GhALMT10在干旱脅迫下的功能鑒定

Abstract：[Objective]Thisstudyaimedtoexplorethebiologicalfunctionsofoneof thealuminum-activatedmalate transporter （ALMT）familygenes，GhALMT10，inthedroughtresistanceofcoton，therebyestablishingafoundation foradeeper understandingof themechanisms ofdroughtresistance incoton．[Methods]ThecodingsequenceofGhALMT10 gene was amplifiedfromGossypiumhirsutumTM-1bypolymerasechainreaction （PCR），followedbybioinformaticsanalysis.The expresionpattensofthisgneinvariouscotontissuesaswellasunderdroughtstress，wereassessedusingquantitative real-timePCR（qRT-PCR）.Aditionally，thebiological functionof thisgeneincoton'sresponsetodrought stress was preliminarilyverifiedusingvirus-induced gene silencing（VIGS）technology.[Results]Thecodingregionof GhALMT0spans 1 401bp，encoding aproteincomposed of 466aminoacid residues，which is predicted to be stableand hydrophobic. Phylogeneticanalysisindicated that GhALMT10 iscloselyrelatedto GrALMT10，GaALMT10-like，HsALMT10，and TcALMT10.Results byqRT-PCR indicated thatGhALMT10is expressed incotonroots，stems，and leaves，withthe highest expresion levelobservedin theroots.Comparedwiththecontroltreatment withclear water，theexpresionlevelofGhALMT10 was low at ^3h of drought sress，and then significantly increased at 6n and9h of drought stress treatment，while it significantly decreased at 24h Furthermore，thesurvival rateofGhALMT10-silenced cotton plants was significantly higher under drought stresscomparedwith thenegativecontrolplants.Thewaterlossrateof detached leaveswassignificantlyreduced，the chloropyll content in leavesafterdroughttreatmentwas significantly increased，and themalondialdehydecontentwas significantlydecreased inGhALMT10-silencedcoton plants.[Conclusion]Thedrought toleranceof GhALMT10-silenced plants Was significantlyenhanced，indicating that GhALMT10gene negativelyregulates droughtresistance incotton.

Keywords：cotton;GhALMO;drought stress;expressonpaternanalysis;virus-inducedgenesilencing;physiologcaland biochemical indicators

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。新疆是我國(guó)最大的棉花種植基地，但新疆的地理位置在很大程度上決定了其干旱的環(huán)境1。干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)降低[2-3]。因此，培育抗旱棉花品種顯得尤為重要。而傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)存在耗時(shí)長(zhǎng)、難度大等固有局限。通過(guò)對(duì)棉花干旱相關(guān)基因展開(kāi)深入探究，解析棉花抗旱的分子機(jī)理，并借助分子育種手段培育抗旱棉花新品系，無(wú)疑是解決該問(wèn)題的1條理想路徑。

