miR394a-FBX6模塊調(diào)控棉花黃萎病抗性

【方法】利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR）分析ghr-miR394a和GhFBX6的表達(dá)模式。在棉花中瞬時超表達(dá)ghr-miR394a，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)在棉花中分別瞬時沉默ghr-miR394a和GhFBX6，研究二者在抗黃萎病中的功能。利用 5^′ 端RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速擴(kuò)增（5'-RNAligase-mediated rapid amplificationof cDNA ends，5'RLM-RACE）技術(shù)并結(jié)合熒光素酶（luciferase，LUC）報告系統(tǒng)，分析 ghr-miR394a對GhFBX6的調(diào)控作用。【結(jié)果】qRT-PCR表明，ghr-miR394a在棉花葉片中的表達(dá)量較高，其次為莖和根。與清水處理相比，大麗輪枝菌侵染可顯著降低根中g(shù)hr-miR394a的表達(dá)量，顯著提高GhFBX6的表達(dá)量。與對照植株相比，在棉花中瞬時沉默ghr-miR394a導(dǎo)致病情指數(shù)、病株率顯著降低，莖段恢復(fù)培養(yǎng)后菌絲積累量較少，棉花對黃萎病的抗性增強(qiáng)；而瞬時過表達(dá)ghr-miR394a或瞬時沉默GhFBX6則會降低棉花對大麗輪枝菌的抗性，具體表型為二者的病情指數(shù)和病株率均顯著升高，過表達(dá)ghr-miR394a的莖段恢復(fù)培養(yǎng)后菌絲積累量較多，GhFBX6沉默棉株莖稈的維管束褐變程度加重。5'RLM-RACE和LUC報告系統(tǒng)結(jié)果表明，ghr-miR394a在轉(zhuǎn)錄后水平抑制GhFBX6表達(dá)。【結(jié)論】ghr-miR394a可靶向抑制GhFBX6的表達(dá)，且ghr-miR394a和GhFBX6在棉花黃萎病抗性響應(yīng)中分別發(fā)揮負(fù)調(diào)控和正調(diào)控功能。

ThemiR394a-FBX6module regulatescotton resistance to Verticilliumwilt

Liao Chanjuan12，Li Dan12， Zhao Wenjun3，Wu Qi^1，2 ，Yin Xiujuan2， Zhong Guimail2， Wang Zhi3，Hu Guangl，3* Zhai Junfeng3*

（1．ShaoyangPolytechnc，Shaoyang，Hunan422o4，China;2.TechnicalInovationCenterforDevelopmentandIustrial ApplicationofMelonGermplasmResources，Shaoyang，Hunan4220o4，China;3.ChineseAcademyofQualityand Ispectionamp; Testing，Beijing100176，China）

Abstract：[Objective]Thisresearchaimedtoinvestigatethefunctionoftheghr-miR394-GhFBX6moduleincotonresistance to Verticillum wiltandtoprovidecandidategenes forcottondisease-resistantbreeding.Methods]Theexpressionpattrnsof ghr-miR394a and GhFBX6 were analyzedusing quantitativereal-time polymerasechain reaction （qRT-PCR）.Virus-induced genesilencing（VIGS）was employed to transientlysilenceghr-miR394aand GhFBX6 individualy，andincombination withthe transientoverexpressonofghr-miR394aincoton，toinvestigatetheirrolesinresistanceto Verticillumwilt.Therglatory efect of ghr-miR394a on GhFBX6 wasanalyzed using the 5'-RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends （ 5^′ RLM-RACE）technique combined with a luciferase （LUC）reporter system.[Results]qRT-PCR analysis revealed that ghrmiR394awas highlyexpressed incotonleaves，folowedbystemsandroots.Comparedwiththewater treatment，inoculation withVertilliumdahliaesignificantlydownregulatedtheexpressionlevelof ghr-miR394ainrots，whilesignificantly upregulated theexpresionlevelofGhFBX6.Comparedwithcontrolplants，transientsilencingofghr-miR394aincoton resultedinasignificantlyreduceddiseaseindexandrateof diseased plantsandless fungal biomassaccumulation in stemsegments duringrecoveryculture，indicatingenhancedresistanceto Verticiliumwilt.Incontrast，transientoverexpreioof ghr-miR394a or silencing of GhFBX6 led to decreased resistance to V. dahliae，asevidencedbyasignificantly higherdisease index andrateofdiseased plants，increased fungal biomassaccumulationin stemsegmentsof ghr-miR394a-overexpressing plants，and more severe browningofvascularbundlesin GhFBX6-silencedplants.The results from5'RLM-RACEandthe LUC reportersystemdemonstratedthatghr-miR394ainhibitstheexpresionof GhFBX6atthepost-transcriptional level. [Conclusion]ghr-miR394a targetsand inhibitstheexpressionof GhFBX6.ghr-miR394aand GhFBX6 playnegativeand positive regulatory roles， respectively， in the cotton response to Verticillium wilt.

