高溫干旱脅迫后調(diào)節(jié)劑對棉花鈴殼中Bt蛋白含量及氮代謝的影響

摘要：【目的】研究高溫干旱脅迫后生長調(diào)節(jié)劑對棉花Bt蛋白含量的影響及其生理機(jī)制，為生產(chǎn)上抗蟲棉的安全應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)?！痉椒?021—2022年，以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉常規(guī)品種泗抗1號（SK-1）和雜交品種泗抗3號（SK-3）為材料，于盛花期在人工氣候室中設(shè)置高溫（ 34^°C 和 38^°C ）和干旱（田間最大持水量的50% 和 60% ）脅迫處理，以 32° 和田間最大持水量的 75% 為對照（CK）。脅迫7d后，分別對棉株噴施清水（W） 200mg?L^-1 水楊酸（salicylic acid，SA）和 20mg?L^-1 縮節(jié)胺（mepiquatchloride，DPC）。噴施處理后3d，測定鈴殼中谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetate transaminase，GOT）、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（glutamatepyruvateaminotransferase，GPT）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）、硝酸還原酶（nitratereductase，NR）、肽酶和蛋白酶等氮代謝關(guān)鍵酶活性及可溶性蛋白含量和游離氨基酸含量?！窘Y(jié)果】高溫干旱脅迫會抑制供試品種鈴殼中Bt蛋白的表達(dá);SA和DPC處理可緩解該抑制效應(yīng)，SA和DPC處理下Bt蛋白含量顯著高于各脅迫條件下W處理，其SA處理下Bt蛋白含量增幅更大，但最終Bt蛋白含量仍低于未脅迫處理（CK）。2021年SA和DPC處理下SK-1的Bt蛋白含量較W處理分別提高51.3%～104.0% 和 22.0%～85.4%;2（ 022年提高 14.7%～91.1% 和 4.5%～67.8% 。2021年SA和DPC處理下SK-3的Bt蛋白含量較W處理分別提高 46.4%～98.3% 和 22.9%～60.4%， 2022年分別提高 18.8%～77.4% 和14.6%～57.6% 品種間比較，SK-1對SA和DPC的響應(yīng)更為顯著，其Bt蛋白含量增幅高于SK-3。生理機(jī)制研究表明，SA和DPC處理顯著提高了SK-1和SK-3的GPT、GOT、GOGAT和NR的活性和可溶性蛋白含量，顯著降低了游離氨基酸含量和肽酶、蛋白酶活性。與W處理相比，2021年SA和DPC處理下SK-1的GOT活性提高 70.3%～104.2% 和 36.7%～61.9% ，GPT活性提高 58.2%～231.2% 和 27.7%～88.9% ，GS活性提高167.9%～197.3% 和 79.7%～139.4%， NR活性提高 22.4%～53.6% 和 7.6%～42.8% ，可溶性蛋白含量提高11.3%～40.6% 和 7.5%～20.3% ，游離氨基酸含量降低 15.6%～23.2% 和 6.3%～14.1% ，蛋白酶活性降低 5.5% ～13.5% 和 2.7%～10.5% 。2022年SK-1各指標(biāo)的變化趨勢與2021年趨勢一致。2年試驗(yàn)中，SK-3表現(xiàn)與SK-1相似?？傮w上SA對以上指標(biāo)的作用效果優(yōu)于 DPC 逐步回歸分析表明，NR活性、氨基酸游離含量和GS活性是反映調(diào)節(jié)劑處理調(diào)控高溫干旱脅迫后Bt棉鈴殼殺蟲蛋白含量高低的關(guān)鍵性指標(biāo)。【結(jié)論】噴施SA和DPC能夠提高蛋白合成相關(guān)酶活性，降低蛋白酶和肽酶活性和游離氨基酸含量，主要通過增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成能力從而提高高溫干旱脅迫后Bt棉鈴殼中Bt蛋白含量;SA效果更好;這為抗蟲棉安全應(yīng)用提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