鋁激活蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（aluminium-activatedmalatetransporter，ALMT）在植物體內(nèi)發(fā)揮著多種功能，包括參與調(diào)節(jié)陰離子穩(wěn)態(tài)[45]、礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素吸收、氣孔開(kāi)閉、對(duì)鋁（aluminium，Al）的耐受性[89]和果實(shí)酸度等。第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的ALMT家族成員是TaALMT1，該基因編碼的蛋白可被 Al³⁺ 激活，調(diào)控蘋(píng)果酸從小麥的根部分泌至土壤，并且過(guò)表達(dá)該基因可以提高小麥對(duì)Al脅迫的耐受性[1I-13]。擬南芥ALMT家族基因有14個(gè)成員，它們定位在不同的組織細(xì)胞中且發(fā)揮著不同的功能[14]。如AtALMT1在根部的表達(dá)可以及時(shí)調(diào)節(jié)蘋(píng)果酸分泌，從而在根部與 Al³⁺ 發(fā)生螯合反應(yīng)，減輕A1脅迫對(duì)根部的損傷[15]。AtALMT4基因不僅通過(guò)脫落酸（abscisicacid，ABA）信號(hào)通路調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)度，還在花粉管中表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞pH或膨壓影響受精過(guò)程1。AtALMT6主要在保衛(wèi)細(xì)胞和花器官中表達(dá)，編碼的蛋白定位于液泡膜，液泡pH和胞質(zhì)蘋(píng)果酸可調(diào)節(jié)其活性，進(jìn)而影響蘋(píng)果酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，Atalmt6基因敲除植物的保衛(wèi)細(xì)胞液泡中蘋(píng)果酸含量降低[17]。AtALMT9在氣孔開(kāi)放過(guò)程中起關(guān)鍵作用，功能缺失突變體氣孔開(kāi)放受損，蒸騰作用減弱，比野生型更耐旱[18]。AtALMT12主要在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，編碼的蛋白定位在質(zhì)膜上，對(duì) Al³⁺ 不敏感，可被蘋(píng)果酸激活，功能缺失會(huì)導(dǎo)致植物在黑暗、ABA、高濃度 CO₂ 等條件下氣孔關(guān)閉受損，影響氣體交換[19]。隨著研究的不斷深人，其他多種植物中ALMT基因的功能也被解析。如劉慧等[20]研究發(fā)現(xiàn)，GmALMT8超表達(dá)大豆材料的毛狀根中蘋(píng)果酸含量顯著高于對(duì)照，在擬南芥中過(guò)表達(dá)該基因也能提高蘋(píng)果酸含量。GmALMT33轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鎘脅迫的耐受性增強(qiáng)2。BdALMT12蛋白受蘋(píng)果酸、鈣離子/鈣調(diào)蛋白共同調(diào)節(jié)，影響離子轉(zhuǎn)運(yùn)，從而調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞膨壓，影響氣孔開(kāi)閉，最終影響植物對(duì) CO₂ 的吸收以及水分蒸發(fā)[22]

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，ALMT基因參與調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)閉，而氣孔開(kāi)閉與抗旱過(guò)程密切相關(guān)。陸地棉（Gossypiumhirsutum）中已鑒定出34個(gè)ALMT基因[23]，但關(guān)于其抗旱功能的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)三片真葉期的陸地棉TM-1棉苗進(jìn)行了模擬干旱處理以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選到1個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的基因GhALMT10（ GH_- D03G0984）?；诖?，本研究對(duì)該基因進(jìn)行了克隆、生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerasechainreaction，qRT-PCR）檢測(cè)該基因在不同組織部位和干旱脅迫下的表達(dá)模式，并利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)初步驗(yàn)證該基因在干旱脅迫下發(fā)揮的功能，以期為棉花抗逆分子育種提供候選基因資源。

1材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為陸地棉標(biāo)準(zhǔn)品系TM-1，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與載體

農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞 、2kb plusII DNAMaker、Blunt-Zero平端克隆載體、FastPfuFlyDNA聚合酶均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購(gòu)自上海愛(ài)必夢(mèng)生物科技有限公司；丙二醛（malondi-aldehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物合成及測(cè)序均由新疆有康生物科技有限公司完成。

煙草脆裂病毒（tobacco rattlevirus，TRV）載體TRV：：RNA1、TRV：RNA2 和 TRV：GhCLA1（陽(yáng)性對(duì)照）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3RNA提取及GhALMT10基因的克隆

選取顆粒飽滿且大小一致的TM-1種子，將其播種于營(yíng)養(yǎng)土與蛭石（體積比為 1：2 ）的混合基質(zhì)中，并放置在 25°C 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（16h光照18h 黑暗）培養(yǎng)。待其第3片真葉長(zhǎng)出時(shí)，取第2片真葉，用植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，經(jīng) 1% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