Keywords： miR394; GhFBX6; cotton; Verticillium wilt; defense; virus-induced gene silencing

棉花是紡織工業(yè)的核心原料，為人們提供優(yōu)質(zhì)的天然纖維。棉花及其制品應(yīng)用廣泛，深受消費(fèi)者喜愛。然而，病蟲害常常對棉花生產(chǎn)造成影響，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，特別是由大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）引起的黃萎?。╒erticilliumwilt）是影響棉花生產(chǎn)力的主要因素之一。大麗輪枝菌通過入侵棉花根部，寄生于棉株內(nèi)，導(dǎo)致棉花病變，進(jìn)而顯著降低棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)[2]。當(dāng)前，物理和化學(xué)方法對黃萎病的防治效果甚微。因此，挖掘抗病基因并培育抗病品種是最有效的防治手段之一。

微小RNA（microRNA，miRNA）作為重要的調(diào)控分子，在植物的生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。miRNA通過在轉(zhuǎn)錄后水平切割mRNA或在翻譯水平抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)，從而影響植物的各種生理生化過程3。例如，過表達(dá)miR172會降低煙草對煙草花葉病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）的抗性，而沉默miR172則會增強(qiáng)煙草對TMV的抗性[4。玉米miR1690過表達(dá)會增加籽粒大小和粒重。Hu等@研究發(fā)現(xiàn)棉花miR319c-MYB33模塊可以調(diào)節(jié)株高與黃萎病抗性之間的平衡。因此，闡明植物miRNA及其靶基因在復(fù)雜環(huán)境中參與抗性響應(yīng)的分子機(jī)制，將有助于更有效地提高作物抗性和產(chǎn)量。

目前，已有多項研究報道了棉花miRNA在生長發(fā)育以及逆境脅迫響應(yīng)中的重要作用[-8。例如，ghr-miR414c通過靶向GhFSD1參與棉花對鹽脅迫的響應(yīng)[9]。Zhan等[10]研究表明miR164-GhCUC2模塊在棉花側(cè)枝發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用。Hu等[]研究發(fā)現(xiàn)miR171a-SCL6模塊調(diào)控棉花黃萎病抗性。miR394常常通過調(diào)控F-box基因參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、對非生物和生物脅迫的響應(yīng)[12-5]。玉米miR394通過調(diào)控2個編碼F-boX蛋白的基因ZmLCR1和ZmLCR2，參與干旱脅迫響應(yīng)[13]。在擬南芥中過表達(dá)番茄miR394會降低轉(zhuǎn)基因植株對灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）的抗性[5]。馬鈴薯miR394 靶向抑制StLCR負(fù)調(diào)控對馬鈴薯晚疫?。≒hytophthora infestans）的抗性[14]。然而，miR394和F-box蛋白在棉花中的功能及其作用機(jī)制仍不清楚。

先前的研究表明，棉花接種大麗輪枝菌后ghr-miR394a顯著下調(diào)表達(dá)，表明其可能參與棉花黃萎病抗性反應(yīng)，降解組測序結(jié)果顯示GhF-BX6是ghr-miR394a的靶基因[。本研究進(jìn)一步利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitativereal-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)分析了ghr-miR394a和GhFBX6在大麗輪枝菌誘導(dǎo)下的表達(dá)模式；通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-inducedgenesilencing，VIGS）技術(shù)初步驗證ghr-miR394a正調(diào)控棉花黃萎病抗性，GhF-BX6負(fù)調(diào)控棉花黃萎病抗性，且ghr-miR394a在轉(zhuǎn)錄后水平抑制GhFBX6表達(dá)，研究結(jié)果可為棉花抗黃萎病育種提供候選基因。

1材料與方法

1.1植物材料及生長環(huán)境

供試材料包括陸地棉（Gossypiumhirsutum）品種Jihe713和本氏煙（Nicotianabenthamiana），均由中國科學(xué)院微生物研究所吳家和研究員贈送。植物材料均在光照培養(yǎng)箱（PGX-250A，寧波賽福實驗儀器有限公司）中培養(yǎng)。陸地棉生長環(huán)境：溫度為 28^°C ，相對濕度為 60%，16h 光照 18h 黑暗；本氏煙生長環(huán)境：溫度為 23^°C ，相對濕度為 50% ，16h光照 /8h 黑暗。

1.2 載體、菌株與試劑

煙草脆裂病毒（tobacco rattlevirus，TRV）載體pTRV1、pTRV2和pTRV2e，農(nóng)桿菌GV3101和大麗輪枝菌V991由中國科學(xué)院微生物研究所吳家和研究員贈送。GeneRacer試劑盒購于ThermoFisherScientific公司，其他分子試劑（包括Top Green qPCR SuperMix、T1 Cloning Kit、T4DNALigase等）均購于北京全式金生物科技股份有限公司。

1.3 qRT-PCR

總RNA提取和qRT-PCR參照Hu等的方法。2葉期取棉花的根、莖、葉，測定根中g(shù)hr-miR394a和ghr-miR394b的相對表達(dá)量，以及ghr-miR394a在根、莖、葉中的相對表達(dá)量。2葉期，將棉花幼苗根部浸沒在V991懸浮液（菌落總數(shù) 1×10⁶?mL^-1 ）中1h，取處理后0d、1d、4d、7d，10d，13d 棉花幼苗根系，分析ghr-miR394a、GhFBX6的表達(dá)模式。VIGS處理棉花后，取新長出的葉片RNA用于分析基因的相對表達(dá)水平。所有試驗均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。陸地棉5.8S和UBI3基因分別用于miRNA和其他基因的內(nèi)參基因。本研究中所用的引物序列見附表1。

