表達(dá)譜

DOI：10.16424/j.cnki.cn32-1807/r.2025.04.011

[關(guān)鍵詞]副溶血弧菌；急性氨；RNA-seq；基因表達(dá)；功能表型 [中圖分類號]Q933 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號] 1674-7887（2025）04-0362-08

Thegene expression profile of Vibrioparahaemolyticus exposed to acute ammonia*

WANGJian*，LUOXi*，LIXue，ZHANGYiquan，LURenfet** （Department of Clinical Laboratory，Nantong Third People's Hospital，AffiliatedNantongHospital3ofNantong University，Jiangsu 226006）

[Abstract]Objective：To investigatetheefectsofacuteammoniaonthegeneexpressonandfunctionalphenotypesof Vibrio parahaemolyticus（VP）.Methods：Usingacontrol groupwithcultureconditionsthatdidnotincludeNH4Clandanexperimental group with NH4Cl added at a final concentration of 71.68mg/L （simulating acute ammonia exposure），the RNA-seq assay was employedtoanalyzethegeneexpressionprofileofVP.Additionall，aseriesofphenotypicexperiments-includingcrystal violetstaining，motilityrelatedphenotpeassessment，andcyclicdiguanylate（c-di-GMP）contentmeasurement-werecoucted toexploretheimpactofacuteammoniaonthesefunctionalphenotypes.Results：Acuteammoniaexposureled to significant alterations inthetranscription levelsof 661 genes，including 379downregulated genesand282upregulatedgenes.These geneswereprimarilyconcentrated incellularmetabolicpathways，particularlythosecloselyrelated toaminoacidtransport andmetabolism，as wellasenergyproductionandconversion.Furthermore，acuteammoniaalsoregulatedthetranscriptionof several genes associated with biofilm formation， c -di-GMP metabolism，flagellar function，and key virulence factors.However， acuteammoniadidnotexhibitregulatoryefectsonthefunctional phenotypesthatcorrespond tothesegenes.Conclusion： Acuteammonia induced extensivetranscriptional changes inalargenumberof genes within VP，especiallthoserelated to metabolism.However，ithadnoregulatoryefectonfunctional phenotypessuchasbiofilmformation，c-di-GMPmetabolism， or motility.

[Key words] Vibrio parahaemolyticus;acute ammonia; RNA-seq; gene expression; functional phenotype

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus，VP）廣泛存在于海水和海洋生物中，是引起沿海地區(qū)細(xì)菌性食物中毒的\"頭號元兇\"。人們通常因食用了被其污染的海產(chǎn)品而感染該菌，從而引起以發(fā)熱、腹瀉、嘔吐等為主要癥狀的急性腸胃炎。VP能表達(dá)多種致病性毒力因子，如耐熱直接溶血素（thermostabledirecthemolysin，TDH）、TDH相關(guān)溶血素（TDH-related hem-olysin，TRH）、I型分泌系統(tǒng)（type III secretion system，T3SS）和VI型分泌系統(tǒng)（typeVI secretionsystem，T6SS）等。其中，TDH和TRH主要具有溶血活性和腸毒性，是其致病的關(guān)鍵因素之一。VP能表達(dá)T3SS1和T3SS2，T3SS1主要具有細(xì)胞毒性和小鼠致死毒性，而T3SS2則主要與腸毒性密切相關(guān)5。此外，VP還能表達(dá)T6SS1和T6SS2，T6SS1主要發(fā)揮抑菌作用，而T6SS2則主要具有細(xì)胞黏附活性，且與生物膜形成呈正相關(guān)[6-8]。

生物膜是細(xì)菌在固體表面生長時所形成的具有一定3D結(jié)構(gòu)的菌落聚集體，是細(xì)菌抵御不利生長環(huán)境的一種重要策略。VP生物膜的形成需要胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）、IV型菌毛、鞭毛等結(jié)構(gòu)的參與[。操縱子 cpsA-K 和 scvA-O 與EPS的合成密切相關(guān)，二者均與生物膜形成呈正相關(guān)[。VP表達(dá)的甘露糖敏感血凝素（編碼基因?yàn)閂P2692-2707）和受幾丁質(zhì)調(diào)節(jié)的菌毛（由操縱子 pilABCD 編碼）均屬V型菌毛，是黏附因子，也與生物膜形成呈正相關(guān)。VP具有極鞭毛和側(cè)鞭毛，極鞭毛介導(dǎo)菌體在液體中游動（swimming），而側(cè)鞭毛則與菌體在固體表面群集性爬動（swarming）相關(guān)，二者均參與生物膜3D 結(jié)構(gòu)的生成[9.12]。此外，胞外DNA、胞外蛋白質(zhì)、莢膜多糖（capsularpolysaccharide，CPS）等成分也對生物膜形成產(chǎn)生影響[13-14]。