Abstract：Objective]Inordertoprovidetechnicalguidanceandatheoreticalbasisforthesafeapplicationofinsectresistant cotoniproduction，theeffectofexogenous growthregulatoroninsecticidalproteincontentofBtcotonanditsuderlying physiological mechanismunderhigh temperatureand drought stress were studied.[Methods]Thetransgenic insect-resistant cotoncultivarSikang1（SK-1）andhybridcultivarSikang3（SK-3）wereusedasexperimentalmaterials，thedailytemperature of 32°C and 75% field capacity were used as control，and the artificial climate chamber was subjected to different high temperature levels （ 34^°C and 38^°C ）and drought stress 50% and 60% field capacity） during the peak flowering period in 2021- 2022.After 7 days of stress， cotton plants were sprayed with water （W）， 200mg?L^-1 salicylic acid （SA），and 20mg?L^-1 （20 mepiquatchloride（DPC），respectively.Threedays later，thebollshells weresampled todetermine theactivitiesof glutamic oxaloacetate transaminase （GOT），glutamate pyruvate aminotransferase （GPT），glutamine synthetase （GS），glutamatesynthase （GOGAT），ntratereductase （NR），proteaseandotherkeyenzmes ofitrogen metabolism，aswellassolubleproteiadfree aminoacidcontent.[Results]HightemperatureanddroughtstressinhibitthecontentofBtproteinintheboll shellsof two testedvarieties，whiletreatmentswithSAandDPCcanaleviatethisinhibitoryeffect.TheBtproteincontentunderSAorDPC treatmentsissignificantlyhigherthanthatofWtreatmentundervariousstressconditions，withtheincreaseinSAtreatment being more pronounced.The Btproteincontentremains lower than thatunder thenon-stressedcontrol.In2O21，theBtprotein content in SK-1 treated with SA and DPC after heat and drought stresses increased by 51.3%-104.0% and 22.0%-85.4% ， respectively，compared with the W treatment.In 2022， the increase was 14.7% -91.1%and 4.5%-67.8% .In SK-3，the Bt protein content in 2021 increased by 46.4%-98.3% and 22.9% 60.4% under SA and DPC treatments after heat and drought stresses， respectively，compared with theW treatment.In 2022，the increase was 18.8% 業(yè) .77.4% and 14.6%-57.6% ，respectively.Among thevarieties，SK-1showedamoresignificantresponsetoSAandPC，withaigherincreaseinBtproteincontenthanatof SK-3.Physiologicalmechanismstudiesshowed thatSAandDPCtreatmentsafterheatanddrought stressessignificantly increasedtheactivitiesofGPT，GOT，GOGAT，andNR，as wellasthesoluble proteincontentinSK-1andSK-3.Theyalso significantlyreducedthefreeaminoacidcontent，peptidase，andproteaseactivities.ComparedwiththeWtreatmentin021，A and DPC treatments increased GOT activity in SK-1 by 70.3%-104.2% and 36.7% -61.9%，GPTactivityby 58.2%-231.2% and 27.7%88.9% ，GS activity by 167.9% -197.3%and 79.7%-139.4% ，NRactivity by 22.4%53.6% and 7.6%-42.8% ，soluble protein content by 11.3%40.6% and 7.5%-20.3% ，while free amino acid content decreased by 15.6%-23.2% and 6.3% 14.1% and protease activity decreased by 5.5% 13.5% and 2.7%-10.5% ，respectively.The trend of changes in the indicators of SK-1 in 2022 wasconsistent with that in2021.Inthetwo-year experiment，SK-3 showed similar performance to SK-1.Overal，the efctsof SAonthe above indicators were superior to thoseof DPC.Stepwiseregression analysis further indicated hat NR activity，freeaminoacidcontentandGSactivitywasakeyindex toeflctthecontentofinsectiidalproteininBtcotobol shellafter growth regulatortreatmentunder high temperature and drought stress.[Conclusion] Spraying SAandDPCcan enhance theactivityofenzymes related to protein synthesis，reduce theactivityof proteasesand peptidases，anddecrease the contentoffreeaminoacids.Theprimarymechanismis toenhance thecapacityof proteinsynthesis，therebyincreasing theBt proteinontet inthebollshellofBtcotonafterhightemperatureanddroughtstress.Aditionally，theeffectofSAwasbetter thanDPC.This provides theoreticaland practical guidance forthe safe application of insect-resistant cotton. Kevwords：high temperature： drought： Bt cotton： salicvlic acid： mepiquat chloride： nitrogen metabolism

轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt殺蟲晶體蛋白基因棉花（Bt棉）占我國棉花種植面積的 96%^[1-4] 。Bt棉的種植有效控制了棉鈴蟲發(fā)生，減少了殺蟲劑的使用，降低了田間用工需求和棉農(nóng)勞動(dòng)強(qiáng)度，使棉田生態(tài)和周邊環(huán)境得到明顯的改善5，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益和社會效益[67]。