1.4生物信息學(xué)分析

棉花GhMIR394a_A01.2、GhMIR394b_A05和GhFBX6的序列均來源于先前的研究[16。其他6個植物MIR394序列均來源于PmiREN數(shù)據(jù)庫（https：//www.pmiren.com），包括擬南芥AtMIR394（PmiREN000714）、大豆GmMIR394（PmiREN034542）、油菜BraMIR394（PmiREN-002515）水稻OsMIR394（PmiREN014313）小麥TaMIR394（PmiREN025875）和玉米ZmMIR394（PmiREN023404）。植物FBX6氨基酸序列來源于JGI數(shù)據(jù)庫（https：//jgi.doe.gov），包括水稻OsF-BX6（LOC_Os01g69940）大豆GmFBX6（Glyma.18G005400）小麥TaFBX6（Traes_3AL_63EBED1DE）、玉米ZmFBX6（Zm00001eb364210）和油菜BrFBX6（Brara.I03023）。使用MEGA5.2軟件的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，Bootstrap值設(shè)定為1000，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值。

用DNAMAN軟件預(yù)測ghr-MIR394a_A01.2（ghr-miR394a前體）的二級結(jié)構(gòu)。利用expasy在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org）預(yù)測GhFBX6蛋白的相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等理化參數(shù)。

1.55'端RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速 擴(kuò)增 （5'-RNA ligase-mediated rapidamplification ofcDNA ends， 5'-RLM RACE）

按照GeneRacer試劑盒說明書操作。首先，提取2葉期棉花葉片總RNA，使用T4RNA連接酶在RNA的5'末端加上1個接頭序列，逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。然后進(jìn)行5'RACE，將得到的PCR產(chǎn)物純化后亞克隆到T載體中，通過測序分析ghr-miR394a對GhFBX6基因mRNA精確的切割位點(diǎn)。

1.6載體構(gòu)建

短串聯(lián)靶標(biāo)模擬物（short tandem target mimic，STTM）常用于沉默miRNA 表達(dá)[6，]。分別將GhMIR394a_A01.2序列和STTM394a（附表1）連接至pTRV2e載體，構(gòu)建用于過表達(dá)ghr-miR394a（pTRV2e-OE394a）和沉默ghr-miR394a（pTRV2e-ST394a）的載體（附圖1）。為沉默GhFBX6，將300bp編碼序列克隆到pTRV2載體，構(gòu)建了pTRV2-FBX6載體。

將GhMIR394aA01.2的DNA序列克隆到pBI121載體中，構(gòu)建35S：：MIR394a載體。將ghr-miR394a與GhFBX6的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行核苷酸突變，但不改變GhFBX6的氨基酸序列，通過融合PCR反應(yīng)得到rGhFBX6。將GhFBX6及其突變序列rGhFBX6分別與熒光素酶（luciferase，LUC）報告基因融合，插入到pBI121載體的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間，分別構(gòu)建FBX6-LUC和rFBX6-LUC載體。利用電擊法將這些載體分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101。

1.7棉花黃萎病抗性分析

棉花2片子葉完全展開且無真葉長出時，用無菌注射器將含有目標(biāo)載體（pTRV1 + pTRV2e-OE394a，pTRV1 + pTRV2e-ST394a，pTRV1 + pTRV2-FBX6， pTRV1 + pTRV2e，pTRV1 + pTRV2）的農(nóng)桿菌注射至棉花子葉。注射后14d，挑選長勢較一致的至少15株棉花接種V991。大麗輪枝菌的培養(yǎng)和接菌均按照 Hu 等的方法。接菌后21d，統(tǒng)計病情指數(shù)（diseaseindex，DI）和病株率[]。 DI=Σ （各級病株數(shù) × 相應(yīng)病級值）/（調(diào)查總株數(shù) × 最高病級值） ×100 ，病株率 °leddash 發(fā)病株數(shù)/總株數(shù) ×100% 。

莖稈剖面觀察：接菌后21d，取棉花莖稈（子葉節(jié)至第一片真葉葉柄處），用刀片將棉花莖稈中部縱向剖開，觀察維管束褐變情況。同時，提取棉花莖稈DNA，利用大麗輪枝菌TUB1基因的特異引物進(jìn)行qRT-PCR，檢測V991DNA的相對豐度，以GhACT7基因作為內(nèi)參。真菌恢復(fù)培養(yǎng)：將棉花莖段切成約1cm長的小段，放置在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基上，于 25^°C 培養(yǎng)7d后觀察病原菌生長情況。以上試驗均重復(fù)3次。