在CottonOmics Database（http：//cotton.zju.edu.cn/index.htm）中獲得GhALMT10（ GH_- D03G0984）的編碼序列（codingsequence，CDS）并設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。以棉花真葉cDNA為模板，參照尤揚(yáng)子[24的反應(yīng)體系及程序進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR），利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增片段大小，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后，連接至Blunt-Zero載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng) 12h 后挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序。

表1本研究使用的引物序列

Table 1Primer sequences used in this study

1.4生物信息學(xué)分析

通過(guò)ProtParam （https：//web.expasy.org/prot-param/）工具預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、不穩(wěn)定指數(shù)、等電點(diǎn)、疏水指數(shù)及脂肪系數(shù)等理化參數(shù)。用SignalP5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）與 TMHMM2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分別進(jìn)行信號(hào)肽識(shí)別及跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。基于SMART（https：//smart.embl.de/）結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域鑒定。用PRABI（https：//doua.prabi.fr/software/cap3）預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。采用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）同源建模平臺(tái)構(gòu)建三維空間結(jié)構(gòu)模型。

根據(jù)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST結(jié)果，選取雷蒙德氏棉（G.raimondii）、澳洲棉（G.australe）、木槿（Hibiscussyriacus）開(kāi)心果（Pistaciavera）、可可（Theobro-macacao）、歐洲甜櫻桃（Prunusavium）、黑楊（Populusnigra）、桃（Prunuspersica）棗（Ziziphusjujuba）、蒿柳（Salixviminalis）、毛果楊（Populustrichocarpa）等物種中的GhALMT10同源蛋白序列，使用MEGA11構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用鄰接法（neighbor-joiningmethod），設(shè)自展值（bootstrapvalue）為1000，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值。

利用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb）ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)（起始密碼子上游 2000bp ）的順式作用元件。

1.5 GhALMT10基因的表達(dá)模式分析

選取3葉期長(zhǎng)勢(shì)一致的TM-1幼苗，按照 Hu 等[25]的方法用 15% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）6000進(jìn)行干旱脅迫處理，分別取對(duì)照組和處理組 0h，3h，6h，9h，12h 24h 的真葉以及處理 ^0h 對(duì)照組的根、莖、葉，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選3株，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。樣本經(jīng)液氮速凍后依據(jù)1.3的方法提取RNA并合成cDNA，用熒光定量試劑盒通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)GhALMT10基因在棉花不同組織和干旱脅迫下的表達(dá)量。以棉花GhUBQ7為內(nèi)參基因，利用Livak等2的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6VIGS載體構(gòu)建及基因沉默效率檢測(cè)

利用SGNVIGSTool篩選GhALMT1O沉默片段，并通過(guò)DNAMAN設(shè)計(jì)沉默片段的特異性引物CM-GhALMT10-F/R（序列見(jiàn)表1）。以TM-1真葉的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序。通過(guò)酶切、連接方法將測(cè)序正確的沉默片段（ 430log ）插入TRV：：RNA2載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101。

選取生長(zhǎng)出2片子葉的TM-1幼苗，采用Hu等[25]的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。試驗(yàn)體系包含TRV：：00（陰性對(duì)照組）TRV：：GhCLA1（陽(yáng)性對(duì)照組）和TRV：：GhALMT1O（試驗(yàn)組）。侵染后陽(yáng)性對(duì)照棉株的真葉出現(xiàn)白化表型時(shí)，取陰性對(duì)照和試驗(yàn)組的真葉，利用qRT-PCR檢測(cè)GhALMT10基因的沉默效率，以棉花GhUBQ7為內(nèi)參基因，方法同1.5。

1.7 抗旱性鑒定

農(nóng)桿菌侵染后 20d ，對(duì)GhALMT10基因沉默植株和陰性對(duì)照植株進(jìn)行自然干旱脅迫（不灌水）處理。處理10d后，觀察試驗(yàn)組與對(duì)照組的表型并拍照記錄，然后進(jìn)行復(fù)水，復(fù)水5d后再次觀察棉株表型變化并統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組（3個(gè)重復(fù)，分別有12株、12株、16株）與對(duì)照組（3個(gè)重復(fù)，分別有12株、14株、16株）的存活率。