雖然Bt棉在抗蟲性方面有很好的表現(xiàn)，但在生產(chǎn)中也暴露出諸多問題，主要表現(xiàn)為Bt蛋白的表達(dá)和抗蟲性不穩(wěn)定，存在“時(shí)空差異\"[8，即同一器官的不同生長發(fā)育階段和同一生長發(fā)育階段的不同器官的抗蟲性存在明顯差異。因極端天氣時(shí)常發(fā)生，在全球棉花主產(chǎn)國棉花花鈴期常出現(xiàn)極端高溫與干旱現(xiàn)象，造成Bt棉殺蟲蛋白含量和抗蟲性顯著下降，最終影響抗蟲效果和種植效益。常麗娟等研究發(fā)現(xiàn)，Bt棉殺蟲蛋白的表達(dá)量對生物脅迫反應(yīng)敏感，會使殺蟲蛋白表達(dá)量發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。進(jìn)一步的研究證實(shí)高溫和干旱等脅迫條件對Bt棉抗蟲蛋白表達(dá)有明顯的負(fù)面影響。陳德華等[]和夏蘭芹等[研究發(fā)現(xiàn)，在盛鈴期對Bt棉進(jìn)行 37°C 的高溫脅迫，棉花葉片中的殺蟲蛋白含量明顯降低，這表明在盛鈴期發(fā)生高溫會導(dǎo)致Bt蛋白表達(dá)水平下降。Martins等[12]和Rochester[3]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫易導(dǎo)致棉葉殺蟲蛋白表達(dá)量下降，并最終引起棉鈴蟲分布發(fā)生變化。在生產(chǎn)中種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉應(yīng)關(guān)注環(huán)境因素可能造成的不良影響。

噴施生長調(diào)節(jié)劑可提高Bt殺蟲蛋白含量，而縮節(jié)胺（mepiquatchloride，DPC）和水楊酸（sal-icylicacid，SA）可能是改善Bt棉殺蟲蛋白表達(dá)穩(wěn)定性的潛在選擇。鄭青松等[4研究發(fā)現(xiàn)DPC有利于緩解鹽漬對棉苗生長的抑制。Zhang等[15]進(jìn)一步證實(shí)了DPC可顯著調(diào)節(jié)Bt殺蟲蛋白含量。邢羽桐等[通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)DPC可顯著提高高溫干旱脅迫下Bt棉鈴殼中殺蟲蛋白含量，且主要是通過糖酵解途徑、檸檬酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)的。

SA即鄰羥基苯甲酸，是植物體內(nèi)的1種激素類物質(zhì)，屬于肉桂酸的衍生物[]。它作為植物內(nèi)源信號物質(zhì)，不僅影響植物的離子吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)、光合作用以及生長等生理生化過程，還參與調(diào)節(jié)植物的抗逆性[18-22]。研究表明，SA通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成以及激素信號傳導(dǎo)等，顯著提高植物對高溫和干旱脅迫的耐受性[23-25]。SA處理能夠緩解干旱脅迫對玉米根系生長的抑制作用，并通過調(diào)節(jié)代謝途徑增強(qiáng)植物的抗氧化能力[2。王佳玉研究發(fā)現(xiàn)SA能顯著緩解高溫下植物的熱損傷，參與調(diào)節(jié)植物響應(yīng)非生物脅迫等。在干旱條件下，噴施SA能緩解棉花因干旱脅迫受到的損傷[28]。SA已被證明能夠提高植物氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而增強(qiáng)植物對非生物脅迫的適應(yīng)能力[29-30]，這為本研究提供了理論基礎(chǔ)。

目前，關(guān)于SA和DPC等調(diào)節(jié)劑能否對高溫與干旱雙脅迫下Bt棉殺蟲蛋白含量產(chǎn)生影響的相關(guān)報(bào)道較少。鈴殼是棉鈴蟲等相關(guān)害蟲危害棉鈴時(shí)的首要取食部位，且棉鈴鈴殼中Bt蛋白含量越高，棉鈴蟲的取食和存活率越低3。本研究以高溫干旱逆境脅迫后的Bt棉鈴殼為材料，分析DPC、SA等生長調(diào)節(jié)劑對逆境脅迫后的Bt棉殺蟲蛋白表達(dá)的影響，為生產(chǎn)上抗蟲棉的安全種植提供技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1試驗(yàn)與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021—2022年在揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院氣候室進(jìn)行，以常規(guī)抗蟲棉品種泗抗1號（SK-1）和雜交抗蟲棉品種泗抗3號（SK-3）為材料。采用盆栽試驗(yàn)，所用盆缽直徑 40cm ，盆高 50cm ，每盆裝 20kg 過篩的砂壤土（取自大田試驗(yàn)田）。采用塑料穴盤育苗移栽方式種植，均于4月6日播種，出苗后41d，選擇長勢一致的二葉一心棉苗移栽至盆缽中，每盆1株，在移入人工氣候室前統(tǒng)一放置于室外，其他田間管理措施按當(dāng)?shù)氐母弋a(chǎn)栽培要求實(shí)施。

