肺癌血漿外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究

中圖分類號(hào)：Q592 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-2367（2025）04-0031-08

肺癌（lung cancer，LC）是最常見(jiàn)的腫瘤之一，也是一種極具威脅的惡性腫瘤，其發(fā)病率 （11.4% 僅次于乳腺癌 （11.7%） ；同時(shí)，肺癌也是全球范圍內(nèi)死亡率 （18.0%） 最高的腫瘤[1].肺癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)有害氣體（吸煙、木材燃燒產(chǎn)生的氣體、汽車尾氣、大氣污染）的侵害是引起肺癌的主要因素[2].肺癌按照組織病理學(xué)分型可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中 NSCLC約占肺癌中的 85%^[3] .由于NSCLC的發(fā)病率及死亡率均為最高，且大多數(shù)早期NSCLC患者并無(wú)典型癥狀，被診斷出來(lái)時(shí)往往已是癌癥晚期[4，因此，肺癌的早期確診對(duì)于改善預(yù)后、提高生存率有極大的意義.目前，肺癌的診斷方法主要包括胸部X線、胸部CT、肺組織穿刺活檢、腫瘤標(biāo)志物篩查等.其中，診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是肺組織活檢，但其存在有創(chuàng)性、未穿刺到腫瘤、增加腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)[5」.因此，為了有效篩查肺癌患者，迫切需要建立無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)、高靈敏度和高特異性的診斷方法.

生物標(biāo)志物是一種存在于血液中的，能被客觀測(cè)量和評(píng)價(jià)，反映生理或病理過(guò)程，以及對(duì)暴露或治療干預(yù)措施產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的指標(biāo)[6].癌癥生物標(biāo)志物涵蓋了多種生化分子，可應(yīng)用于腫瘤的診療，為癌癥的早期診斷和精準(zhǔn)預(yù)后提供依據(jù)[].外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑為 30～100nm 的一種封閉的脂質(zhì)雙分子層包裹的囊泡結(jié)構(gòu)，其攜帶多種物質(zhì)，廣泛分布于體液中，如尿液、血漿、灌洗液、漿膜積液和腦脊液等[8].研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[9].因此，外泌體可作為癌癥臨床治療的重要對(duì)象，用作癌癥患者的精確診斷和判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物[10].目前，基于質(zhì)譜技術(shù)的外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究較為流行[1].研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)聯(lián)合使用密度梯度離心法和超速離心法可進(jìn)一步提高外泌體的純度[12].但是，該方法存在樣本起始量高、回收率低、時(shí)間長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn).目前，一些新材料（ TiO₂ 或 Ti⁴⁺ -IMAC）已被應(yīng)用于富集外泌體，具有樣本起始量低、回收率高、操作簡(jiǎn)單快速等優(yōu)勢(shì).此外，隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，液相色譜-質(zhì)譜分析的方法能夠增加對(duì)癌癥生物標(biāo)志物鑒定的準(zhǔn)確性[13」.因此，采用新方法分離純化外泌體以及基于質(zhì)譜技術(shù)的外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，有望發(fā)現(xiàn)肺癌早期診斷新型標(biāo)志物.綜上所述，本研究首次結(jié)合Ti⁴⁺ -IMAC快速分離純化外泌體的方法以及基于高分辨率質(zhì)譜儀的分析技術(shù)，對(duì)肺癌患者的血漿樣本進(jìn)行了系統(tǒng)化的血漿外泌體蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物研究，探索肺癌患者血漿外泌體蛋白質(zhì)的變化情況，研究結(jié)果將有助于揭示一系列潛在的血漿來(lái)源的外泌體蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，為肺癌的早期診斷和預(yù)后篩查提供支持.

資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和研究對(duì)象

開展所用實(shí)驗(yàn)儀器和材料見(jiàn)附錄表S1.肺癌患者和健康人的血漿樣本均由四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科提供.本研究經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有參與本項(xiàng)研究的受試者均簽署書面知情同意書.