1.8抗旱相關(guān)的生理生化指標(biāo)檢測(cè)

選取干旱處理前陰性對(duì)照組（TRV：：OO）與試驗(yàn)組（TRV：：GhALMT1O）植株第2片真葉，利用稱重法，每隔1h記錄1次離體葉片的自然失水率，連續(xù)記錄 8h 。選取干旱脅迫處理前、干旱處理8d的陰性對(duì)照組與試驗(yàn)組植株的第2片真葉，用SPAD-502葉綠素儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）測(cè)定葉片的SPAD（soilandplant analyzerdevelopment）值表征葉綠素含量，用MDA檢測(cè)試劑盒測(cè)定葉片MDA含量。各個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1片真葉。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

用MicrosoftExcel2019整理數(shù)據(jù)，用IBNSPSSStatistics26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用最小顯著差異法（leastsignificantdifference，LSD）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1GhALMT10基因的生物信息學(xué)分析

以棉花真葉cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增、測(cè)序，得到GhALMT10的CDS序列，長(zhǎng)度為 1401bp 。生物信息學(xué)分析表明，GhALMT10開(kāi)放閱讀框（openreadingframe，ORF）長(zhǎng)度為 1401bp ，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，編碼466個(gè)氨基酸殘基。編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為 51466.10Da ，不穩(wěn)定指數(shù)為35.62，理論等電點(diǎn)為7.51，平均親水指數(shù)為0.200，脂肪系數(shù)為102.27，預(yù)測(cè)為穩(wěn)定、疏水的蛋白。SignalP5.0與TMHMM2.0預(yù)測(cè)表明，該蛋白無(wú)信號(hào)肽但有跨膜區(qū)域（圖 1A～B ）。基于SMART結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，GhALMT10含有6個(gè)跨膜區(qū)域，并且含有1個(gè)ALMT和1個(gè)FUSC結(jié)構(gòu)域。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括 α? 螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲，占比分別為 63.09%，33.05% 和 3.86% （圖1C）。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖1D）與二級(jí)結(jié)構(gòu)特征（圖1C）高度吻合。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）結(jié)果顯示，GhALMT10及其同源蛋白可分為3個(gè)亞組，分別包括5個(gè)、4個(gè)和3個(gè)蛋白。GhALMT10與雷蒙德氏棉GrALMT10、澳洲棉GaALMT10-like、木槿HsALMT10、可可TcALMT10親緣關(guān)系較近。

經(jīng)預(yù)測(cè)，GhALMT10啟動(dòng)子區(qū)域存在TATA盒、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子普遍存在的元件CAAT-box、赤霉素響應(yīng)元件P-box、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG-motif、干旱響應(yīng)元件MYC、參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)以及光響應(yīng)元件GT1-motif、Sp1、GATA-motif等（表2）。

圖1GhALMT10蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.1BioinformaticsanalysisofGhALMT10 protein

A：信號(hào)肽預(yù)測(cè)。SP（Sec/SPI）表示信號(hào)肽序列;CS表示剪切位點(diǎn);Other表示無(wú)信號(hào)肽序列。B：跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)測(cè)。C：二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。D：三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

A：signalpeptideprediction.SP（Sec/SPI）representssignalpeptidesequence; CSrepresentscleavage site;Otherrepresents no signalpeptidesequence.B：transmembraneregionprediction.C：secondarystructure prediction.D：tertiarystructureprediction.