試驗(yàn)通過人工氣候室設(shè)置梯度溫度模擬溫度動(dòng)態(tài)變化。設(shè)置中度高溫（A1）、重度高溫（A2）和適宜溫度3個(gè)水平，將每日高溫時(shí)段 （13：00- 16：00）的溫度分別設(shè)為 34^°C，38^°C 和 32° （表1）。土壤水分含量設(shè)3個(gè)水平，分別為田間最大持水量的 50% （B1） 60% （B2）和 75% 。以適宜溫度（ 32° ）和田間最大持水量的 75% 為對照（CK）。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20盆棉花。盛花期（7月20日）控制澆水，并標(biāo)記果枝內(nèi)圍當(dāng)日花。當(dāng)土壤水分含量到達(dá)預(yù)期水分指標(biāo)后立即將盆栽棉株移入人工氣候箱進(jìn)行高溫處理，處理過程中使用WET土壤三參數(shù)速測儀（Delta-T公司，英國）監(jiān)測土壤水分含量，用稱量法控制土壤水分含量，于每日7：00、12：00和18：00監(jiān)測土壤水分含量，當(dāng)土壤水分低于設(shè)計(jì)值時(shí)進(jìn)行定量補(bǔ)水。脅迫處理7d后，將溫度和土壤水分含量恢復(fù)至 32^°C 和田間最大持水量的 75% ，分別用 20mg?L^-1DPC?200mg?L^-1SA 和清水（W）噴施棉株葉片。噴施處理后3d，取各棉株 5～8 個(gè)標(biāo)記的內(nèi)圍鈴，帶回實(shí)驗(yàn)室后用無菌刀將鈴殼與棉鈴分離，液氮冷凍后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2 測定項(xiàng)目及方法

采用酶聯(lián)免疫分析法[32測定鈴殼中Bt殺蟲蛋白含量，試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；分別采用考馬斯亮藍(lán)法[32]、抗壞血酸和芘三酮比色法[33]測定可溶性蛋白（solubleprotein，SP）含量、游離氨基酸含量，進(jìn)而計(jì)算蛋白酶和肽酶活性[34。谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（glutamicoxaloacetatetransaminase，GOT）谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（glutamatepyruvateaminotransferase，GPT）[3]、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、谷氨酸合成酶（glutamatesynthase，GOGAT）和硝酸還原酶（nitratereductase，NR）活性測定分別見參考文獻(xiàn)[35-37]。

表1不同處理下人工氣候室24h的溫度設(shè)置

Table1The temperaturesettings in oftheartificialclimatechamberunderdifferenttreatments

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用MicrosoftExcel2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并制作表格，利用IBMSPSSStatistics25進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，采用Duncan's多重比較法檢驗(yàn)處理間的差異顯著性（ Plt;0.05 ），試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值；使用Origin制作相關(guān)性分析熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1SA和DPC對鈴殼殺蟲蛋白含量的影響

2年試驗(yàn)中SA和DPC處理下鈴殼Bt殺蟲蛋白含量變化趨勢基本一致（表2）。與W處理相比，脅迫后噴施SA與DPC均可顯著提高不同脅迫處理后SK-1和SK-3鈴殼中殺蟲蛋白含量，且SA處理后鈴殼中殺蟲蛋白含量的增幅更大。但是脅迫后噴施SA或DPC鈴殼殺蟲蛋白的含量仍顯著低于未經(jīng)脅迫噴施清水的處理。2021年，脅迫后噴施SA和DPC，SK-1鈴殼中殺蟲蛋白含量比W處理提高 51.3%～104.0% 和 22.0% ～85.4% ，SK-3鈴殼中殺蟲蛋白含量提高 46.4%～ 98.3% 和 22.9%～60.4% 。2022年，與W處理相比，SA和DPC處理下SK-1鈴殼中Bt蛋白含量分別提高 14.7%～91.1% 和 4.5%～67.8% ，而SK-3分別提高 18.8%～77.4% 和 14.6%～57.6% 。