1.8LUC熒光強(qiáng)度和酶活性分析

用無菌注射器將含有目標(biāo)載體（FBX6-LUC，rFBX6-LUC，F(xiàn)BX6-LUC + 35S：：MIR394a，rFBX6-LUC+35S：：MIR394a） 的農(nóng)桿菌注射煙草葉片（3葉期）和棉花子葉（2片子葉完全展開，且無真葉長出）。注射后2d觀察注射區(qū)域的LUC熒光強(qiáng)度（FusionFX，法國VILBER），使用CLARIOstarPlus儀器（德國BMGLABTECH）測定LUC活性[17]。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

使用MicrosoftExcel2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，使用Tukey測試和Studentt檢驗進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1ghr-miR394a和GhFBX6的生物信息學(xué)分析及表達(dá)模式分析

陸地棉中共鑒定出12個GhMIR394基因，它們產(chǎn)生2種成熟miRNA，ghr-miR394a和ghr-miR394b（附表2）。系統(tǒng)發(fā)育樹表明GhMIR394aA01.2與GmMIR394具有較高的同源性，GhMIR394b_A05與ZmMIR394親緣關(guān)系最近（圖1A）。陸地棉、擬南芥、大豆、油菜、水稻、小麥、玉米中miR394的成熟序列均含有 19bp 的保守序列“UUGGCAUUCUGUCCACCUC\"（圖1B）。

GhFBX6開放閱讀框長度為 1401bp ，編碼由466個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。經(jīng)預(yù)測，GhFBX6蛋白的相對分子質(zhì)量為 52.76kDa ，理論等電點(diǎn)為5.00。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，GhFBX6與GmFBX6高度同源，序列一致性為 68.04% （圖1C）。

qRT-PCR分析結(jié)果顯示，ghr-miR394a在根中的相對表達(dá)水平是ghr-miR394b的6.25倍（圖1D）。因此，選擇ghr-miR394a進(jìn)行下一步研究。ghr-miR394a成熟序列長度為20bp，由ghr-miR394a前體的5'端產(chǎn)生，折疊成典型的二級結(jié)構(gòu)（圖1E）。ghr-miR394a在葉片中高表達(dá)，其次為莖和根（圖1F）。接種大麗輪枝菌后 0～ 13d ，棉花根部ghr-miR394a的表達(dá)量呈降低趨勢，GhFBX6的表達(dá)量整體呈先升高后降低的波動變化趨勢（圖 1G～H ）。與對照組（清水處理）相比，接種大麗輪枝菌后 1d，4d，7d，10d，13d ，棉花根部ghr-miR394a表達(dá)量顯著下調(diào)（圖1G），GhFBX6的相對表達(dá)水平顯著增加（圖1H），這暗示ghr-miR394a和GhFBX6可能參與調(diào)控棉花黃萎病抗性。

2.2ghr-miR394a負(fù)調(diào)控棉花黃萎病抗性

與對照植株（TRV：：0O）相比，TRV：：OE394a植株中g(shù)hr-miR394a的相對表達(dá)水平顯著增加了約1.92倍；在TRV：ST394a植株中，ghr-miR394a的相對表達(dá)水平顯著下降了約 69% 此外，TRV：：OE394a植株中GhFBX6的相對表達(dá)水平顯著降低了約 55% ，而TRV：：ST394a植株中其相對表達(dá)量顯著增加了約 86% （圖2A）。接種大麗輪枝菌孢子懸浮液后21d，TRV：：OE394a植株表現(xiàn)出比TRV：：00植株更嚴(yán)重的病癥，包括嚴(yán)重的萎蔫、葉片脫落等（圖2B）。與TRV：：00植株相比，TRV：：OE394a植株的DI顯著增加（圖2C），病株率顯著增加了約30百分點(diǎn)（圖2D），莖段培養(yǎng)表明在棉花莖部有更多的大麗輪枝菌菌絲積累（圖2E），且莖部大麗輪枝菌DNA相對豐度顯著升高（圖2F）。與TRV：：00植株相比，TRV：：ST394a植株表現(xiàn)出較優(yōu)的抗病表型，葉片黃化較少，葉片脫落程度較輕（圖2B）；TRV：：ST394a植株的DI顯著降低，病株率顯著降低了約23百分點(diǎn)，且棉花莖部的大麗輪枝菌菌絲積累量更少，莖部真菌DNA相對豐度顯著降低（圖 2C～F ）。上述結(jié)果表明，ghr-miR394a負(fù)調(diào)控棉花黃萎病抗性。

2.3沉默GhFBX6降低棉花黃萎病抗性

圖1ghr-miR394a和GhFBX6的系統(tǒng)進(jìn)化及表達(dá)模式分析Fig.1Phylogenetic and expression pattern analysis of ghr-miR394a and GhFBX6

A：MIR394基因系統(tǒng)進(jìn)化分析。B：miR394成熟序列比對。C：FBX6蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析。D：ghr-miR394a和ghr-miR394b在棉花根中的相對表達(dá)水平。E：ghr-miR394a前體二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。F：不同棉花組織中g(shù)hr-miR394a的相對表達(dá)水平。 G～H ：大麗輪枝菌侵染后棉花根系ghr-miR394a和GhFBX6的表達(dá)量。Mock表示清水處理。A、C中，比例尺代表每個單位長度的分支對應(yīng)0.05個進(jìn)化距離單位。D、F中，不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05 ，Tukey測試）； G～H 中，*和 ** 分別表示差異顯著（ Plt;0.05 ）差異極顯著（ Plt;0.01，t 檢驗）。