2.2GhALMT10基因在棉花不同組織及干旱脅迫下的表達(dá)模式分析

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)GhALMT10基因在棉花根、莖、葉中的表達(dá)情況，該基因在根中的相對(duì)表達(dá)量較高，葉中次之，在莖中的相對(duì)表達(dá)量最低（圖3A）。干旱脅迫處理后，棉花真葉中GhALMT10的表達(dá)量呈現(xiàn)降-升-降-升-降的變化趨勢(shì)，處理 ^0h 的表達(dá)量最高，處理 3h，24h 的表達(dá)量較低。與對(duì)照（清水）處理相比，該基因在干旱脅迫處理 6h，9h 的表達(dá)量顯著上調(diào)，而在 3h?angle4h 的表達(dá)量顯著下調(diào)（圖3B）。

圖2ALMT10蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig.2Phylogeneticanalysisof ALMT10 protein

表2GhALMT10啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

Table2 Analysisofcis-actingelements inthe GhALMT10 promoter

2.3 沉默GhALMT10基因增強(qiáng)棉花的抗旱性

棉花幼苗被侵染后約15d，陽(yáng)性對(duì)照（TRV：：GhCLA1）棉株呈現(xiàn)典型的GhCLA1基因沉默所致的葉片白化表型（圖4A），說(shuō)明VIGS體系能夠正常工作。qRT-PCR結(jié)果表明，試驗(yàn)組（TRV：：GhALMT10）中GhALMT10基因的表達(dá)量顯著低于TRV：：00對(duì)照組（圖4B），表明試驗(yàn)組中棉株的GhALMT10基因被有效沉默。

經(jīng)過(guò)10d自然干旱脅迫處理，試驗(yàn)組TRV：：

GhALMT10與對(duì)照組TRV：：00的葉片都出現(xiàn)一定程度的萎蔫現(xiàn)象，但與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組葉片的干枯萎癥狀較輕。復(fù)水后5d，TRV：：00僅有少部分植株存活，存活率為 10.99% ，TRV：：GhALMT10多數(shù)棉株可正常生長(zhǎng)，存活率為59.72% （圖 4C～D ）。綜上，沉默GhALMT10基因使棉株具有更強(qiáng)的抗旱能力。

圖3GhALMT10在不同棉花組織（A）及干旱脅迫下（B）的表達(dá)

Fig.3Expression of GhALMT10 in different cotton tissues （A）and under drought stress （B）

離體葉片失水率檢測(cè)結(jié)果顯示，TRV：：GhALMT10在 3～8h 的失水率顯著低于TRV：：00（圖4E），表明GhALMT10基因沉默棉株具有較強(qiáng)的保水能力。在干旱處理前，TRV：：00和TRV：：GhALMT10的葉片SPAD值基本一致，無(wú)顯著差異；干旱處理8d后，TRV：GhALMT10棉株葉片的SPAD值顯著高于TRV：：00（圖4F）。干旱處理前，TRV：0O和TRV：：GhALMT1O的葉片MDA含量無(wú)顯著差異；干旱處理8d后，二者的MDA含量均明顯升高，TRV：：00的MDA含量顯著高于TRV：：GhALMT10（圖4G）。綜合上述研究結(jié)果，沉默GhALMT10基因降低了離體葉片失水率，在干旱脅迫下提高了葉片SPAD值并且降低了葉片MDA含量，增強(qiáng)了棉株的抗旱能力。

3討論

ALMT是在植物耐A1研究中首先被發(fā)現(xiàn)的1類陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。研究者最早通過(guò)差減雜交法從耐A1小麥品系ET8根尖中鑒定出ALMT家族成員TaALMT1[I3]。越來(lái)越多的研究表明，ALMT家族是普遍存在于植物細(xì)胞中且植物特有的1類通道蛋白，在植物多種生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28]。