毒力因子表達(dá)、生物膜形成、運(yùn)動性等關(guān)鍵通路受第二信使分子環(huán)二鳥苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP的緊密調(diào)控15。該分子的合成受鳥苷酸環(huán)化酶所催化，而其降解則依賴于磷酸二酯酶的催化[5]。鳥苷酸環(huán)化酶的酶活性存在于GGDEF結(jié)構(gòu)域，而磷酸二酯酶的酶活性存在于EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域之中[5]。有些酶蛋白僅含有這3種結(jié)構(gòu)域之一，而有些酶蛋白則可能同時具有GGDEF結(jié)構(gòu)域和EAL結(jié)構(gòu)域。以VP為例，其能夠表達(dá)28種含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)、14種含有EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)、16種同時含有GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域的雜合蛋白質(zhì)，以及5種含有HD-GYP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。然而，在這些眾多的蛋白質(zhì)中，僅少部分如VPA0198[7]、GefA[18]、TpdA[19] ScrC^[20] 和ScrG等得到了相對深人的研究。

VP是凡納濱對蝦、中國對蝦、斑節(jié)對蝦等重要的養(yǎng)殖蝦種急性肝胰壞死病的病原體，感染后發(fā)病率和死亡率均極高，給蝦類養(yǎng)殖業(yè)帶來了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失22。甲殼類動物，包括蝦類，其代謝蛋白質(zhì)的終產(chǎn)物主要為氨，這使高密度養(yǎng)殖的蝦場中，氨容易大量積累，進(jìn)而嚴(yán)重危害蝦類健康[23-24]。此外，氨的積累還可以塑造蝦類的腸道菌群多樣性和組成[25]。然而，盡管氨是一種有害物質(zhì)，但目前關(guān)于氨是否對蝦場中常見的病原菌（如弧菌等）產(chǎn)生影響，還鮮有文獻(xiàn)報道。氨是否影響VP毒力因子表達(dá)、生物膜形成、運(yùn)動性及 c-di-GMP 代謝等細(xì)胞途徑值得進(jìn)一步研究，這有助于了解在高氨環(huán)境下VP的生長、繁殖、致病和傳播規(guī)律，從而采取針對性措施減少疾病的發(fā)生，提高蝦的成活率和生長速度，提高經(jīng)濟(jì)效益。本研究通過向培養(yǎng)液中添加終質(zhì)量濃度為71.68mg/L 的 NH₄Cl 凡納濱對蝦 48h 致死濃度），以此模擬急性氨暴露的環(huán)境條件，進(jìn)而探究了氨對VP基因表達(dá)譜以及功能表型所產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，急性氨能對VP的全局性基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響，尤其是在代謝相關(guān)基因的表達(dá)方面影響尤為突出。不過，急性氨對于VP的生物膜形成、運(yùn)動性等重要功能表型卻并未產(chǎn)生影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株VP RIMD2210633（O3：K6型，高毒力，具有生物膜形成能力）由南通市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科保存。

1.1.2主要試劑 2.5% BactoTM Heart Infusion（HI）肉湯培養(yǎng)基購自BDBioscience;氯化銨 （NH₄Cl） 購自北京索萊寶科技有限公司;TRIzolReagent 購自Invit-rogen公司； 2× TaqPCRMastermix、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑以及SuperReal熒光定量預(yù)混試劑彩色版（SYBRGreen）等購自天根生化科技（北京）有限公司;微生物環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）ELISA試劑盒購自Mskbio公司。

1.1.3主要儀器NanoDrop 200 分光光度計購自Thermo公司；實(shí)時熒光定量PCR儀購自Roche公司；細(xì)菌培養(yǎng)箱購自北京六一生物科技有限公司。

