結直腸癌的血漿糖蛋白質組學研究

【特約主持人】解新芳：西安交通大學第一附屬醫(yī)院教授，獲國家級青年人才項目

【主持人按語】癌癥嚴重威脅全球公共衛(wèi)生，肺癌與結直腸癌作為常見惡性腫瘤，其高致死率凸顯早期診斷的關鍵意義.當下迫切需要探尋高靈敏、高特異且無創(chuàng)或微創(chuàng)的診斷標志物.外泌體攜帶豐富生物分子參與腫瘤進程，在肺癌研究中，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體蛋白可區(qū)分患者與健康人群，部分蛋白與肺癌進展緊密相連；而在結直腸癌領域，非標記定量蛋白質組學揭示血漿蛋白質糖基化修飾差異可有效鑒別兩者，特定糖蛋白的糖肽表達與疾病進展顯著相關.本專欄聚焦此類研究，剖析腫瘤早期診斷新路徑，為癌癥防治提供科學依據(jù).

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種極具威脅的胃腸道惡性腫瘤.在全球范圍內，CRC 的發(fā)病率位居第三（占發(fā)病總數(shù)的 10.2% ），死亡率排名第二（占死亡總數(shù)的 9.4% ）[1].據(jù)統(tǒng)計，預計到2030年，結直腸癌的患病人數(shù)將達到220萬例，死亡人數(shù)將達到110萬例[2.流行病學調查研究表明，結直腸癌的發(fā)病率隨著年齡的增長而逐漸升高，同時還受到家族史、炎癥性腸病、吸煙、過度飲酒、肥胖和糖尿病等多種因素的影響[3.結直腸癌從良性腺瘤病變（息肉）發(fā)展成癌癥需要十多年的時間[4].在結直腸癌患者中，原位結直腸癌（I期）的5年相對生存率高達 90% ，而轉移性結直腸癌（V期）的5年相對生存率僅為 10%^[5] ，因此早期診斷對于提高患者生存率和降低腫瘤轉移率至關重要.目前，結直腸癌的診斷方法主要包括結腸鏡檢查[6、膠囊內窺鏡[7]、CT掃描[6]、糞便隱血檢測（FOBT）[8]以及癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原199（CA19-9）[9]等血清標志物檢測.盡管結腸鏡檢查被認為是診斷結直腸癌的金標準，具備較高的準確性，但由于其侵入性較強，患者的接受度有限[10].目前其余檢測方法在靈敏度和特異性等方面仍有不足，不能滿足臨床診斷需求.因此，迫切需要建立更微創(chuàng)、高靈敏度和高特異性的診斷方法，提高結直腸癌的早期診斷率和治療成功率.

生物標志物是存在于血液、尿液和腦脊液等體液或組織中的一種生物分子，能夠反映腫瘤疾病在特定時間內的生理狀態(tài)和疾病進程的變化[].癌癥生物標志物涵蓋了多種生化分子，包括DNA、RNA、蛋白質以及代謝產(chǎn)物等，在癌癥的風險評估、早期診斷、精準預后和治療效果評價等方面發(fā)揮著重要作用[12].糖基化修飾是細胞表面和分泌蛋白上的一種常見且結構復雜的翻譯后修飾類型，在多種生物過程中都起到至關重要的調控作用.例如，它不僅幫助蛋白質實現(xiàn)正確的折疊以確保其功能，還涉及細胞的附著、移動、信號傳遞以及在免疫過程中的識別等關鍵的生物過程[13].在腫瘤發(fā)展過程中，糖基化修飾經(jīng)常發(fā)生異常變化，導致腫瘤惡性特征的出現(xiàn)，如細胞的增殖、遷移和侵襲等[14].DOHERTY等[15]研究表明，結直腸癌患者在不同的癌癥階段其血漿N-糖基化修飾具有顯著的統(tǒng)計學差異.與健康人群相比，結直腸癌患者血液中核心巖藻糖類的雙觸角糖F（6）A2G2和F（6）A2G2S（6）1顯著降低（ ?Plt;0.000 9 ）.PARK等[16已證明膜錨定蛋白質受體上的 α 2，6- 聯(lián)結的唾液酸修飾能夠調控結直腸癌細胞的黏附、遷移和侵襲能力.總體而言，蛋白質糖基化修飾的研究對結直腸癌早期診斷具有重要意義，有望為開發(fā)更加準確、靈敏的腫瘤早期診斷方法提供新的途徑.