前人在擬南芥中鑒定出14個(gè)ALMT基因家族成員[4。在大豆中鑒定出34個(gè)ALMT基因家族成員，其中在進(jìn)化樹(shù)的Ic亞支中的GmALMT僅在N端有1個(gè)疏水區(qū)域，包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域2。在甘蔗中鑒定出11個(gè)ALMT基因家族成員，它們至少含有1個(gè)ALMT（PF11744）結(jié)構(gòu)域[30]。在中國(guó)白梨中鑒定出27個(gè)ALMT基因家族成員，均包含ALMT結(jié)構(gòu)域和FUSC結(jié)構(gòu)域[3]。在蘋(píng)果中鑒定出25個(gè)ALMT基因家族成員，其中多數(shù)基因在蘋(píng)果的不同組織部位均有表達(dá)[32]。本研究的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，GhASMT10蛋白含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并且含有ALMT和FUSC結(jié)構(gòu)域；qRT-PCR結(jié)果表明，GhASMT10在棉花的根、莖、葉中都有表達(dá)。

ΔXu 等[3]通過(guò)RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)降低大麥HvALMT1的表達(dá)量，在光照強(qiáng)度較弱的條件下，RNAi植株的氣孔導(dǎo)度顯著高于對(duì)照，并且離體葉片失水更快。Eisenach等研究發(fā)現(xiàn)Atalmt4突變體在ABA作用下氣孔關(guān)閉受損，且該基因可能通過(guò)影響離子通道和細(xì)胞膨壓等參與氣孔的開(kāi)閉運(yùn)動(dòng)。敲除SIALMT15基因?qū)е路眩⊿olanumlycopersicumL.）葉片上的氣孔數(shù)量明顯減少，離體葉片的失水率明顯降低，抗旱性明顯增強(qiáng)[34]。本研究通過(guò)VIGS技術(shù)降低GhALMT10的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)GhALMT10基因沉默棉株的抗旱性顯著強(qiáng)于對(duì)照棉株，基因沉默棉株的離體葉片失水率、干旱處理下的葉片MDA含量顯著低于對(duì)照棉株，干旱脅迫下GhALMT10沉默棉株的存活率和葉片葉綠素含量顯著高于對(duì)照棉株。根據(jù)前人研究推測(cè)，GhALMT10可能通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)閉負(fù)調(diào)控棉花的抗旱性，未來(lái)可利用基因編輯和轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)等技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在干旱脅迫下的功能并解析其作用機(jī)制。

A：GhCLA1沉默棉株表型，標(biāo)尺為 1cm B：qRT-PCR檢測(cè)GhALMT1O的沉默效率。C：對(duì)照組TRV：00和試驗(yàn)組TRV：GhALMT10植株的存活率。D：GhALMT10沉默棉株在干旱脅迫下的表型，TO為干旱處理前，T1為干旱處理 10d T2為復(fù)水后 5d E：離體葉片失水率。F：葉片葉綠素含量。G：葉片丙二醛含量。*、**分別表示在0.05、0.01水平差異顯著。

圖4GhALMT10沉默棉株的抗旱性

A： phenotype of GhCLA1 silencing coton plants.Bar sacle，1 cm.B：silencing efficiency of GhALMT10 detected by q RT-PCR.C：survival rateofTRV：00andTRV：：GhALMT10plants.D：phenotypesof GhALMT10-silenced cotonplants under droughtstre.Teforedought;thafroughtreatmnt;，thafterrehratio.Eaterlosteofate leaves.F： chlorophyll content of leaves. G： MDA content of leaves. * and ** indicate significant differences at the probability levels of 0.05 and 0.01，respectively.

Fig.4 The drought tolerance of GhALMT10-silenced cotton plant

4結(jié)論

GhALMT10在棉花根中的表達(dá)量較高，在干旱脅迫處理6h和 ^9h 的表達(dá)量顯著高于清水處理。在自然干旱脅迫處理后，與TRV：0O對(duì)照棉株相比，GhALMT10沉默棉株的存活率和葉片葉綠素含量顯著升高，離體葉片失水率和丙二醛含量顯著下降，說(shuō)明GhALMT1O基因在棉花抗旱過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯：王小璐 責(zé)任校對(duì)：王國(guó)鑫）