1.2 外泌體蛋白質(zhì)組樣品制備及蛋白酶切

取 100μL 血漿樣品，利用 0.2μm 濾膜去除細(xì)胞碎片、死亡小體和大的囊泡等.首先，取 2mg 的 Ti⁴⁺. 1IMAC，加入 200μL 三氟乙酸（TFA，體積分?jǐn)?shù) 0.1% 洗滌 5min，5 000r/min 室溫離心 2min 去除廢液，加人 200μL 磷酸鹽緩沖劑（PBS， pH7.5） 洗滌3次， 500g 離心 1min. 將過(guò)濾后的樣品用等量PBS稀釋1倍，加入含有 Ti⁴⁺ -IMAC的 1.5mL 離心管中，置于室溫旋轉(zhuǎn)混合儀上孵育 10min，4^°C 下 1000r/min 離心1min 去除廢液.加入 100μL 的PBS洗滌3次， 4^°C 下 500g 離心 1min 去除廢液，去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和分子.加入 20μL 的SDT裂解液（體積分婁 含1% 體積分?jǐn)?shù)的蛋白酶抑制劑合成物）， 95°C 金屬浴 5min ，超聲 10min 提取外泌體蛋白（非接觸超聲， 4^°C ，100W，超聲7s，停 條件下 12 000r/min 離心 10min 收集得到外泌體裂解液.

將得到的外泌體裂解液轉(zhuǎn)移到 30kDa 超濾管中，加人 280μL 的 8mol/L 的尿素溶液，離心收集上清，加入 6μL 的 1mol/L 二硫蘇糖醇（DTT）， 恒溫箱中孵育 ，加入 15μL 的 1mol/L 碘乙酰胺（IAM）室溫避光孵育 30min. 加入 200μL 的 8mol/L 尿素溶液洗滌一次，加入 200μL 的 50mmol/L 碳酸氫銨溶液洗滌3次， 12 000r/min 離心 10min. 加入 200μL 的 50mmol/L 碳酸氫銨溶液，按 1：50 加入胰蛋白酶， 反應(yīng)過(guò)夜 .12 000r/min 離心 10min 回收肽段并定量.

1.3 液相二級(jí)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測(cè)分析

外泌體肽段通過(guò) Easy-nLCl2Oo 液相聯(lián)合含有納升噴霧源的Orbitrap Fusion Lumos 質(zhì)譜儀（ThermoFisherScientific）進(jìn)行分析.液相梯度由溶液A和溶液B構(gòu)成，A液為體積分?jǐn)?shù) 0.1% 甲酸水溶液，B液為體積分?jǐn)?shù) 0.1% 甲酸乙腈水溶液（乙腈體積分?jǐn)?shù)為 80% ）.每個(gè)多肽樣品用體積分?jǐn)?shù) 0.1% 甲酸重新溶解，取 1μg 多肽通過(guò)C18色譜柱 （75μm×24cm，1.9μm 填料，Dr.Maisch）分離.液相分離梯度如下： 0～5.0min，B 液線性梯度從 3% 到 8%;5.0～69.0min，B 液線性梯度從 8%～32% 5 69.0～70.5min，B 液線性梯度從 32%～ 60%;70.5～71.0min，B 液線性梯度從 60% 到 98% ： 71.0～78.0min，B 液線性梯度維持在 98% .DIA質(zhì)譜分析，檢測(cè)模式設(shè)置為正離子.一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為 350～1500m/z ，質(zhì)譜分辨率為60 O00，AGCtarget為1 000 000 ，Maximum IT為 50ms.MS2 設(shè)置6O個(gè)DIA可變采集窗口進(jìn)行DIA數(shù)據(jù)采集，質(zhì)譜分辨率為15000，AGC目標(biāo)值為500000，MaximumIT為 22ms ，MS2 Activation Type為 HCD，Normalized collisionenergy 為 30.