血液的動態(tài)變化能夠敏銳地反映患者疾病的病理生理狀態(tài)，提供從時間和空間上監(jiān)測疾病進展的獨特視角.血液檢測已經(jīng)融入常規(guī)生化檢測，其獨特之處在于穩(wěn)定性良好、無創(chuàng)性、易獲取性和長期保存等優(yōu)點.然而，CEA和CA19-9雖已被用作結直腸癌檢測和治療監(jiān)測的血液標志物，但它們的敏感性僅為 40%～ 70% ，特異性也僅為 73%～90%^[17] .因此，為了提升結直腸癌診斷的準確性，亟須探索更加精確的候選生物標志物.綜上，本研究基于超高分辨質譜分析技術，對結直腸癌患者的血漿樣本進行了系統(tǒng)性的蛋白質糖基化修飾組研究，深入探索結直腸癌患者血漿中糖基化修飾的異常改變，篩選具有高靈敏度、強特異性且易于篩查檢測的候選糖基化修飾生物標志物，為結直腸癌的早期診斷和預后篩查提供分子病理學支持.

1 材料與方法

1.1 實驗材料、儀器和研究對象

結直腸癌血漿糖蛋白質組學研究所用實驗材料和儀器見附錄表S1.結直腸癌患者和健康人的血漿樣本均由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院提供，本研究經(jīng)中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批，所有參與本項研究的受試者均簽署書面知情同意書.

1.2 糖蛋白質組分析的樣品制備

使用PierceTMTOP14試劑盒（賽默飛世爾科技）去除血漿高豐度蛋白，取 10μL 血漿樣品，采用試劑盒去除其前14 種高豐度蛋白質.用過濾器輔助樣品制備方案（filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP）酶切樣品蛋白[18-19].首先，將已去除高豐度蛋白樣品轉移到 30kDa 超濾管中并離心 15min. 加人尿素溶液 （8mol/L 尿素溶解在 0.1mol/L Tris-HCl 中， pH8.5AA 離心洗滌，加人 10mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）混勻后置于37^°C 恒溫箱中孵育 4h.12000r/min 離心 15min 除廢液，加入 50mmol/L 碘乙酰胺（IAA）混勻后室溫避光孵育 0.5h. 離心后再加入 10mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）室溫避光放置 15min，12 000r/min 離心.分別加人尿素溶液和 50mmol/L 碳酸氫銨（ABC）洗滌，重復3次.更換超濾管套管，加入 50mmol/L ABC 和 20μg （20胰蛋白酶進行蛋白酶切， 恒溫箱中孵育 ^16h 反應結束后離心收集肽段，依次加入水、 .50mmol/L ABC洗滌超濾管，離心收集洗脫液.使用 SpeedVac真空干燥離心機（Eppendorf）完全干燥肽段，回收肽段儲存在-80^°C ，用于糖肽富集.

利用已開發(fā)的HILIC方法[20]富集完整糖肽.首先，加入質量分數(shù) 0.1% 三氟乙酸（TFA）溶液活化Ve-nusil HILIC（5μm，10nm） 填料，重復3次.加人體積分數(shù) 80% 乙腈/體積分數(shù) 0.2% TFA溶液平衡填料，重復3次.回收肽段用體積分數(shù) 80% 乙腈/ 0.2% TFA溶液溶解，加入已活化平衡的HILIC填料，置于室溫旋轉混合儀上孵育 2h. 將混合物轉移到裝有C8膜的Tip 柱中，離心后再吸取管底離心液加人Tip 柱中離心.

加人體積分數(shù) 80% 乙腈/體積分數(shù) 0.2% TFA溶液洗滌除去未結合肽段.更換離心管，加入體積分數(shù) 0.1% TFA 溶液洗脫收集糖肽，重復操作 3次.使用 SpeedVac 真空干燥離心機（Eppendorf）熱干糖肽，儲存在一 80°C 用于LC-MS/MS分析.