1.2培養(yǎng)方法取 15μL 甘油菌種，接種于 5mL HI肉湯中，隨后置于 37°C.200r/min 的搖床中連續(xù)培養(yǎng) 12h 。按1：50的比例，將培養(yǎng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)接至 5mL 新鮮的HI肉湯中，在相同的溫度和轉(zhuǎn)速下連續(xù)培養(yǎng)至 0D₆₀₀ 值達(dá)到1.4。按 1：1000 的比例稀釋，轉(zhuǎn)接至5mLHI 肉湯或含有 71.68mg/LNH₄Cl 的HI肉湯中[25]，置 37°C.200r/min 條件下連續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)中期 （OD₆₀₀≈1.4） ，收集菌體細(xì)胞。

1.3VP生長曲線分析按1：2000的稀釋比例，將VP的預(yù)培養(yǎng)物接種至 10mL 的HI肉湯或含有71.68mg/LNH₄Cl 的HI肉湯中。充分混勻后，將菌液分裝至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 200μL ，每組設(shè)置12個生物學(xué)重復(fù)。采用寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)的MGC-200型微生物生長曲線分析儀，測量VP在 37°C.800r/min 條件下的生長曲線。

1.4轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析 收集在HI肉湯以及添加了 71.68mg/L （20號 NH₄Cl 的 HI肉湯中培養(yǎng)的菌體，將其分別溶解于 1mL 的TRIzol中。隨后，送至蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司開展后續(xù)處理，包括RNA提取 Ω，cDNA 文庫構(gòu)建、文庫純化以及文庫測序等步驟，測序采用 Ilumina Hiseq 300PE平臺進(jìn)行。以在HI肉湯中培養(yǎng)的菌體基因表達(dá)水平作為對照組，標(biāo)記為 ；以在含有 71.68mg/L （204號 NH₄Cl 的HI肉湯中培養(yǎng)的菌體基因表達(dá)水平作為實(shí)驗(yàn)組，標(biāo)記為“ 71.68mg/L^′ 。為保證結(jié)果的可靠性，每組均設(shè)置了3個生物學(xué)重復(fù)。測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估和序列比對以及差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）分析按之前的描述開展2。DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)為基因表達(dá)水平變化倍數(shù)達(dá)到2倍以上，同時 q?0.05. 。對DEGs進(jìn)行GO、KEGG以及同源蛋白簇（clusteroforthologous groups of proteins，COG）通路分析。

1.5實(shí)時定量 PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）收集在HI肉湯以及添加了 71.68mg/L NH₄Cl 的HI肉湯中培養(yǎng)的菌體，并采用TRIzol法提取總RNA。采用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后，以cDNA為模版，采用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑彩色版（SYBRGreen）進(jìn)行qRT-PCR分析。以16SrRNA的表達(dá)量為內(nèi)部參照，采用 2^-ΔΔα 法定量分析靶基因的轉(zhuǎn)錄水平27，引物序列見表1。

1.6生物膜結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)按 1：2000 的稀釋比例，將VP的預(yù)培養(yǎng)物 （OD₆₀₀≈1.4 接種至 10mL 的HI肉湯或含有 71.68mg/LNH₄Cl 的HI肉湯中，充分混勻后，分裝至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 1.5mL 每組至少4個生物學(xué)重復(fù)。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置 的條件下連續(xù)培養(yǎng) 12h 。測量游離菌液的濁度 （OD₆₀₀） ，并去除游離菌液。用去離子水洗滌生物膜，加入 2mL 0.1% 結(jié)晶紫溶液染色 30min 。隨后，用去離子水洗去未結(jié)合的結(jié)晶紫，加人 2mL15% 冰乙酸溶解結(jié)晶紫，并測量 OD₅₇₀ 的值。生物膜生成量用 OD₅₇₀ 除以 0D₆₀₀ 表示。

1.7菌落褶皺實(shí)驗(yàn)將VP的預(yù)培養(yǎng)物 （OD₆₀₀≈1.4） 點(diǎn)種于HI平板或含有 71.68mg/LNH₄Cl 的HI平板上，而后在 37^°C 孵箱中靜置培養(yǎng) 12～36h ，觀察菌落形態(tài)，拍正面照。