1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

Spectronaut軟件是一個(gè)專業(yè)的蛋白質(zhì)鑒定及數(shù)據(jù)分析的軟件，常被用于處理DIA分析后所獲得的原始數(shù)據(jù).所有原始數(shù)據(jù)均由 Spectronaut（Version 15，Biognosys AG）軟件進(jìn)行分析，使用非冗余人UniProt-KB/Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（包含 20 259 個(gè)蛋白序列），其他搜庫(kù)參數(shù)均按照軟件默認(rèn)設(shè)置.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析使用Perseus[14]完成.外泌體蛋白質(zhì)的顯著性閾值設(shè)置為 Plt;0.05 ，兩者的倍數(shù)變化閾值之|1.5|.篩選出的差異基因，使用ClusterProfiler 4.0^[15] 做基因本體（gene ontology）和 KEGG（kyoto encyclo-pedia of genes and genomes）分析.使用 String 進(jìn)行蛋白互作分析（PPI）[16]，PPI 網(wǎng)絡(luò)使用 Catoscape 優(yōu)化，關(guān)鍵基因使用cytoHubba插件篩選.

2 結(jié)果

2.1外泌體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)解析

研究結(jié)合 Ti⁴⁺ -IMAC快速分離純化血漿外泌體方法以及無(wú)標(biāo)記DIA定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，針對(duì)5例肺癌患者和5例健康人的血漿樣本，進(jìn)行了外泌體蛋白質(zhì)組的系統(tǒng)性質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集.首先，用 0.2μm 濾膜去除細(xì)胞碎片、死亡小體和大的囊泡，減小對(duì)后續(xù)外泌體分離純化的影響.接下來(lái)，用 Ti⁴⁺ -IMAC對(duì)外泌體進(jìn)行富集并洗滌非特異性結(jié)合物質(zhì).隨后，加人胰蛋白酶使外泌體蛋白質(zhì)酶解完全.最終，基于Orbitrap Fusion Lu-mos 質(zhì)譜儀器，完成了肽段信息的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，并通過(guò) Spectronaut軟件完成了質(zhì)譜數(shù)據(jù)的定性與定量分析.通過(guò)數(shù)據(jù)解析，本研究共鑒定出5020個(gè)血漿來(lái)源的外泌體蛋白質(zhì)（排除了2例存在異常值的LC樣本），設(shè)定變異系數(shù)（CV）閾值為0.3對(duì)蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，最終614個(gè)外泌體蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)被保留.

2.2 外泌體蛋白質(zhì)組的細(xì)胞定位與功能

通過(guò)細(xì)胞定位的富集分析，鑒定到的614個(gè)血漿外泌體蛋白質(zhì)主要聚焦在67個(gè)細(xì)胞組成的模塊內(nèi).這些模塊進(jìn)一步歸并為15個(gè)網(wǎng)絡(luò)模塊，它們主要定位于如下細(xì)胞結(jié)構(gòu)：皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、囊泡包衣、細(xì)胞內(nèi)無(wú)膜細(xì)胞器、囊泡、細(xì)胞質(zhì)囊泡、細(xì)胞器膜、細(xì)胞外外泌體、蛋白酶體附屬?gòu)?fù)合體、蛋白酶體復(fù)合體、膜結(jié)合細(xì)胞器、線粒體、胞內(nèi)細(xì)胞器內(nèi)腔、真核生物翻譯起始因子3復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶復(fù)合物、細(xì)胞-基質(zhì)結(jié)合處等，如圖1（a）所示.生物學(xué)過(guò)程的富集分析結(jié)果表明，所鑒定的血槳外泌體蛋白質(zhì)主要集中于151條信號(hào)通路中，并被整合為16個(gè)相似的網(wǎng)絡(luò)模塊.這些模塊主要與以下生物學(xué)過(guò)程有關(guān)：有機(jī)氮化合物代謝過(guò)程、核糖核苷酸代謝過(guò)程、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、含蛋白質(zhì)的復(fù)合體組裝、細(xì)胞組件組裝、含蛋白質(zhì)的復(fù)合體組織、有機(jī)氮化合物的生物合成過(guò)程、細(xì)胞大分子代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)程、細(xì)胞分解代謝過(guò)程、囊泡組織、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高 爾基體囊泡介導(dǎo)的運(yùn)輸、高爾基體囊泡運(yùn)輸、建立蛋白質(zhì)定位、膜內(nèi)定位等，如圖1（b）所示.