1.3 LC-MS/MS質譜檢測分析

糖蛋白質組學分析，使用液質聯(lián)用（LC-MS/MS）儀器，包括納米電噴霧離子源的EASY-nLC 1200 液相色譜系統(tǒng)和 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質譜儀（賽默飛世爾科技）.加入A液溶解糖肽（A 液：體積分數(shù)0.1% 甲酸;B液：體積分數(shù) 80% 乙腈/體積分數(shù) 0.1% 甲酸），使用NanoDropOneC分光光度計（賽默飛世爾科技）在 205nm 的吸光度下測定糖肽濃度，如前所述[21].

取 1μg 的糖肽加載到直徑 100μm ，長度 30cm 色譜柱中 （1.9μm ReproSil-Pur C18-AQ;Dr. Maisch）.采用 90min 梯度洗脫糖肽，流速為 600nL/min. 梯度組成： 0～8min，5%～10%B;8～68min，10%～22% B;68～82min ， 22%～32% B； 82～88min ， 32%～90% B和 88～90min，90% B.質譜設置參數(shù)如下：Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質譜儀設置采用OT-OT模式；一級質譜掃描的 AGC 目標值為 400 000;掃描的質量范圍 8002000m/z ；分辨率為120000；離子最大注入時間為 100ms. 二級質譜掃描AGC目標值為50 000；分辨率為15000，離子最大注入時間為 250ms ，使用高能碰撞解離（HCD）對26電荷的母離子進行碎裂，階梯碰撞能量為 20% ， 30% 和 40% ；動態(tài)排除時間為 15s ，質量數(shù)據(jù)由XCalibur進行實時采集.

1.4 質譜數(shù)據(jù)分析

使用人類 Swiss-Prot蛋白庫（版本 20220329，20 376個序列）通過 pGlyco[22]和 PANDA 軟件分析完整糖肽原始質譜文件.修飾包括 Carbamidomethylation（C）、Acetyl（Protein N-term）、Deamidation（N）和 Oxi-dation（M）.通過將“N\"改為\"J\"來修飾N-糖基化序列.母離子質量偏差（mass tolerance）為士 =0.000 4% ，子離子質量偏差（peptidetolerance）為 ±0.002 0% ，允許2個漏切位點.完整糖肽鑒定的質量控制方法設置為FDR小于 1% ，其他設置參數(shù)選擇默認值.

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析使用Perseus[23]完成.N-糖肽的顯著性閾值設置為 Plt;0.05 ，兩者的倍數(shù)變化 ≥|1.2| .采用Benjamini-Hochberg（BH）程序進行多次測試校正.篩選出的差異基因，使用ClusterProfiler 4.0^[24] 做GO（gene ontology）和 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析.使用 String 進行蛋白互作分析（PPI）[25]，PPI網(wǎng)絡使用 Catoscape優(yōu)化，關鍵基因使用cytoHubba插件篩選.

2 結果

2.1蛋白質糖基化修飾組質譜數(shù)據(jù)采集與數(shù)據(jù)解析

本研究運用超高分辨質譜技術，針對5例結直腸癌患者和5例健康人的血漿樣本，進行了糖基化修飾組的系統(tǒng)性質譜數(shù)據(jù)采集，研究技術路線如圖1所示.

首先，借助 PierceTM TOP 14 試劑盒，有效去除了血漿中14 種高豐度蛋白質，減少可能對后續(xù)分析造成干擾的因素.然后，采用FASP肽段酶切方案，成功獲取了肽段序列.隨后，利用HILIC糖肽富集方案，完成糖基化修飾肽段富集，有效提高了糖基化修飾肽段的檢測靈敏度.最后，基于Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀器，完成了肽段信息的質譜數(shù)據(jù)采集，并通過pGlyco 和 Panda軟件完成了質譜數(shù)據(jù)的定性與定量分析.通過數(shù)據(jù)解析，本研究在10例樣本中共鑒定出2175條完整N-糖肽，平均鑒定數(shù)為1959條，涉及161個糖蛋白質（附錄圖S1（a））、475種N-聚糖和245個N-糖基化修飾位點（附錄圖S1（b））.