1.8 c -di-GMP測定收集在HI肉湯以及添加了71.68mg/L （2號 NH₄Cl 的HI肉湯中培養(yǎng)的對數(shù)中期（20 （OD₆₀₀≈1.4） 的菌體細(xì)胞，并重懸于預(yù)冷的PBS中。冰水浴條件下，充分裂菌。 4^°C 下 12 000g 離心 5min 。用微生物c-di-GMPELISA試劑盒測定上清液中的c-di-GMP含量;用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液中的總蛋白含量。

1.9動力表型實(shí)驗(yàn)取 2μL 預(yù)培養(yǎng)物 （OD₆₀₀≈1.4） 接種至HI半固體平板（含有 0.3% Difco noble agar）內(nèi)部或點(diǎn)種于HI固體平板（含有 2% Difco noble agar）平板表面，于 37°C 下靜置培養(yǎng)特定時長，通過測量菌苔直徑研究VP的 swimming 和 swarming表型。其中，對照組不添加 ΔNH₄Cl ，而實(shí)驗(yàn)組添加 71.68mg/L 的 NH₄Cl ，每組至少5個生物學(xué)重復(fù)。

1.10透明度表型檢測將VP的預(yù)培養(yǎng)物 （OD₆₀₀≈ 1.4）劃線接種至HI平板或含有 71.68mg/L （204 NH₄Cl 的HI平板上，而后在 37°C 孵箱中靜置培養(yǎng) 24h ，觀察菌落形態(tài)，拍正面照。

1.11HeLa細(xì)胞毒活性檢測按 1：1 000 的稀釋比例，將VP的預(yù)培養(yǎng)物接種至 5mL 的 HI 肉湯或含有71.68mg/LNH₄Cl 的HI肉湯中，置 37°C.200r/min 的條件下連續(xù)培養(yǎng)，直至對數(shù)中期 （OD₆₀₀≈1.4） 。收集菌體細(xì)胞，并用無酚紅的DMEM洗滌3次，而后重懸于無酚紅的DMEM中。按2.5倍的感染復(fù)數(shù)感染HeLa細(xì)胞，置 37^°C，5%CO₂ 孵箱中孵育 ³h 。采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒，按照說明書步驟操作，測定被感染的HeLa細(xì)胞的LDH釋放量，以評估VP的HeLa細(xì)胞毒活性。

1.12統(tǒng)計學(xué)方法除RNA-seq外，其他每種實(shí)驗(yàn)都至少重復(fù)3次，每次至少設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)以 表示，并運(yùn)用Student'st檢驗(yàn)， Plt;0.01 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1急性氨不影響VP的生長由圖1可見，VP在HI 肉湯培養(yǎng)基中的生長速率，與在含有 71.68mg/L NH₄Cl 的HI肉湯中的生長速率相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，急性氨對VP的生長無影響。

2.2急性氨引起VP全局性基因表達(dá)本研究共計測定了6個Illumina文庫，每個文庫包含的原始測序片段（raw read）均超過1444萬條。原始數(shù)據(jù)（Raw data）已上傳至美國國立生物技術(shù)信息中心（NationalCen-terforBiotechnologyInformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫，對應(yīng)的查詢號為PRJNA1164955。原始測序片段經(jīng)過濾，獲得合格序列Cleanreads）。合格序列與VPRIMD2210633的基因組總匹配率和單一匹配率均在 96% 以上，說明數(shù)據(jù)良好，滿足進(jìn)一步分析需求。

以“ ”組細(xì)菌的基因表達(dá)水平為參照，分析“ 71.68mg/L^′ 組中菌的基因表達(dá)水平，如圖2A所示，共鑒定出661個DEGs，其中379個基因下調(diào)，282個基因上調(diào)。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對DEGs參與的信號通路進(jìn)行注釋，如圖2B所示，DEGs只注釋到細(xì)胞代謝（metabolism）和人類疾病（humandiseases）信號通路上，分別包含671和3個基因。利用COG數(shù)據(jù)庫對DEGs編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋和分類，如圖2C所示，位于前5的富集依次集中在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（amino acid transport and metabolism） 能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換（energy production and conversion）、無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（inorganic ion transport and metabo-lism）、一般功能預(yù)測基因（general function predictiononly）和未知功能基因（functionunknown）。利用GO數(shù)據(jù)庫對DEGs功能進(jìn)行分類，如圖2D所示，共有153個DEGs被富集到分子功能（molecular function），147個DEGs 富集到細(xì)胞組分（cellular component）以及94 個DEGs 富集到生物過程（biological process）。此外，DEGs包含24個假定調(diào)控子蛋白基因、5個c-di-GMP代謝相關(guān)基因、5個T3SS2相關(guān)基因、4個T6SS1相關(guān)基因、10個T6SS2相關(guān)基因、2個Mfp蛋白基因、1個EPS合成基因、2個CPS多糖基因、1個極鞭毛相關(guān)基因以及7個側(cè)鞭毛相關(guān)基因（表2）。