2.2 SA和DPC對氮代謝的影響

2.2.1對SP含量的影響。與W處理相比，高溫干旱脅迫后噴施SA與DPC可顯著提高鈴殼中SP含量，且噴施SA處理的增加幅度較大，2年試驗(yàn)結(jié)果一致（表3）。2021年，高溫干旱脅迫后噴施SA和DPC，SK-1鈴殼中SP含量分別比W處理提高 11.3%～40.6% 和 7.5%～20.3% ，而SK-3則提高 13.8%～30.3% 和 4.0%～17.7% 。2022年脅迫后噴施SA、DPC，SK-1鈴殼中SP含量分別比W處理高 15.1%～29.1% 和 13.9%～ 18.0% ，而SK-3分別高 14.8%～27.9% 和 11.5%～ 15.9% 。在中度高溫（A1）脅迫后噴施SA，2個(gè)品種鈴殼中SP含量與CK條件下W處理無顯著差異或顯著提高，表明噴施SA可以完全解除中度高溫和干旱脅迫對鈴殼中SP積累的抑制效應(yīng)。品種間相比，噴施調(diào)節(jié)劑后SK-1鈴殼SP含量增幅大于SK-3。

2.2.2對游離氨基酸含量的影響。由表4可知，與W處理相比，2年試驗(yàn)中脅迫后噴施生長調(diào)節(jié)劑可顯著降低鈴殼中游離氨基酸含量。相較W處理，2021年噴施SA和DPC使SK-1鈴殼中游離氨基酸含量降低了 15.6%～23.3% 和 6.3%～ 14.2% ，SK-3則降低了 7.3%～10.6% 和 5.5%～ 6.6% ;2022年，SK-1在噴施SA、DPC處理下的鈴殼中游離氨基酸含量降低了 20.0%～22.6% 和15.8%～18.5% ，而SK-3分別降低了 14.9%～ 18.0% 和 10.8%～12.5% 。噴施不同的調(diào)節(jié)劑，SK-1和SK-3鈴殼中游離氨基酸含量下降程度不同，其中SA處理下2個(gè)棉花品種鈴殼中游離氨基酸含量下降幅度更大。品種間比較，噴施調(diào)節(jié)劑處理后SK-1鈴殼中游離氨基酸含量下降幅度大于SK-3。

Table2Effects of SAand DPC on insecticidal protein content in boll shell after stress （ng·g-1）

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

Note：Different letersbehindthe numbers inthesamecolumn indicate significantdiferenceattheO.O5 probabilitylevel.

表2SA和DPC對脅迫后鈴殼中殺蟲蛋白含量的影響

表3SA和DPC對脅迫后鈴殼中SP含量的影響

Table3EffectsofSAand DPConSPcontentinboll shellafterstress （ng·g-1）

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Different lettrs behindthe numbersin thesamecolumn indicate significant differenceattheO.O5probability level

2.2.3GOT和GPT活性變化。脅迫后噴施生長調(diào)節(jié)劑均可顯著提高鈴殼中GOT活性（表5）和GPT活性（表6），2年試驗(yàn)的趨勢基本一致，且噴施SA效果更好。2021年，脅迫后噴施SA、DPC，SK-1鈴殼中GOT活性較W處理分別提高70.3%～104.2% 和 36.7%～61.9% ，SK-3則分別增加 54.6%～81.3% 和 30.1%～49.4%;202 2年，噴施SA、DPC處理下SK-1鈴殼中GOT活性比W處理分別提高 20.0%～39.3% 和 14.0% ～30.3% ，SK-3則分別增加 26.0%～37.0% 和 36.8%～ 51.2% 。2021年，脅迫后噴施SA、DPC，SK-1鈴殼中GPT活性較W處理分別提高 58.2%～231.3% 和 27.7%～88.9% ，SK-3則分別增加 74.3% ～152.4% 和 28.6%～79.2%;2022 年，噴施SA、DPC處理下SK-1鈴殼中GPT活性比W處理分別提高 48.7%～134.1% 和 26.9%～116.2% ，SK-3則分別增加 25.8%～112.2% 和 23.7%～94.2% 脅迫后噴施SA、DPC，SK-1鈴殼中GOT和GPT活性增幅大于SK-3。

表4SA和DPC對脅迫后鈴殼中游離氨基酸含量的影響

Table4 Effects of SA and DPC on free amino acid content inboll shell after stress （mg?g^-1）

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：DifferentletersbehindthenumbersinthesamecolumnindicatesignificantdiffrenceattheO.O5probabilitylevel

2.2.4對GS活性的影響。表7表明，與W處理相比，脅迫后噴施SA與DPC可顯著提高鈴殼中GS活性，且2021年的趨勢與2022年基本一致。2021年噴施SA、DPC后，SK-1鈴殼中GS活性比W處理分別提高 167.9%～197.3% 和 79.7%～ 139.4% ，SK-3鈴殼中GS活性分別提高 94.5%～ 208.7% 和 37.3%～143.1%;2022 年噴施SA、DPC后，SK-1鈴殼中GS活性比W處理分別提高