A：Phylogenetic analysisof MIR394.B：miR394 mature sequencealignment.C：The phylogeneticanalysisof FBX6. D：Relativeexpression levelsof ghr-miR394aandghr-miR394b incotonroots.E：Predictionof secondarystructureof the ghr-miR394a precursor.F：Relativeexpresionlevelsof ghr-mR394ainvariouscottontissues.G-H：Relative expresionlevels of ghr-miR394aand GhFBX6 in cotton rootsafter infection by V. dahliae.Mock representswater treatment.InA and C， the scalebarindicatesthateachunitlengthofthebranchcorrespondstoO.O5unitsofevolutionarydistane.Dierentlowercaseletters inD and F indicate significant differences （ Plt;0.05 ， Tukey test）. In G-H， * and ** represent significant differences （Plt;0.05 ） andextremely significant differences Plt;0.01 ，t-test），respectively.

A：TRV：OE394a、TRV：ST394a 和TRV：0植株中 ghr-miR394和GhFBX6的相對表達(dá)水平。B：接種大麗輪枝菌后21d棉株的表型。 C～D ：接種后21d棉株的病情指數(shù)和病株率。E：棉花莖部真菌恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果。F：大麗輪枝菌DNA相對豐度。A中不同的小寫、大寫字母分別表示ghr-miR394、GhFBX6的表達(dá)水平差異顯著（ Plt;0.05 ，Tukey測試）;C、D、F中不同小寫字母表示差異顯著（ Plt;0.05 ，Tukey 測試）。

圖2ghr-miR394a負(fù)調(diào)控棉花黃萎病抗性

A： Relative expressionlevelsofghr-miR394andGhFBX6inTRV：OE394a，TRV：ST394a，andTRV：00plants.B：Phenotype ofcotonplantsat21dayspost inoculation（dpi）withV.dahliae.C-D：Thediseaseindexandrateofdiseasedplantsat1dpi. E：Fungalrecoveryassayof inoculated plantstems.F：RelativeabundanceofV.dahliaeDNA.InA，diferentlowercaseand uppercaseletters indicate that the expression levelsof ghr-miR394and GhFBX6are significantlydiffrent （ Plt;0.05 ，Tukey test）， respectively.Different lowercase letters in C，D，andF indicate significant difference （ Plt;0.05 ，Tukey test）.

Fig.2ghr-miR394a negatively regulates the resistance to Verticilium wilt in cotton

與TRV：：OO植株相比，TRV：：FBX6植株中GhFBX6的相對表達(dá)水平顯著降低（圖3A）。接種大麗輪枝菌后21d，GhFBX6沉默植株出現(xiàn)了較嚴(yán)重的病害癥狀，包括葉片黃化、卷曲和枯萎等現(xiàn)象（圖3B），其DI顯著高于TRV：：00植株（圖3C），病株率顯著增加了約29百分點(diǎn)（圖3D），莖稈維管束褐化程度加重（圖3E），莖部大麗輪枝菌DNA相對豐度顯著高于TRV：：OO植株（圖3F）。上述結(jié)果表明，GhFBX6正調(diào)控棉花黃萎病抗性。

2.4ghr-miR394a在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控GhFBX6表達(dá)

基于ghr-miR394a與GhFBX6mRNA的互補(bǔ)性和ghr-miR394a的切割特性，預(yù)測其切割位點(diǎn)位于GhFBX6mRNA的第1162個核苷酸處。5^′ RLM-RACE分析結(jié)果表明，在8個克隆子中有7個的GhFBX6mRNA在第1162個核苷酸位置發(fā)生了切割（圖4A和附表3）。為了進(jìn)一步確認(rèn)ghr-miR394a在體內(nèi)引導(dǎo)切割GhFBX6mRNA，在本氏煙葉片中進(jìn)行了LUC報告系統(tǒng)分析。首先，對GhFBX6序列中g(shù)hr-miR394a的結(jié)合區(qū)核苷酸進(jìn)行同義突變，通過融合PCR反應(yīng)得到rGhFBX6（圖4B）。然后，構(gòu)建效應(yīng)子載體35S：：MIR394a；同時，將GhFBX6及其突變序列分別與LUC報告基因融合，產(chǎn)生FBX6-LUC和rFBX6-LUC報告子載體（圖4C）。將這些載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，共注射煙草葉片。如圖4D所示，與單獨(dú)注射FBX6-LUC相比，共注射35S：：MIR394a和FBX6-LUC的LUC熒光強(qiáng)度明顯降低；與單獨(dú)注射FBX6-LUC或rF-BX6-LUC相比，共注射35S：：MIR394a和rF-BX6-LUC的LUC熒光強(qiáng)度沒有明顯變化。LUC活性定量檢測也表明，共注射35S：：MIR394a和FBX6-LUC的葉片LUC活性顯著低于僅注射FBX6-LUC的葉片，而單獨(dú)注射FBX6-LUC、rF-BX6-LUC以及共注射rFBX6-LUC和35S：：MIR394a的葉片LUC活性無顯著差異（圖4E）。