2.2蛋白質糖基化修飾組的細胞定位與功能

通過細胞定位的富集分析，本研究鑒定到具有糖基化修飾的血漿蛋白質主要聚焦在28個細胞組成模塊內.這些模塊進一步歸納為7個網(wǎng)絡模塊，它們主要定位于囊泡腔、膜攻擊復合物、血小板致密顆粒、血漿脂蛋白顆粒、細胞外基質、三級顆粒、特定顆粒腔等細胞結構，如圖2（a）所示.生物學過程的富集分析結果表明，所鑒定的血漿糖蛋白質主要集中于209個信號通路中，并被整合為18個相似的網(wǎng)絡模塊.這些模塊主要與補體激活、血管重塑、趨化反應、纖維蛋白凝塊生成、纖維蛋白溶解、血管新生、酶原的激活、血液凝固、吞噬機制、肽酶活性、血漿脂蛋白顆粒的重塑以及細胞外基質成分的分泌等生物學過程有關，如圖2（b）所示.

2.3 結直腸癌血漿的差異表達糖基化肽段

為了系統(tǒng)地篩查結直腸癌血漿中差異表達的糖基化肽段，對結直腸癌患者與健康人的血漿蛋白質糖基化修飾進行了對比分析，并采用 t -檢驗作為主要評估工具.與健康人群相比，結直腸癌患者的血漿中鑒定出152條差異表達的完整N-糖肽，其中63條呈現(xiàn)上調表達趨勢和88條呈現(xiàn)下調表達趨勢，如圖3（a）和3（c）所示.利用無監(jiān)督的主成分分析（PCA），第一主成分表征了 60.3% 的完整N-糖肽變量，第二主成分表征了 9.2% 的完整N-糖肽變量，如圖3（b）所示.基于差異表達的完整N-糖肽，本研究在第一主成分和第二主成分上能夠有效區(qū)分結直腸癌患者與健康人群.結果表明，血漿中的糖基化修飾水平變化可以作為結直腸癌早期診斷的有效指標.

2.4差異N-糖肽的功能注釋

利用ClusterProfiler軟件，針對差異表達的完整N-糖肽展開功能富集分析，其中主要參照基因本體（GO）和KEGG的信號通路.分析結果表明，差異表達的完整N-糖肽在細胞結構上，顯著富集在細胞外基質（collagen-containing extracellular matrix）、囊泡腔（vesicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、細胞質囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）和內質網(wǎng)腔（endoplasmic reticulum lumen）等結構上.差異表達N-糖肽主要參與了硫化合物結合（sulfur compound binding）、糖胺聚糖結合（glycosaminoglycan binding）、肝素結合（heparin binding）、酶抑制劑活性（enzyme inhibitor activity）和內肽酶抑制劑活性（endopeptidaseinhibitor activity）等分子功能.此外，差異表達的完整 N-糖肽還參與了體液免疫反應（humoral immune re-sponse）、凝血的負調節(jié)（negative regulation of coagulation）、內肽酶活性的負調節(jié)（negative regulation ofendopeptidase activity）、纖溶（fibrinolysis）和補體激活（complement activation）等生物學過程（圖4（a））.在KEGG 信號通路中，差異表達的完整 N-糖肽主要參與了補體和凝血級聯(lián)（complement and coagulation cas-cades）肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)（regulation of actin cytoskeleton）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuro-active ligand-receptor interaction）、膽固醇代謝（cholesterol metabolism）和 ECM受體相互作用（ECM-re-ceptor interaction）等信號通路（圖 4（b））.其中，膽固醇代謝和ECM受體等信號通路已明確報道與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關系[26].

