形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)在血流感染病原菌早期鑒定中的應(yīng)用價(jià)值分析

Application Value Analysis of Morphological Examination Combined with MALDI-TOF MS Technology in the Early Identification of Pathogenic Bacteria in Bloodstream Infection/LIJiequn，YU Jinggui，WANG Hengmin.//Medical Innovation of China，2025，22（18）： 153-157

[Abstract]Objective：To analyze the application value of morphological examinationcombined with matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry （MALDI-TOF MS） technology in the early identification of pathogenic bacteria in bloodstream infection.Method：Aretrospective analysis was conductedon the clinical dataof12O patients with bloodstream infectionadmited tothe SecondPeople's Hospitalof Jingdezhen fromApril to December 2O24.Taking the biochemical identification of coloniesafter transplantation of positive blood culture specimens as the gold standard，the identification time and accuracy of rapid mass spectrometry identification of positive blood culture specimens， morphological examination combined with MALDI-TOF MS technology were compared.Result： Among the12O patients with bloodstream infection，42 cases （35.00 % ）were Gram-positivebacteria and 78 cases （65.00% ）wereGram-negative bacteria.Comparisonof identification timefor different detection methods： rapid mass spectrometry identification lt; morphological examination combined with MALDI-TOF MS technology lt; biochemical identification of cultured colonies after transplanting，the difference was statistically significant （ P lt;0.05）. The accuracy rate of pathogen identification by morphological examination combined with MALDI-TOF MS technology was higher than that by rapid mass spectrometry identification， the difference was statistically significant （ P lt;0.05）. The identification accuracy rate of pure colonies of Gram-positive bacteria by morphological examination combined with MALDI-TOF MS technology was 97.62% ，and that of pure colonies of Gram-negative bacteria was 94.87%.Conclusion： Morphological examination combined with MALDITOF MS technology has high accuracy rate and rapid detection in theearly identificationof pathogenic bacteria in bloodstreaminfection，and itissuitable for earlydiagnosisand targeteddrug treatmentof patients with bloodstream infection.

[Key Words] Morphological examinationMatrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technology Bloodstream infection Pathogenic bacteria identification

First-author'saddress：Department of Laboratory Medicine，the Second People's Hospital of lingdezhen，Jingdezhen3330oo，China doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2025.18.035

血流感染病情危重、病死率高，屬病原菌入侵而出現(xiàn)的全身性感染疾病，臨床多使用抗感染治療為主[]。但隨著近年來抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株持續(xù)增加，血流感染發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年增高趨勢(shì)[2。在血流感染患者確診后，鑒定并獲取病原菌種、屬類型是保證藥物治療效果的基礎(chǔ)，以往多采取傳統(tǒng)生化鑒定方法，先行血培養(yǎng)確定為陽性，再行病原菌鑒定及藥敏檢測(cè)，以選擇對(duì)應(yīng)抗生素治療[3。但由于其培養(yǎng)、鑒別時(shí)間較長(zhǎng)，此時(shí)患者病情變化兇險(xiǎn)，不利于臨床早期治療，故尋找更有高效的病原菌鑒定方法成為臨床研究方向之二 [4]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massspectrometry，MALDI-TOFMS）技術(shù)是一種應(yīng)用較為廣泛的微生物鑒定方法，通過利用激光照射解吸電離技術(shù)和基質(zhì)共結(jié)晶體，促使病原體核糖體蛋白離子化，后在電場(chǎng)中可獲取其蛋白質(zhì)圖譜，與參考質(zhì)譜對(duì)照比較后可確定病原菌種類[5。在技術(shù)層面可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)生化鑒定的不足，具有簡(jiǎn)便、快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)，目前該技術(shù)可準(zhǔn)確鑒定分離提純后單菌落情況[?，F(xiàn)有醫(yī)療工作者提出，對(duì)于血流感染患者，先通過革蘭染色確定病原菌形態(tài)，再通過MALDI-TOFMS技術(shù)直接快速檢測(cè)臨床血培養(yǎng)報(bào)陽樣本，不需要分離提純，也可獲取其病原菌類型和種屬信息，更有利于病原菌早期鑒定和藥物治療，但在其鑒別準(zhǔn)確度上暫無統(tǒng)一共識(shí)[7-8]。對(duì)此，本研究為分析形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)在血流感染病原菌早期鑒定中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)有報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