2.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證 本研究共挑選了7個已知功能或具備進(jìn)一步研究價值的DEGs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。如圖3所示，qRT-PCR證明的調(diào)控關(guān)系和RNA-seq證明的調(diào)控關(guān)系是一致的，說明RNA-seq結(jié)果可靠。

2.4急性氨不影響VP生物膜相關(guān)表型DEGs中包含生物膜形成相關(guān)的基因，如VPA1405、mfpA、VP2523等，提示急性氨可能調(diào)控VP的生物膜形成。然而，結(jié)晶紫染色結(jié)果表明，無論培養(yǎng)基中是否添加NH₄Cl ，VP的生物膜形成能力均無顯著差異（圖4A）。菌落褶皺實(shí)驗(yàn)也顯示，在 0mg/L 和 71.68mg/L 的NH₄Cl 條件下，VP形成的菌落形態(tài)相同（圖4B）。這表面添加 71.68mg/LNH₄Cl 對VP的生物膜形成能力并無影響。此外，DEGs中還涵蓋了5個c-di-GMP代謝相關(guān)基因，即tpdA、VP2366、scrM、VPA1429和VPA1547，以及2個CPS合成相關(guān)基因VP0220和VP0228。然而，表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在添加 71.68mg/L NH₄Cl 的條件下，VP的c-di-GMP代謝（圖4C）和CPS合成（圖4D）均未受到顯著影響。

2.5急性氨不影響VP的運(yùn)動能力DEGs中包含1個極鞭毛相關(guān)基因（VP2252）和7個側(cè)鞭毛生成相關(guān)基因，暗示急性氨可能調(diào)控VP的運(yùn)動能力。然而，表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在添加 71.68mg/LNH₄Cl 的條件下，VP的 swimming 和 swarming 表型均未受到顯著影響（圖5），說明急性氨不影響VP的運(yùn)動能力。

注：A，結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)；B，菌落褶皺實(shí)驗(yàn)；C，胞內(nèi)c-di-GMP濃度;D，CPS相位轉(zhuǎn)換;ns， Pgt;0.01 。

3討論

VP是咸水蝦養(yǎng)殖場中常見的病原體，能引起蝦類急性肝胰壞死病，給蝦類養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的危害。蝦類分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨，使高密度養(yǎng)殖場中的氨大量積累，進(jìn)而影響蝦類健康和其腸道內(nèi)的菌群多樣性和組成[25。然而，氨是否會對蝦場中常見的病原菌，如VP產(chǎn)生影響，還未見報道。本研究通過RNA-seq研究了模擬急性氨的生長環(huán)境對VP基因表達(dá)譜的影響。結(jié)果表明，急性氨共導(dǎo)致661個基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著性改變，包括379個下調(diào)基因和282個上調(diào)基因。DEGs主要集中在細(xì)胞代謝方面，尤其是涉及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝以及能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換方面，說明VP可能利用 NH₄⁺ 作為氮源。