2.5 蛋白質相互作用網(wǎng)絡分析及候選標志物篩選

采用蛋白質相互作用網(wǎng)絡（PPI）分析方法，進一步對差異表達完整N-糖肽的蛋白相關性進行深入分析，擬獲得具有代表性的糖基化修飾候選生物標志物.基于Cytoscape軟件，采用cytoHubba 插件對蛋白質相互作用網(wǎng)絡（PPI）進行了系統(tǒng)性分析，篩查獲得了1O個具有代表性的候選生物標志物，主要包括KNG1、F2、FGB、HRG、APOH、APOB、ORM2、AHSG、ORM1 和 SERPIND1等糖蛋白質（圖5（a，b）.相對于健康人群而言，結直腸癌患者 FGB蛋白質的完整 N-糖肽GTAGNALMDGASQLMGEN394R_HexNAc5Hex4，AH-SG蛋白質的完整N-糖肽KVCQDCPLLAPLN156DTR_HexNAc3Hex7Fuc2，ORM1蛋白質的完整N-糖肽NEEYN56K_HexNAc6Hex5NeuAc2Fuc3等表達量顯著上調；KNG1蛋白質的完整N-糖肽LNAENN294ATFYFK_HexNAc6Hex10，ORM2 蛋白質的完整 N-糖肽 QN88QCFYJSSYLNVQR_Hex-NAc6Hex5NeuAc3，APOH蛋白質的N-糖肽 LGN253WSAMPSCK_HexNAc7Hex4NeuAc1等表達量顯著下調，如圖5（c）所示.此外，研究系統(tǒng)分析了FGB蛋白質的完整N-糖肽GTAGNALMDGASQLMGEN394R_HexNAc5Hex4的質譜圖，并進行標注，證明了質譜分析結果的可靠性，如附錄圖S2所示.

3討論

目前，在結直腸癌的早期診斷中，CEA是應用最廣泛的血漿生物標志物.此外，還有CA19-9、CA242、CA50、CA74-2和TIMP-1等生物標志物，但其敏感性和特異性表現(xiàn)都不佳[9].此外，現(xiàn)行的臨床篩查手段包括糞便隱血檢測、結腸鏡、膠囊內窺鏡及CT掃描等[6-7]，但由于某些篩查方法可能帶來的風險或不適，尋找無創(chuàng)或更為敏感和特異的生物標志物顯得尤為重要.本研究利用非標記的糖基化修飾蛋白質組分析技術成功鑒定了152條與結直腸癌有關的差異表達N-糖肽，涉及47種糖蛋白.其中63條N-糖肽呈現(xiàn)上調，而88條呈現(xiàn)下調.基于以上發(fā)現(xiàn)，篩選出了10種可能作為結直腸癌血漿生物標志物的候選蛋白質多肽，包括KNG1、F2、FGB、HRG、APOH、APOB、ORM2、AHSG、ORM1 和 SERPIND1 等.APOB 和 HRG 蛋白質及其糖基化修飾的差異表達已被文獻報道與結直腸癌發(fā)生發(fā)展有關.APOB主要負責脂質的運輸，研究發(fā)現(xiàn)處于不同階段的結直腸癌患者，其血漿中的APOB蛋白表達量均有顯著增高，且其糖基化修飾異常與結直腸癌的異常增生相關[27]，APOB可能是結直腸癌術后預后評估的有效生物標志物[28].另外，富含組氨酸的糖蛋白（histidine-rich glycoprotein，HRG）已被確認為一種有效抑制腫瘤血管生成的物質，它可以顯著減少腫瘤細胞的遷移、血管新生和生長[29].研究顯示，結直腸癌或腺癌患者的糖基化修飾存在異常變化，其中唾液酸和巖藻糖基化水平顯著上升，這暗示血液 HRG蛋白的 N-糖肽有望成為結直腸癌的潛在生物標志物[30].