24.3%～135.7% 和 16.9%～102.4% ，SK-3分別提高 11.5%～67.7% 和 6.0%～18.7% 。其中，SA處理后SK-1和SK-3鈴殼中GS活性的增幅更大；SK-1鈴殼中GS活性增幅大于SK-3。

2.2.5對GOGAT活性的影響。GOGAT活性變化與GS活性變化相似，脅迫后噴施生長調(diào)節(jié)劑可顯著恢復(fù)2個(gè)棉花品種鈴殼中的GOGAT活性（表8），其中SA處理的增幅最大。2年試驗(yàn)中，在中度高溫（A1）條件下噴施SA可以完全恢復(fù)GOGAT活性甚至超過未脅迫處理（2021年SK-1除外）。噴施SA，SK-1的GOGAT活性較W處理增幅整體大于SK-3，但DPC處理在不同年份表現(xiàn)不同。

表5SA和DPC對脅迫后鈴殼中GOT活性的影響

Table5EffectsofSAandDPConGOTactivityinbollshellafterstress （μmol·g-1·h-1）

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：DiffrentletersbehindthenumbersinthesamecolumnindicatesignificantdiferenceattheO.O5probabilitylevel.

表6SA和DPC對脅迫后鈴殼中GPT活性的影響

able6EffectsofSAand DPConGPTactivity inboll shell afterstress （μmol·g-1·h-1）

注：每列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Differentletersbehindthenumbersinthesamecolumn indicatesignificant differenceattheO.O5probabilitylevel

表7SA和DPC對脅迫后鈴殼中GS活性的影響

Table7EffectsofSAandDPConGSactivity inbollshellafterstress （U·g-1·min-1）

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Diffrentlettersbehindthenumbers inthesamecolumnindicatesignificantdiferenceattheO.O5probabilitylevel.

2.2.6對NR活性的影響。與W處理相比，2年試驗(yàn)中脅迫后噴施生長調(diào)節(jié)劑可以顯著提高鈴殼中NR活性（表9）；2021年，噴施SA、DPC后SK-1鈴殼中NR活性分別比W處理提高 22.4%～ 53.6% 和 7.6%～42.8% ，SK-3則分別提高 30.2%～ 37.8% 和 9.8%～22.2%;2 022年，噴施SA、DPC后，SK-1鈴殼中NR活性分別提高 17.0%～50.7% 和 12.9%～38.4% ，SK-3的分別提高 12.2%～ 36.1% 和 9.1%～27.6% 。不同調(diào)節(jié)劑的效果不同，SA處理后鈴殼中NR活性的增幅更大。噴施調(diào)節(jié)劑后SK-1鈴殼中NR 活性增幅大于SK-3。

2.2.7對蛋白酶活性的影響。由表10可知，脅迫后噴施生長調(diào)節(jié)劑可顯著降低鈴殼蛋白酶活性，且噴施SA后蛋白酶活性降低幅度更大。與W處理相比，2021年噴施SA、DPC使SK-1鈴殼中蛋白酶活性分別降低 5.5%～13.5% 和 2.7%～10.5% 而 SK-3分別降低 9.6%～12.4% 和 5.5%～7.8% 2022年噴施SA、DPC使SK-1鈴殼中蛋白酶活性分別降低 8.7%～11.6% 和 6.8%～9.3% ，而SK-3分別降低 4.4%～10.5% 和 1.0%～8.2% 。

2.2.8對肽酶活性的影響。肽酶活性變化與蛋白酶活性變化類似。與W處理相比，脅迫后噴施生長調(diào)節(jié)劑可顯著降低鈴殼肽酶活性（表11），SA處理后肽酶活性降幅更大。品種間比較，高溫干旱脅迫后噴施調(diào)節(jié)劑，整體上SK-1的肽酶活性降幅大于SK-3。

2.3鈴殼各生理指標(biāo)與殺蟲蛋白含量的關(guān)系

利用2021年的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖1）表明，鈴殼中GOT、GPT、GS、GOGAT、NR活性及SP含量與Bt殺蟲蛋白含量呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，而游離氨基酸含量、蛋白酶活性和肽酶活性則與殺蟲蛋白含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

高溫干旱脅迫后噴施SA和DPC能提高NR、GOGAT等酶的活性和SP含量，提高Bt殺蟲蛋白的表達(dá)量。以殺蟲蛋白含量為因變量（Y），SP含量 （X₁） 、游離氨基酸含量 活性（ X_3， 、GPT活性 （X₄）、GS 活性 （X₅） GOGAT活性（X₆ 、NR活性 （X₇） 、蛋白酶活性 （X₈） 和肽酶活性L （X₉ ）為自變量進(jìn)行逐步回歸分析，2021年 X₇ ）X₂，X₅"和 X₁"對Bt殺蟲蛋白含量效應(yīng)顯著；2022年 X₂，X₅，X₇"對殺蟲蛋白含量效應(yīng)顯著（表12）。2年中， X₂，X₅，X₇"均顯著影響鈴殼Bt殺蟲蛋白含量，說明這3個(gè)指標(biāo)是反映SA和DPC調(diào)控高溫干旱脅迫后Bt棉鈴殼殺蟲蛋白含量高低的關(guān)鍵指標(biāo)。