回顧性分析2024年4—12月景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院收治的120例血流感染患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合血流感染診斷標(biāo)準(zhǔn)；血培養(yǎng)陽性;單病原菌感染；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他感染性疾??；樣本污染；有抗感染藥物治療史。其中男65例，女55例；年齡4＼～93歲，4＼～18歲3例，19＼～44歲14例，45＼～59歲20例，60歲及以上83例。本研究經(jīng)景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1儀器與試劑迪爾SmartMS5020全自動(dòng)生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)、梅里埃VITEK2Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、血培養(yǎng)陽性質(zhì)譜鑒定試劑、革蘭染色試劑、哥倫比亞血平板、玻璃試管，移液器、鑷子，大腸埃希菌ATCC25922等。

1.2.2血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的快速質(zhì)譜鑒定（1）取陽性血培養(yǎng)標(biāo)本 1mL 至離心管中；（2）加入 100μL 的裂解液I， 12000r/min 離心 2min ，去上層液體，后加入 1mL 清洗緩沖液，離心，去上層液體，重復(fù)清洗，以獲取蛋白質(zhì)富集物；（3）吸取少量富集物于靶板樣品孔內(nèi)，室溫自然晾干，加 1.5μL 裂解液Ⅱ覆蓋樣品，再次晾干，再加入 1μL 微生物質(zhì)譜基質(zhì)液覆蓋樣品，晾干后制備完成；（4）將靶板放入迪爾SmartMS5020全自動(dòng)生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，行快速質(zhì)譜檢測(cè)，得到病原菌蛋白質(zhì)圖譜，與其參考質(zhì)譜對(duì)照比較，以得到病原菌鑒定結(jié)果。

1.2.3形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)（1）先進(jìn)行血培養(yǎng)標(biāo)本革蘭染色形態(tài)學(xué)檢查，取陽性血培養(yǎng)標(biāo)本 100μL 轉(zhuǎn)移至玻片，涂片干燥消毒后行進(jìn)行革蘭染色，并獲取病原菌革蘭染色形態(tài)報(bào)告，確定為陽性標(biāo)本后，取陽性血培養(yǎng)標(biāo)本 100μL 轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血平板， 35°C5%CO₂ 溫箱培養(yǎng)；（2）再進(jìn)行轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，取轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的純菌落直接涂在靶板的樣品孔內(nèi)，加入 1μL 的裂解液I，室溫自然晾干；再使用微量移液器滴加 1μL 微生物質(zhì)譜基質(zhì)液覆蓋樣品；室溫自然晾干；（3）樣本制備完成，將靶板放人迪爾SmartMS5020全自動(dòng)生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，將得到病原菌蛋白質(zhì)圖譜，與參考質(zhì)譜比較，以得到病原菌鑒定結(jié)果。

1.2.4血培養(yǎng)陽性標(biāo)本轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的生化鑒定取陽性血培養(yǎng)標(biāo)本 100μL 轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血平板，35‰ （204 CO₂ 溫箱培養(yǎng)，取轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的菌落按照全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK2Compact的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程對(duì)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后菌落進(jìn)行生化鑒定，得到病原菌的鑒定結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)

以血培養(yǎng)陽性標(biāo)本轉(zhuǎn)種后培養(yǎng)的菌落生化鑒定

結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的快速質(zhì)譜鑒定、形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)的鑒定時(shí)間和準(zhǔn)確率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以 表示，組間比較采用 Φ_t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（ % ）表示，采用 χ² 檢驗(yàn)。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血流感染患者病原菌檢測(cè)結(jié)果

血培養(yǎng)陽性標(biāo)本轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的生化鑒定結(jié)果顯示，120例血流感染患者中，感染革蘭陽性菌42例（ 35.00% ），革蘭陰性菌78例（ 65.00% ），見表1。

形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)對(duì)革蘭陽性菌純菌落的鑒定準(zhǔn)確率為 97.62% （41/42），見表2。

2.3革蘭陰性菌不同鑒定方法的鑒定結(jié)果

形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)對(duì)革蘭陰性菌純菌落的鑒定準(zhǔn)確率為 94.87% （74/78），見表3。