圖3抑制GhFBX6表達(dá)降低棉花對大麗輪枝菌的抗性

A：TRV：FBX6沉默植株和TRV：00對照植株中GhFBX6的表達(dá)水平。B：接種大麗輪枝菌后21d，TRV：FBX6和TRV：：00植株的表型。 C～D ：TRV：FBX6和TRV：0O植株的病情指數(shù)及病株率。E：棉花莖部維管束病癥。F：大麗輪枝菌DNA相對豐度。 ^** 表示差異極顯著（ Plt;0.01，t 檢驗）。

A： The expression levels of GhFBX6 in TRV：：FBX6 silenced plantsand TRV：0O control plants.B：Phenotype of TRV：： FBX6andTRV：0Oplantsat21dpiwithV.dahliae.C-D：Diseaseindexandtherateofdiseased plantsofTRV：FBX6and TRV：00 plants.E：Disease symptomof vascular incottonstems.F：Relative abundanceofV.dahliaeDNA.**represent extremely significant differences Φ^-Plt;0.01 ，t-test）.

Fig.3Suppression the expression of GhFBX6 reduced resistance of cotton to V.dahliae（rGhFBX6）

在棉花子葉中進(jìn)行的試驗也得到了一致的結(jié)果，與35S：：MIR394a和rFBX6-LUC共注射相比，35S：：MIR394a與FBX6-LUC共注射區(qū)域的LUC熒光強(qiáng)度明顯降低，LUC活性顯著降低（圖 4F～G ）。

3討論

越來越多的研究表明，miRNA在植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。盡管已有一些研究探究了miR394-FBX模塊在植物生長和防御反應(yīng)中的功能[12-15，18]，但其在棉花中的功能仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌侵染后ghr-miR394a的表達(dá)水平顯著低于對照處理，并且ghr-miR394a靶向切割GhFBX6mRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達(dá)。ghr-miR394a瞬時過表達(dá)會抑制棉花的黃萎病抗性，而瞬時沉默ghr-miR394a則會增強(qiáng)棉花的黃萎病抗性。本研究ghr-miR394a與馬鈴薯miR394[4均在病原菌侵染后表達(dá)下調(diào)，而大蒜（AlliumsativumL.）miR394在尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）侵染后表達(dá)上調(diào)[19]。這些研究表明，不同植物的miR394在抵御病原菌侵染過程中可能發(fā)揮著不同的作用。

F-box是植物中最大的蛋白家族之一，通常在N端含有F-box結(jié)構(gòu)域，在C端含有用于靶標(biāo)識別的保守結(jié)構(gòu)域[20]。F-box蛋白參與了包括花器官發(fā)育、植物激素響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及防御反應(yīng)在內(nèi)的多種生物學(xué)過程[2]。在陸地棉TM-1基因組中，共鑒定出592個F-box蛋白編碼基因，但是關(guān)于其功能的研究報道較少[22]。Geng等[23]發(fā)現(xiàn)棉花F-box基因GhFB15可被鹽脅迫快速誘導(dǎo)表達(dá)，GhFB15過表達(dá)會降低轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽性，而在棉花中沉默該基因則能提高棉株的耐鹽性。Li等[24在棉花中克隆了煙草抗病同源蛋白GhACIF1（F-box蛋白），過表達(dá)GhACIF1增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對黃萎病的抗性，而在棉花中利用VIGS技術(shù)沉默GhACIF1降低了棉株對黃萎病的抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，利用VIGS技術(shù)沉默GhFBX6會顯著降低棉花對大麗輪枝菌侵染的抗性。這些研究表明，棉花F-box蛋白的功能具有多樣性。

茉莉酸（jasmonicacid，JA）在增強(qiáng)植物抗病性方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，AtBFP1（灰霉菌誘導(dǎo)的F-box蛋白1）通過JA信號途徑與JA氧化酶相互作用并介導(dǎo)其泛素化降解，正向調(diào)控擬南芥對灰霉菌的抗性[25]。JA信號通路也是棉花黃萎病抗性的重要調(diào)控途徑，例如，GhODO1通過調(diào)節(jié)JA信號途徑增強(qiáng)棉株對大麗輪枝菌的抗性2；而GhWRKY33通過JA介導(dǎo)的信號通路負(fù)調(diào)控棉花對大麗輪枝菌的抗性[27]。此前的一些研究表明，依賴JA信號的miR394和F-box蛋白可以調(diào)控植物的抗性[25，28-29]。因此，初步推測 ghr-miR394a-GhFBX6模塊可能通過參與JA信號通路調(diào)控棉花對大麗輪枝菌侵染的抗性響應(yīng)，但仍需進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