表8SA和DPC對脅迫后鈴殼中GOGAT活性的影響

Table8Effectsof SAand DPC onGOGATactivityinboll shellafterstress （μmol·g-1·h-1）

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Different letersbehindthe numbersinthesamecolumn indicate significant diffrenceattheO.O05 probability level

表9SA和DPC對脅迫后鈴殼中NR活性的影響

Table9Effects ofSAand DPCon NRactivity in boll shell afterstress （μg·g-1·h-1

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Different letersbehindthe numbers in thesamecolumn indicate significant differenceattheO.05 probabilitylevel

表10SA和DPC對脅迫后鈴殼蛋白酶活性的影響

Table10 Effects of SAand DPConproteaseactivity inbollshellafterstress （μg·g-1·h-1）

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Differentletersbehindthenumbersinthesamecolumn indicatesignificantdiferenceat theO.O5probabilitylevel.

表11SA和DPC對脅迫后鈴殼肽酶活性的影響

Table11Effects of SAand DPC onpeptidase activity in bollafter stress （[

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Note：Different letersbehindthe numbers in thesamecolumn indicate significant differenceattheO.05 probabilitylevel

Bt protein，Bt殺蟲蛋白含量;SP，可溶性蛋白含量;aa，游離氨基酸含量;GOT，谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶活性;GPT，谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶活性;GS，谷氨酰胺合成酶活性;GOGAT，谷氨酸合成酶活性;NR，硝酸還原酶活性;Protease，蛋白酶活性；Pepitdase，肽酶活性。*和 ^** 分別表示在0.05和0.01水平顯著相關(guān)。

圖1鈴殼殺蟲蛋白含量與氮代謝主要物質(zhì)含量和關(guān)鍵酶活性的相關(guān)性（2021年）

Btprotein，Btiscticidalproteinotet;S，olubleproteiotent;afriocidotent;GOT，lutaicloac etatetransaminaseactivity;GPT，glutamatepyuvateaminotransferaseactivity;GS，glutaminesynthetaseactivity;GOGAT，glutamate synthase activity;NR，nitrate reductase activity.*and ^** represent significant correlationat the O.O5 and O.O1 probability levels，respectively.

Fig.1Correlation between insecticidal protein content and content of main substances in nitrogen metabolismand key enzyme activities in boll shell （2021）

3討論

3.1SA和DPC可顯著緩解高溫干旱脅迫對Bt棉殺蟲蛋白含量的抑制效果

研究發(fā)現(xiàn)高溫與干旱雙重脅迫會降低Bt棉殺蟲蛋白含量，且其下降幅度隨高溫干旱的持續(xù)延長而逐漸加大[38。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫干旱導(dǎo)致鈴殼中Bt殺蟲蛋白含量下降，且脅迫越嚴(yán)重，Bt蛋白的含量越低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高溫和干旱脅迫終止后，噴施SA或DPC可以顯著提高鈴殼的殺蟲蛋白含量，緩解高溫干旱脅迫對棉花Bt蛋白含量的抑制效果，其中SA的表現(xiàn)更明顯。外源SA或DPC可緩解高溫干旱等非生物逆境對棉花Bt蛋白表達(dá)的抑制效果，這與Liu等3的結(jié)果一致。這可能是由于高溫脅迫使正常蛋白質(zhì)合成受阻、分解加劇，細(xì)胞膜完整性被破壞；而外源調(diào)節(jié)劑可以通過提高植物的抗氧化能力、調(diào)節(jié)氮代謝過程、穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)減輕高溫對植物的傷害。

表12逐步回歸分析

Table12 Stepwiseregressionanalysis

注：Y，Bt蛋白含量； X₇ ，硝酸還原酶活性； X₂ ，游離氨基酸含量； X₅，GS 活性： ∴X₁，SP 含量。

Note：Y，Bt protein content; X₇ ，nitrate reductase activity; X₂， free amino acid content; X₅， glutamine synthetase activity， X₁ soluble protein content.