2.3 肺癌的血漿外泌體蛋白生物標(biāo)志物

為了系統(tǒng)全面地篩查肺癌的血漿外泌體蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，對(duì)健康人和肺癌患者的血漿外泌體蛋白質(zhì)組進(jìn)行了對(duì)比分析，采用 t^. -檢驗(yàn)（554個(gè)外泌體蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)）和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)（60個(gè)外泌體蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)）作為主要的評(píng)估工具.與健康人群相比，肺癌患者的血漿外泌體蛋白質(zhì)組中鑒定出了41個(gè)差異表達(dá)的外泌體蛋白質(zhì)，其中13個(gè)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)和28個(gè)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，如圖2及附錄表 S2所示.基于兩組中差異表達(dá)的血漿外泌體蛋白質(zhì)，利用無(wú)監(jiān)督的主成分分析（PCA）分析可知（圖 2（b））：第一主成分表征了 76.7% 的完整血漿外泌體蛋白質(zhì)變量，第二主成分表征了 8.1% 的完整血漿外泌體蛋白質(zhì)變量.結(jié)果表明，血漿外泌體蛋白質(zhì)的差異表達(dá)可能作為肺癌早期診斷的有效指標(biāo).

2.4外泌體蛋白生物標(biāo)志物的功能注釋

利用ClusterProfiler軟件，我們針對(duì)差異表達(dá)的血漿外泌體蛋白質(zhì)展開了功能富集分析，其中主要參照了基因本體（GO）和KEGG的信號(hào)通路.分析結(jié)果如圖3（a）所示，差異表達(dá)的血漿外泌體蛋白質(zhì)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，顯著富集在細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm），胞漿（cytosol），細(xì)胞核（nucle-us），細(xì)胞外外泌體（extra-cellularexosome），質(zhì)膜（plasmamembrane）等結(jié)構(gòu)中，主要參與了金屬離子結(jié)合（metal ion binding），鈣黏蛋白結(jié)合參與細(xì)胞-細(xì)胞黏附（cadherin bindinginvolved in cell-cell adhe-sion），蛋白質(zhì)同源二聚化活性（protein homodimer-ization activity），GTPase活性（GTPase activity），ATP 結(jié)合（ATP binding）等分子功能.此外，差異表達(dá)的血漿外泌體蛋白質(zhì)還參與了蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（pro-teintransport），細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（intracellular protein transport），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction），RNA 聚合酶I對(duì)轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控（negative regulation of transcription by RNA polymerase ⅡI），內(nèi)高爾基囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)（intra-golgi vesi-cle-mediated transport）等生物學(xué)過(guò)程.在KEGG信號(hào)通路（圖3（b））中，差異表達(dá)的外泌體蛋白質(zhì)主要參與了剪接體（spliceosome），核質(zhì)運(yùn)輸（nucleocytoplasmic transport），mRNA 監(jiān)測(cè)途徑（mRNA surveillancepathway），代謝途徑（metabolic pathways），肌萎縮性側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis）等信號(hào)通路.

2.5外泌體蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析及典型標(biāo)志物篩選

根據(jù) String數(shù)據(jù)庫(kù)，采用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析方法，進(jìn)一步對(duì)血漿來(lái)源的差異表達(dá)外泌體蛋白質(zhì)相關(guān)性進(jìn)行深人分析，擬獲得具有典型代表性的外泌體蛋白質(zhì)關(guān)鍵生物標(biāo)志物.基于Cytoscape 軟件，采用cytoHubba插件對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，篩查獲得了7個(gè)具有典型代表性的血漿外泌體蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，主要包括HDAC3、NAPA、ELP3、HAT1、RAB5B、PDIA5、SARAF 等蛋白質(zhì)（圖4（a，b））.