與清水處理相比，大麗輪枝菌侵染可降低ghr-miR394a的表達(dá)量，誘導(dǎo)GhFBX6高表達(dá)。5'RLM-RACE和LUC報告系統(tǒng)分析表明，ghr-miR394a在轉(zhuǎn)錄后水平抑制GhFBX6表達(dá)。與對照植株相比，ghr-miR394a沉默植株的黃萎病抗性顯著增強(qiáng)，而ghr-miR394a過表達(dá)和GhFBX6沉默植株的黃萎病抗性顯著降低。表明ghr-miR394a-GhFBX6模塊參與調(diào)控棉花黃萎病抗性。本研究結(jié)果可為培育抗黃萎病棉花種質(zhì)材料提供候選基因。

附件：

詳見本刊網(wǎng)站（http：//journal.cricaas.com.cn/）本文網(wǎng)頁版。附表1本研究所用引物的序列Table S1The primer sequences used in this study附表2 ghr-miR394家族信息TableS2 Informationof ghr-miR394 family附表3 克隆子部分測序序列TableS3 Partial sequencing sequence of clones附圖1 ghr-miR394a過表達(dá)（A）和沉默載體（B）示意圖

Fig. S1Diagram of overexpression （A） and silencing （D） vevtuis Ui gIm-mszta

參考文獻(xiàn)：

[1] UmerMJ，ZhengJ，YangMY，etal.Insights to Gossypium defenseresponseagainst Verticilliumdahliae：thecottoncancer [J/OL].Functional amp; Integrative Genomics，2023，23（2）：142 [2025-04-07]. htps：//oi.org/10.1007/s10142-023-01065-5.

[2]BillahM，LiFG，Yang ZE.Regulatory network ofcottongenes in response to salt，drought and wilt diseases （Verticillium and Fusarium）：progress and perspective[J/OL].Frontiers in Plant Science，2，2：924-0-].tps：/og/19/ fpls.2021.759245.

[3] Zhan JP，Meyers BC.Plant small RNAs： their biogenesis，regulatoryroles，and functions[J/OL].AnnualReviewofPlantBiology，2023，74（1）：21-51[2025-04-07]. https：//doi.org/10.1146/annurev-arplant-070122-035226.

[4] JiaoBL，PengQD，WuBJ，etal. The miR172/TOE3 module regulates resistance to tobacco mosaic virus in tobacco[J/OL]. ThePlantJourmal，2024，119（6）： 2672-2686[2025-04-07].tp：// doi.org/10.1111/tpj.16941.

[5] ZhangM，ZhengHY， JinL， et al. miR169oand ZmNF-YA13 actin concert to coordinate the expression of ZmYUC1 that determines seed size and weight inmaize kernels[J/OL].The NewPhytologist，2022，235（6）：2270-2284[2025-04-07].https：// doi.org/10.1111/nph.18317.

[6]HuG，GeXY，WangZA，etal.The cottonMYB33 geneisahub gene regulating the trade-off between plant growth and defense inVerticilliumdahliaeinfection[J/OL].JournalofAdvanced Research，2024，61： 1-17[2025-04-07]. htps：//doi.org/10.1016/j. jare.2023.08.017.

[7] Xie FL，Wang QL， Sun R， et al. Deep sequencing reveals important roles of microRNAs in response to drought and salinity stress in cotton[J/OL]. Journal of Experimental Botany，2015， 66 （3）： 789-804[2025-04-07].https：//doi.org/10.1093/jxb/eru437.

[8]Fontana JE，WangG，SunRR，etal.Impact of potassiumdeficiency on cotton growth，development and potential microRNmediated mechanism[J/OL]. Plant Physiologyand Biochemistry， 2020，153：72-802025-04-07].htps：//dog/101016/j.plaphy 2020.05.006.

[9] Wang W，Liu D，ChenD D，et al.MicroRNA414c affects salt tolerance of cotton byregulating reactive oxygen species metabolism under salinity stress[J/OL].RNA Biology，2019，16 （3）：362-375[2025-04-07]. https：//doi.org/10.1080/15476286. 2019.1574163.

[10] ZhanJJ，ChuY，WangY，et al.The miR164-GhCUC2- GhBRC1 module regulates plant architecture through abscisic acid in cotton[J/OL].Plant Biotechnology Journal，2021，19（9）： 1839-1851[2025-04-07]. https：//oi.org/10.111/pbi.13599.

[11] Hu G，GeXY，Wang P，etal. The cotton miR171a-SCL6 module mediates plant resistance through regulating GhPR1 expression [J/OL].Plant Physiology andBiochemistry，2023，202：107995 [2025-04-07]. htps：//doi.org/10.1016/j.plaphy.2023.107995.

[12] Li S，Zhao ZJ，Lu Q，etal.MiR394 modulates brassinosteroid signaling to regulate hypocotyl elongation in Arabidopsis[J/OL]. The Plant Joural，2024，119（2）： 645-657[2025-04-0].ps：// doi.org/10.1111/tpj.16806.

[13]MiskevishF，LodeyroA，PonsoMA，etal.Maize mutants in miR394-regulated genes show improved drought tolerance [J/OL].Physiologia Plantarum，2025，177（2）： e70155[2025-04- 07]. https：//doi.org/10.1111/ppl.70155.