但噴施SA或DPC并不能將Bt蛋白含量恢復(fù)到未經(jīng)高溫干旱脅迫前的水平。此外，在研究中發(fā)現(xiàn)不同的調(diào)節(jié)劑對不同棉花品種的作用效果不同，SA和DPC對常規(guī)種泗抗1號的作用效果比對雜交種泗抗3號的作用效果更好。有效提高逆境下Bt棉殺蟲蛋白含量的調(diào)節(jié)劑種類/劑量還有待進(jìn)一步篩選和研究。

生產(chǎn)上若遇高溫干旱天氣，可及時(shí)噴施SA和DPC等調(diào)節(jié)劑以提高Bt棉的抗逆性。若發(fā)生中度高溫干旱后，可噴施 200mg?L^-1 SA促進(jìn)Bt蛋白的表達(dá)、提高棉花的抗蟲性，減少殺蟲劑的用量。但發(fā)生 38^°C 以上重度高溫，噴施SA的效果顯著降低；應(yīng)加強(qiáng)田間蟲情監(jiān)測，適時(shí)噴施殺蟲劑以減少棉田蟲害。在預(yù)測可能發(fā)生高溫干旱的年份，應(yīng)選擇抗逆性強(qiáng)的常規(guī)棉品種，達(dá)到減少農(nóng)藥施用、降低成本的目的。

3.2DPC、SA影響B(tài)t棉氮代謝的生理過程，從而影響殺蟲蛋白的表達(dá)

氮代謝是植物重要的生物生理活動(dòng)，需要NR、GS和GOGAT等關(guān)鍵酶的參與[3]。Bt棉氮代謝強(qiáng)度與殺蟲蛋白含量密切相關(guān)[39-42]。王桂霞[43]研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫使蕾鈴中游離氨基酸含量顯著增加，SP含量和GPT活性顯著下降，蛋白酶活性明顯提高，Bt蛋白含量顯著下降。陳德華等[10]研究發(fā)現(xiàn)土壤水分虧缺導(dǎo)致鈴殼中氮代謝關(guān)鍵合成酶（NR和GPT）活性降低，分解酶（肽酶和蛋白酶）活性升高，殺蟲蛋白含量下降。本研究發(fā)現(xiàn)在高溫干旱脅迫終止后，噴施調(diào)節(jié)劑SA和DPC可在一定程度上提高鈴殼中蛋白質(zhì)合成相關(guān)酶（NR、GOT、GPT、GS、GOGAT）活性和可溶性蛋白含量，降低蛋白質(zhì)分解相關(guān)的蛋白酶和肽酶活性及游離氨基酸含量。相關(guān)性分析表明，鈴殼中，SP含量和GOT、GPT、GS、GOGAT、NR活性等與殺蟲蛋白含量顯著或極顯著正相關(guān)，而游離氨基酸含量、蛋白酶和肽酶活性則與Bt蛋白含量顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，這與劉媛媛44的研究結(jié)果基本一致。

逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)劑主要通過影響B(tài)t棉鈴殼中NR活性、游離氨基酸含量和GS活性來提高殺蟲蛋白的表達(dá)。NR是植物氮代謝的限速酶，催化 NO₃? 還原為 NO₂^- ，是植物體內(nèi) NO₃^- 同化的限速步驟，其活性高低是衡量植物氮吸收和同化能力、蛋白質(zhì)合成能力的重要指標(biāo)[45]；而Bt棉氮代謝強(qiáng)度與殺蟲蛋白含量密切相關(guān)[3943]。本研究認(rèn)為逆境脅迫后，SA和DPC主要通過促進(jìn)Bt棉蛋白質(zhì)合成能力進(jìn)而提高殺蟲蛋白含量，降低蛋白質(zhì)分解能力則為次要途徑。

4結(jié)論

噴施水楊酸和縮節(jié)胺可提高鈴殼GPT、GOT、GOGATNR等酶的活性和可溶性蛋白含量，降低游離氨基酸含量、肽酶和蛋白酶活性。逐步回歸分析表明，NR活性、游離氨基酸含量和GS活性對Bt蛋白含量的影響最顯著。在生產(chǎn)和育種中，可以選用盛鈴期游離氨基酸含量、NR活性和GS活性較強(qiáng)的品種或通過栽培技術(shù)提高其活性/含量，從而提高Bt棉的殺蟲蛋白含量，增強(qiáng)抗蟲性，減少農(nóng)藥使用，節(jié)省人力物力。若遇 34^°C 以上高溫、土壤含水量低于田間最大持水量 60% 的干旱，可及時(shí)噴施 200mg?L^-1 水楊酸以提高逆境下Bt蛋白含量。研究結(jié)果可為干熱災(zāi)害頻發(fā)情況下的抗蟲棉種植管理提供指導(dǎo)。

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