3討論

肺癌是一種廣泛存在的致命惡性腫瘤，其高死亡率引起了廣泛關(guān)注.早期診斷和有效治療對(duì)于提高患者的生存率至關(guān)重要.目前，臨床上常用的肺癌篩查方法包括胸部X射線、CT掃描、痰液細(xì)胞學(xué)檢查、支氣管鏡檢查等[5].在肺癌的診斷和監(jiān)測(cè)中，癌胚抗原（CEA）是目前應(yīng)用最廣泛的血漿生物標(biāo)志物之一[17].此外，還有 CA125、NSE、ProGRP等生物標(biāo)志物也被用于肺癌的診斷和疾病監(jiān)測(cè)，但它們的敏感性和特異性有限[18].外泌體存在于包括血漿在內(nèi)的多種體液中，憑借其豐富的內(nèi)容物在細(xì)胞間通信和信號(hào)傳遞中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并且參與到腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、黏附、轉(zhuǎn)移以及免疫逃逸等重要過(guò)程[19].近年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血漿外泌體中某些特異性蛋白質(zhì)或miRNA的表達(dá)水平與健康對(duì)照組相比存在顯著差異，具有潛在的診斷價(jià)值[20].SANDFELD-PAULSEN等[21]利用細(xì)胞外囊泡陣列分析肺癌患者和對(duì)照組的血漿外泌體，鑒定出CD151、CDl71和 tetraspanin 8可能是潛在的早期診斷標(biāo)志物.另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，肺癌患者血清外泌體中miR-17-5p表達(dá)顯著上調(diào)，提示其在肺癌診斷中可能具有相當(dāng)?shù)呐R床價(jià)值[22J.盡管肺癌血漿外泌體標(biāo)志物研究取得了一定進(jìn)展，但目前仍存在一些挑戰(zhàn)，如標(biāo)準(zhǔn)化外泌體分離、檢測(cè)方法和建立大樣本量的臨床驗(yàn)證隊(duì)列等.未來(lái)，多中心合作的前瞻性研究有助于進(jìn)一步評(píng)估和篩選出穩(wěn)定、特異、靈敏度高的肺癌外泌體標(biāo)志物組合，推動(dòng)其在臨床應(yīng)用中的轉(zhuǎn)化.因此，本研究結(jié)合 Ti⁴⁺ -IMAC對(duì)血槳中的外泌體進(jìn)行分離純化，采用LC-MS/MS以及DIA定量技術(shù)，共鑒定了614個(gè)血漿來(lái)源的外泌體蛋白質(zhì)，其中13個(gè)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)和 28個(gè)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì).在PCA分析結(jié)果（圖3（b））中，肺癌患者組（LC1、LC2、LC3）聚集在左側(cè)，而健康對(duì)照組（HC1、HC2、HC3、HC4、HC5）聚集在右側(cè)，兩組之間存在明顯的區(qū)分.這一結(jié)果表明，肺癌患者和健康對(duì)照組的血漿外泌體蛋白質(zhì)表達(dá)譜存在顯著差異.此外，本實(shí)驗(yàn)篩選出7個(gè)典型標(biāo)志物，分別是 HDAC3、NAPA、ELP3、HAT1、RAB5B、PDIA5 和 SARAF.其中，HDAC3、NAPA、HAT1 和 PDIA5蛋白質(zhì)的差異表達(dá)已被報(bào)道和肺癌相關(guān).HDAC3在研究中被證實(shí)在Kras突變型非小細(xì)胞肺癌的腫瘤發(fā)展和治療耐藥性中至關(guān)重要[23].WANG等[24]則發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)在順鉑耐藥的臨床 NSCLC 樣本中明顯增加，并與 HDAC3 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān).NAPA 則是一種抗凋亡蛋白，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤抑制因子p53 的降解來(lái)促進(jìn)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[25].組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶1（HAT1）主要定位于細(xì)胞核，主要功能是乙?；ㄎ挥诩?xì)胞質(zhì)的組蛋白H4的賴氨酸5和12以便其被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核[26」.近年來(lái)，HAT1引起了廣泛的關(guān)注，因其參與了癌癥，病毒感染和炎性疾病等多種病理過(guò)程[27].并且有研究顯示，與非腫瘤組織相比，HAT1蛋白在肺癌腫瘤組織中過(guò)量表達(dá)，與肺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，是潛在的生物標(biāo)志物[28].另一項(xiàng)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)的多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，攜帶L858R 點(diǎn)突變的肺腺癌細(xì)胞中PDIA5表達(dá)升高，提示PDIA5可能在L858R突變驅(qū)動(dòng)的肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用[29].