此外，AHSG、APOH、FGB、KNG1、ORM1、ORM2、THRB 蛋白質差異表達被發(fā)現(xiàn)與結直腸癌有關.α -2-HS-糖蛋白（alpha-2-HS-glycoprotein，AHSG）已被報道參與人類的大腦發(fā)育、骨代謝調節(jié)[31]、胰島素抑制[2]、結直腸癌的遷移和侵襲[33等許多正常和病理過程.通過對健康人和結直腸癌患者的血清蛋白質組學分析，AHSG可能參與結直腸癌的發(fā)病機制，并可作為潛在的血清學診斷的生物標志物[34].同時，CHOI等[35]使用同種分析方法發(fā)現(xiàn)AHSG具有預測腺瘤向癌進展的診斷潛力.MA等[36]分析了血清樣本的蛋白質和代謝物譜，發(fā)現(xiàn)APOH可作為生物標志物，并驗證了它對結直腸癌診斷的潛力.纖維蛋白原由三對多肽鏈組成，分別命名為 α，β 和 γ ，這些鏈分別由 FGA，F(xiàn)GB（fibrinogen beta chain）和FGG 編碼.纖維蛋白原主要參與凝血、炎癥和血管生成.研究發(fā)現(xiàn)FGB在結直腸癌血漿中的蛋白表達量顯著上調，提示 FGB可作為結直腸癌患者早期診斷和了解腫瘤發(fā)生的血漿潛在生物標志物[37].另外，YANG 等[38]發(fā)現(xiàn)FGB作為肝轉移性結直腸癌的診斷和治療生物標志物起著關鍵作用.激肽原1（kininogen-1）在凝血過程中發(fā)揮重要作用，可抑制內皮細胞增殖和血管生成[39].已有研究發(fā)現(xiàn)KNG1在早期結直腸癌患者血清中的異常表達，表明該蛋白可能是早期檢測的潛在生物標志物[40].ORM1（alpha-1-acid glycoprotein）和 ORM2（alpha-2-acid glyco-protein）都屬于急性期蛋白，炎癥反應時含量增加.KASAHARA 等[41]發(fā)現(xiàn)ORM1對結直腸癌患者總生存期（OS）有顯著貢獻，提示ORM1可能是與OS密切相關的因素之一.GAO等[42」采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿ORM2水平，多因素分析表明，血漿ORM2是Ⅱ期結直腸癌患者總體和腫瘤特異性生存的獨立預后因素 （Plt;0.05） .在此之前，ZHANG等[43通過定量蛋白質組學分析，證明了ORM2可作為結直腸癌診斷的潛在生物標志物.凝血酶原（THRB）是凝血機制的重要組成部分.已明確報道凝血酶原在結腸腺癌的進展中發(fā)揮著廣泛的作用，THRB既促進原發(fā)腫瘤的生長，也促進循環(huán)腫瘤細胞形成遠處轉移的潛力[44].

綜上，本研究系統(tǒng)地鑒定了蛋白質糖基化修飾在結直腸癌患者血液中的差異表達模式，與早期關于結直腸癌的研究結果高度吻合，進一步驗證了血漿蛋白質糖基化修飾組學方法的穩(wěn)定性和準確性.除了之前報道的生物標志物外，我們還鑒定了SERPIND1作為新的結直腸癌潛在生物標志物.SERPINDl是一種糖蛋白及蛋白酶抑制劑，具有抑制凝血酶的活性，并與肝素、硫酸皮膚素及其他內源性糖胺聚糖發(fā)生相互作用[45].鑒于本研究的樣本量有限，為進一步確定 AHSG、APOH、FGB、KNG1、ORM1、ORM2、THRB 和 SER-PIND1與結直腸癌的相關性，未來將在更大的樣本隊列中進行驗證研究.同時，為確保所篩選生物標志物的精確性和穩(wěn)健性，后續(xù)研究還需進行相關生物學功能驗證實驗，進一步揭示其在結直腸癌發(fā)展過程中的分子角色和生物學意義.

附錄見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.08.11.0002）.

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Plasma glycoproteomic analysis of colorectal cancer

Zhao Yangl ，Zeng Jiaming ^1，2 ，Zhao Jiawei3，Meng Bo2 （1.Center for Advanced Measurement Science，National Institute of Metrology，Beijing looo29，China; 2. College of Chemical Engineering，Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang 10142， China；3.College of Life Sciences，China Jiliang University，Hangzhou 31oo18，China）

Abstract： Colorectalcancer isone of the most common malignant tumors worldwide，and its mortality risk is closely re lated tothe stageof earlydiagnosis.Toimprove patientprognosisand reduce mortality，identifying efective biomarkers for earlydiagnosisofcolorectalcanceriscrucial.Inthisstudy，label-freequantitativeglycoproteomics technologywasaiedto conductacomprehensiveanalysisof theglycosylationpaterns inplasma samplesfromcolorectalcancer patientsand healthyindividuals.Asaresult，152 diferential integratedN-glycopeptideswithupregulatedor downregulatedexpressionspecificto colorectalcancerpatients wereidentified，efectivelydistingushingbetweenhealthyindividualsandpatients.Furtheranalysis revealed that the specific expresionof integrated N-glycopeptides from proteins like KNG1，THRB，F(xiàn)GB，APOH，ORM2， AHSG，ORM1，and SERPINDl significantlycorrelates with the progressonofcolorectalcancer，offering substantialdata support for early disease diagnosis and screening.

Keywords： colorectal cancer; plasma; proteome; glycosylation modification; LC-MS/MS