[14]SunXY，XuM，LuoM，etal.Potato miR394 targetsStA/NINVEand StLCRtonegativelyregulatelateblightresistance [J/OL].Physiologia Plantarum，2024，176（2）： e14293[2025-04- 07]. https：//doi.org/10.1111/pp1.14293.

[15] Tian X， SongLP，Wang Y，et al. miR394 acts as a negative regulator of Arabidopsis resistance to B.cinerea infection by targeting LCR[J/OL].Frontiers in Plant Science，2018，9： 903 [2025-04-07]. htps：//doi.org/10.3389/fpls.2018.00903.

[16]HuG，HaoMY，WangL，etal.The cottonmiR477-CBP60A moduleparticipates in plant defense against Verticillium dahliae [J/OL].Molecular Plant-Microbe Interactions，2019，33（4）： 624-636[2025-04-07]. https：//doi.org/10.1094/MPMI-10-19- 0302-R.

[17]HuG，WangBT，JiaP， et al. The cotton miR530-SAP6 module activated by systemic acquired resistance mediates plant defenseagainst Verticillium dahliae[J/OL].Plant Science，2023， 330：111647[2025-04-07].htps：//doiorg/10.1016/j.plantsci.2023. 111647.

[18] Qu L，Lin L B， Xue H W.Rice miR394 suppresses leaf inclination through targeting an F-box gene，LEAF INCLINATION 4 [J/OL]. Journal of Integrative Plant Biology，2019，61（4）： 406-416[2025-04-07].https：//doi.org/10.1111/jipb.12713.

[19] Chand SK，Nanda S，Joshi R K.Regulation of miR394 in response to Fusarium oxysporum f.sp.cepae（FOC） infection in garlic （Allium sativumL）[J/OL].Frontiers in Plant Science， 2016，7：258[2025-04-07]. htps：//doi.org/10.3389/fpls.2016. 00258.

[20] Lechner E，AchardP，Vansiri A，etal.F-box proteins everywherelJ/OLl. Current OpinioninPlantBiologv.2006.9（6）： 631- 638[2025-04-07].https：//doi.org/10.1016/j.pbi.2006.09.003.

[21] SaxenaH，NegiH，SharmaB.Role ofF-boxE3-ubiquitinligases in plant development and stress responses[J/OL].Plant Cell Reports，2023，42（7）：1133-1146[2025-04-07]. https：//doi.org/ 10.1007/s00299-023-03023-8.

[22] ZhangSL，Tian ZL，LiHP，etal.Genome-wide analysis and characterizationofF-box gene family in Gossypium hirsutumL [J/OL].BMC Gen0mics，2019，20（1）： 993[2025-04-07].https：/ doi.org/10.1186/s12864-019-6280-2.

[23] Geng Z，Dou HK，LiuJG，et al.GhFB15 isan F-box protein that modulates the response to salinity by regulating flavonoid biosynthesis[J/OL].Plant Science，2024，338：111899[2025-04- 07]. https：//doi.org/10.1016/j.plantsci.2023.111899.

[24]LiXC，SunY，LiuNN，etal. Enhancedresistance to Verticillium dahliae mediated byanF-box protein GhACIF1 from Gossypium hirsutum[J/OL].Plant Science，2019，284：127-134[2025-04- 07]. https：//doi.org/10.1016/j.plantsci.2019.04.013.

[25] ZhangM，Li WW，Zhang TY，etal.Botrytis cinerea-induced F-box protein 1 enhances disease resistance by inhibiting JAO/JOX-mediated jasmonicacid catabolism in Arabidopsis [J/OL].MolecularPlant，2024，17（2）：297-311[2025-04-07]. https：//doi.org/10.1016/j.molp.2023.12.020.

[26] Zhu Y T，Hu XQ，WangP，et al.GhODO1，an R2R3-type MYB transcription factor，positively regulates coton resistance toVerticilliumdahliae via the lignin biosynthesisand jasmonic acid signalingpathway[J/OL]. International Journal of Biological Macromolecules，2022，201： 580-591[2025-04-07].https：// doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2022.01.120.

[27] JiYR， Mou MH， Zhang HM， et al. GhWRKY33 negatively regulates jasmonate-mediated plant defense to Verticillium dahliae[J/OL].Plant Diversity，2023，45（3）：337-346[2025-04- 07]. https：//doi.org/10.1016/j.pld.2022.04.001.

[28] JoshiRK，Megha S，Basu U，etal.Genome wide identification and functional prediction of long non-coding RNAs responsive to Sclerotinia sclerotiorum infection in Brassica napus[J/OL]. PLoS One，2016，11（7）： e0158784[2025-04-07]. https：//doi. org/10.1371/journal.pone.0158784.

[29] Wang ZL，Dai L Y，Jiang Z D，et al.GmCOI1，a soybean F-Box protein gene，shows ability to mediate jasmonate-regulatedplantdefenseand fertilityinArabidopsis[J/OL].MolecularPlant-Microbe Interactions，2005，18（12）：1285-1295[2025- 04-07]. https：//doi.org/10.1094/MPMI-18-1285. （責(zé)任編輯.王小璐青任校對.王國鑫）