本研究與先前肺癌研究結(jié)果的一致性證明了血漿外泌體蛋白質(zhì)組研究的穩(wěn)定性與可靠性.除了已報(bào)道的生物標(biāo)志物外，本研究還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的潛在生物標(biāo)志物，即ELP3、RAB5B和SARAF3個(gè)血漿來(lái)源的外泌體蛋白質(zhì).ELP3是RNA聚合酶I（Pol Ⅱ）全酶的一個(gè)組成部分，參與轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)，與自主神經(jīng)功能障礙和某些神經(jīng)性疾病相關(guān)[30].RAB5B 是膜運(yùn)輸和外泌體形成的調(diào)節(jié)因子，可視作細(xì)胞外囊泡的一種標(biāo)記蛋白[31]相關(guān)研究表明 RAB5B 是由 miRNA-17調(diào)控的靶基因之一，在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析中被確認(rèn)為與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的核心基因[32].SARAF是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜常駐蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的存儲(chǔ)含量方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[3」].HDAC3、NAPA、ELP3、HAT1、RAB5B、PDIA5 和SARAF 與肺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系值得進(jìn)一步探索.綜上所述，基于非標(biāo)記定量的外泌體蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)了一系列肺癌臨床診斷的候選生物標(biāo)志物，為該疾病的早期診斷和篩查提供了新的見(jiàn)解.

盡管本研究存在樣本量小等局限性，但該研究首次結(jié)合了基于 Ti⁴⁺ -IMAC快速分離純化外泌體的方法以及基于DIA定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，證實(shí)了血漿來(lái)源的外泌體蛋白質(zhì)在肺癌早期診斷標(biāo)志物篩查的潛力，為肺癌早期診斷的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供了新的研究方向，

附錄見(jiàn)電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2024.01.30.0001）.

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Proteomic analysis of exosomal proteins in plasma as biomarkers for lung cancer

Zhang Yong，Yi Guanhua，Luo Haixin， Zheng Yalin，Liu Wenjing，Gu Yufan，Su Tao， Zeng Wenjuan （West China Hospital；West China Clinical Medical College，Sichuan University，Chengdu 6l0041，China）

Abstract：Lung cancer is a prevalent and fatal malignancy globally，which poses aserious threat to public health due to itshighincidenceandmortalityrates.Toimprovetheearlydiagnosisandtreatmentoutcomesoflungcancer，itisessential to establish minimall invasive，highlysensitive，and specific diagnostic methods.Exosomes areextracellar structures thatcarry biomacromolecules.Theyare widelydistributed inbodilyfluidsandplayacrucialroleinintercelularcommunication.Exosomes are significantlyinvolved inthe development，invasion，and metastasis of tumors and mayserve as animportant sourceof biomarkers for lung cancer.This study appliedlabel-fre quantitative proteomics technologywas applied to perform an in-depthanalysisoftheexosomal proteomein plasma samples fromlungcancerpatients.Theresultsidentified4lexosomal proteins in theplasma that wereeitherupregulatedordownregulated specifically in lung cancer patients，effectivelydistinguishing them fromthe healthy population.Subsequent analysis hasshown thattheparticular expresionof exosomal proteins，including HDAC3，NAPA，ELP3，HAT1，RAB5B，PDIA5 and SARAF，is significantly linked to the progresion of lung cancer. This provides crucial data to support early diagnosis and screening.

Keywords： lung cancer; plasma; exosomes; biomarkers; mass spectrometry; proteomics