2.4不同檢測(cè)方式的鑒定時(shí)間、準(zhǔn)確率比較

不同檢測(cè)方式的鑒定時(shí)間比較，快速質(zhì)譜鑒定lt;形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù) lt; 轉(zhuǎn)種后培養(yǎng)菌落生化鑒定，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt;0.05 ）。形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)對(duì)病菌鑒定準(zhǔn)確率高于快速質(zhì)譜鑒定，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt;0.05 ）。見表4。

3討論

血流感染患者住院治療時(shí)間較長(zhǎng)，醫(yī)療負(fù)擔(dān)較重，加之病情進(jìn)展迅速，早期鑒別病原菌類型對(duì)血流感染患者尤為重要[1]。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法是通過形態(tài)學(xué)和生理生化特征進(jìn)行分析，雖結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，但鑒定過程易受細(xì)菌活力、濃度等因素影響，樣本往往要先進(jìn)行培養(yǎng)、單菌落分離、再純化培養(yǎng)，以得到充分純化菌株，鑒定周期較長(zhǎng)，一般需要1＼～2d時(shí)間才能完成，故尋找更為高效的鑒定方法對(duì)成為臨床主要研究方向之一[11-12]。

本研究針對(duì)120例血流感染患者行病原菌鑒定發(fā)現(xiàn)，其中感染革蘭陽性菌42例，感染革蘭陰性菌78例，提示血流感染患者仍以感染革蘭陰性菌為主。而對(duì)比不同檢測(cè)方式的鑒定時(shí)間所得，快速質(zhì)譜鑒定 lt; 形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)lt;轉(zhuǎn)種后培養(yǎng)菌落生化鑒定，表明形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)可為血流感染患者快速診斷提供了一個(gè)新選擇。MALDI-TOFMS技術(shù)以病原菌核糖體蛋白為檢測(cè)對(duì)象，其蛋白質(zhì)圖譜主要取決于病原菌基因、遺傳因素，受培養(yǎng)時(shí)間、條件等外部因素影響較小，具有很好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，在對(duì)部分未純化的樣本直接檢測(cè)和鑒定時(shí)，可有效縮短檢測(cè)時(shí)間和報(bào)告獲取時(shí)間，為臨床早期治療提供參考[13-14]。

MALDI-TOFMS技術(shù)則是現(xiàn)階段基層醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室常使用的病原菌檢測(cè)方式之一，可精準(zhǔn)確定病原菌種屬，適合各種微生物進(jìn)行高通量的快速檢測(cè)[15]。本研究結(jié)果顯示，形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)對(duì)病菌鑒定準(zhǔn)確率高于快速質(zhì)譜鑒定，說明快速質(zhì)譜鑒定仍存在一定鑒定錯(cuò)誤情況，這可能與樣本前處理不當(dāng)、富集蛋白質(zhì)過少精準(zhǔn)度不高或與參考圖譜局限性有關(guān)[。分析原因，革蘭染色是臨床最常用的病原菌形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，可在短時(shí)間內(nèi)確定病原菌類別，雖不能精準(zhǔn)確定種屬，但在其參考圖譜對(duì)比中也能做到一定參考[17]。快速質(zhì)譜鑒定雖未經(jīng)過分離提純，但檢測(cè)對(duì)象仍是報(bào)陽標(biāo)本中的病原菌獨(dú)特蛋白質(zhì)，足以形成獨(dú)特的蛋白質(zhì)圖譜，通過對(duì)比特征性的模式峰可有效鑒定菌株，實(shí)現(xiàn)臨床快速診斷[18-19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)對(duì)革蘭陽性菌純菌落的鑒定準(zhǔn)確率為 97.62% ，形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)對(duì)革蘭陰性菌純菌落的鑒定準(zhǔn)確率為 94.87% ，也說明了先行菌落提純，再行MALDI-TOFMS技術(shù)可取得更高的準(zhǔn)確率，為臨床提供快速的病原菌鑒定，滿足病原學(xué)診斷、快速診療需求，滿足感染性疾病的精準(zhǔn)治療[20]。

綜上所述，形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合MALDI-TOFMS技術(shù)對(duì)病原菌的鑒定準(zhǔn)確率高，適用于血流感染患者早期鑒定，以便及時(shí)采取藥物治療措施，提高臨床抗感染治療成功率，縮短住院周期，降低治療費(fèi)用。

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（收稿日期：2025-04-30）（本文編輯：馬嬌）