DEGs 中包含2個Mfp蛋白基因（mfpA 和 mfpB）. 1個EPS合成相關(guān)基因（VPA1405）以及1個受幾丁質(zhì)調(diào)節(jié)的菌毛基因 （pilA） ），這些基因的表達(dá)水平均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。當(dāng)Mfp相關(guān)基因發(fā)生突變時，菌株在固體表面上的生物膜形成能力會減弱，且形成的生物膜更容易脫落[28；受幾丁質(zhì)調(diào)節(jié)的菌毛是黏附因子，與生物膜形成能力呈正相關(guān)；而EPS合成相關(guān)基因發(fā)生突變的菌株，不僅生物膜形成能力降低，而且在固體表面上僅能形成光滑型的菌落\"]。DEGs中還囊括5個c-di-GMP代謝相關(guān)基因，其中包括tdpA 和scrM。TpdA是一種觸發(fā)式磷酸二酯酶，即當(dāng)c-di-GMP水平低或其自身缺乏磷酸二酯酶活性時，TpdA能夠促進(jìn)其自身基因的表達(dá)[19]。若TpdA缺失，VP的swimming能力降低;而TpdA過表達(dá)時，VP的swim-ming和swarming能力均會增強(qiáng)，但生物膜形成能力則會下降[。scrM是操縱子scrMNO操縱子的首基因，而 Scr0 正向調(diào)控生物膜形成，然而 ScrM 的具體功能還未被研究[29]。此外，DEGs中還包括了2個CPS合成相關(guān)基因、1個極鞭毛合成相關(guān)基因以及7個側(cè)鞭毛合成相關(guān)基因。鞭毛介導(dǎo)的細(xì)菌運(yùn)動有利于生物膜3D結(jié)構(gòu)的生成12，而CPS高表達(dá)則使菌落呈不透明狀且抑制生物膜的形成[13.30]。這些結(jié)果似乎提示急性氨可能對VP生物膜形成 ?c -di-GMP代謝以及運(yùn)動性等功能表型具有調(diào)控作用。然而，表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，急性氨對VP的這些表型并無顯著影響。這可能是因?yàn)檫@些表型受到多基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，而單一環(huán)境刺激（如急性氨暴露）可能僅部分?jǐn)_動了該網(wǎng)絡(luò)，未能觸發(fā)表型變化的閾值。此外，本研究采用的氨質(zhì)量濃度 （71.68mg/L） 模擬了急性暴露，但未涵蓋長期暴露或梯度濃度處理，因此可能未達(dá)到引發(fā)表型變化的臨界條件。最關(guān)鍵的是，氨基酸代謝和能量轉(zhuǎn)換通路的富集提示VP可能將 NH₄⁺ 作為氮源，進(jìn)行代謝重塑以適應(yīng)高氨環(huán)境。

DEGs中包含4個T6SS1相關(guān)基因（均被下調(diào)）、10個T6SS2相關(guān)基因（3個上調(diào)、7個下調(diào)）以及5個T3SS2相關(guān)基因（2個下調(diào)、3個上調(diào)）。T6SS1主要具有抑菌功能，與VP的競爭作用有關(guān);T6SS2則主要具有細(xì)胞黏附活性，并能促進(jìn)生物膜形成[6-8]。此外，T3SS2與腸毒性有著密切的關(guān)聯(lián)[5。然而，T6SS1、T6SS2以及T3SS2均為多基因編碼產(chǎn)物，急性氨僅能調(diào)控其中的部分基因，且對同一位點(diǎn)內(nèi)的基因調(diào)控關(guān)系也有差異。因此，急性氨是否能夠調(diào)控T6SS1、T6SS2以及T3SS2相關(guān)的功能表型，仍需進(jìn)一步研究。此外，DEGs中還有24個調(diào)控子基因，包括一些編碼 _{GntR，MarR，LysR} 等家族的全局性調(diào)控子的基因。其中， cpsQ 是 依賴性的全局性調(diào)控子，必須結(jié)合c-di-GMP才能調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[29]。CpsQ對生物膜形成相關(guān)基因以及T6SS2合成相關(guān)基因均具有調(diào)控作用[29.31]。CpsR 是霍亂弧菌 VpsR 的同源蛋白，參與調(diào)控EPS合成相關(guān)基因的表達(dá)，但并不是必需的，其僅在CPS不表達(dá)的情況下，促進(jìn)EPS的表達(dá)[32。然而，其他22個調(diào)控子基因的功能還完全未知，有必要進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究利用RNA-seq技術(shù)研究了急性氨對VP基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，急性氨共導(dǎo)致661個基因出現(xiàn)顯著性差異表達(dá)，主要集中于細(xì)胞代謝通路，特別是與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換密切相關(guān)的基因。此外，急性氨還對一些生物膜形成相關(guān)基因、c-di-GMP代謝相關(guān)基因、鞭毛基因以及一些關(guān)鍵毒力因子基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用。然而，對于這些基因所對應(yīng)的功能表型，急性氨卻未表現(xiàn)出調(diào)控作用。本研究的開展，有利于人們理解VP對急性氨刺激的響應(yīng)機(jī)制。

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