基于生物信息學(xué)分析膿毒癥心肌病差異基因及潛在治療中藥預(yù)測

AbstractObjective：Toexplrediferentialgenesinsepticcardomyopathyandpreictionpotetiltherapeutictraditioal medicinesbasedonbioinformatics.Methods：GSE79962chipdatawasdownloadedfromthegeneexpresiondatabase.elevant diferentialyexpressedgeneswerescreenedusingRlanguage，andthediferentiallyexpressedgeneswereanalyzedinthegene ontologyandKyotoEncyclopedia GenesandGenomesdatabases.proteininteractionnetworkwasconstructedthroughthe STRINGwebsite.coregenesthediferentiallexpressedgeneswereanalyzedusingCytoscapestwareanditspluginCytoHuba. coregenesweremutuallymappedwiththemedicalontologinformationretrievalplatform （CoremineMedical）toscreentherelevant traditionalCineedicfrtetreatmentesusAtotal7diftillexpresedgeseresreedoutiding 77up-regulatedgenesand160down-regulated genes.pathwayenrichmentmainlyincludedthetransforminggrowth factorTGF） -β signalingpathwaytheadvancedadvancedglycationendproductAGE）advancedgycationendproductreceptor（RAGE）signling pathwayindiabeticcomplications，etc.Tekeycoregenesscreenedmainlyincludesignaltransducerandactivatortranscrition3 （STAT3），MYC，signaltransductiomolecule3（D3），UNB，serpincadeEmember1（SERPINE1），osphoiostideiae regulatorysubuni）andCAancerndingproteideltaCEBD）elevantrapeuticaditioalCnedii mainlyincludedisengierinsnpaeoelctfloratulptmeric，ubarbpanaxgsngtc.Concusionaalyisf diferentialy expressdgenesandkeycoregenesintissudycouldpromoteteunderstandingthepathogenesisSCMandprovide potentialgenetargetsandresearchanddevelopmentideasforthedevelopmentnewdrugsintraditionalmedicineforthe treatment SCM.

Keywordsseptic cardiomyopathy; bioinformatics; differentially expressed genes; medicine

膿毒癥心肌?。╯epsticcardiomyopathy，SCM）是膿毒癥中常見的并發(fā)癥之一，往往預(yù)示不良預(yù)后，顯著提高病人的死亡率1。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療SCM以改善病人臨床癥狀、降低再住院率及死亡率為主，但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無特異性治療方法，整體療效欠佳，故進(jìn)一步探討SCM的發(fā)病機(jī)制，挖掘潛在作用靶點(diǎn)，探索新的治療方法至關(guān)重要。近年來，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展，研究認(rèn)識到中藥可減輕SCM病人的心肌損傷，改善心功能[2，但在用藥規(guī)律方面尚缺乏系統(tǒng)的了解。目前，生物信息學(xué)技術(shù)已被用于篩選多種心血管疾病潛在生物學(xué)標(biāo)志及調(diào)控靶點(diǎn)，但對SCM的研究較少。因此，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)分析SCM的差異表達(dá)基因，進(jìn)一步探討其可能的發(fā)病機(jī)制，預(yù)測潛在干預(yù)中藥，歸納用藥規(guī)律。

1資料與方法

1.1基因芯片數(shù)據(jù)的收集及差異基因的分析

設(shè)置關(guān)鍵詞為“sepsis-inducedcardiomyopathy”，于美國國家生物技術(shù)信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBl）中的基因表達(dá)綜合（EeneExpressionOmnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。納入芯片標(biāo)準(zhǔn)為：1）臨床SCM病人標(biāo)本，排除細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；2）芯片需含有正常及SCM組織標(biāo)本；3）采用相同平臺的基因芯片。篩選得到數(shù)據(jù)集GSE79962后，使用R語言limma包對數(shù)據(jù)集中膿毒癥病人和非膿毒癥病人心肌組織的差異表達(dá)基因（differentiallyexpressedgenes，DEGs）進(jìn)行篩選。

1.2DEGs的基因功能注釋與通路富集分析

對DEGs進(jìn)行基因本體（GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。

1.3蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析和樞紐基因分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫將篩選得到的DEGs構(gòu)建成PPI網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape3.8.2軟件中的CytoHubba插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，通過聯(lián)合“MCC\"算法、“MNC\"算法、“Degree\"算法、“EPC\"算法、“DMNC”算法5種算法進(jìn)行顯著性節(jié)點(diǎn)蛋白篩選，選取5種算法的關(guān)鍵基因的交集，篩選DEGs中的樞紐基因（hubgenes）。

1.4樞紐基因的中藥預(yù)測分析

將得到的樞紐基因?qū)酸t(yī)學(xué)本體信息檢索平臺（CoremineMedical）進(jìn)行檢索，以 Plt;0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選獲得具有潛在治療作用的中藥。將所得到的中藥錄入MicrostExcel中，對得到的中藥進(jìn)行使用頻次、功效、歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1差異基因的表達(dá)

從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選得到符合要求的微陣列數(shù)據(jù)集GSE79962。根據(jù)設(shè)置條件校正后 Plt;0.05 和llogFCl gt;1 篩選數(shù)據(jù)集，最終獲得DEGs有237個(gè)，其中77個(gè)顯著上調(diào)，160個(gè)顯著下調(diào)。詳見表1、圖1。

2.2DEGs的GO功能注釋分析與KEGG通路富集分析結(jié)果

依據(jù)基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的作用，從生物過程（biologicalprocess，BP）、細(xì)胞組分（cellularcomponent，CC）及分子功能（molecularfunction，MF）方面對差異基因進(jìn)行GO及KEGG分析。在BP中，DGEs主要富集在肽酶活性的調(diào)節(jié)、內(nèi)肽酶活性的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)及活性氧的代謝過程；在CC中，主要富集在含細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的膠原蛋白、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、囊泡腔、分泌顆粒腔、血小板顆粒部分；在MF中，主要富集在氧結(jié)合、糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合、肽酶抑制劑活性、觸珠蛋白結(jié)合及晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合。KEGG通路富集主要包括糖尿病并發(fā)癥中的高級糖基化終產(chǎn)物（AGE）RAGE信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-3信號通路、低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用。詳見表2、圖2、圖3。

2.3 PPI及關(guān)鍵基因的預(yù)測結(jié)果

將DEGs導(dǎo)人STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，以TSV文件格式導(dǎo)出數(shù)據(jù)，再導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建；利用CytoHubba插件篩選蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，通過聯(lián)合“MCC\"\"MNC\"“Degree”“EPC\"“DMNC\"以上5種算法進(jìn)行顯著性節(jié)點(diǎn)蛋白篩選，選取5種算法的共同基因的7個(gè)核心基因作為關(guān)鍵基因：信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、MYC、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子3（SMAD3）JUNB、絲氨酸蛋白酶抑制劑亞家族E成員1（SERPINE1）磷酸肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（PIK3R1）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白delta（CEBPD）。詳見圖 4～ 圖10。

2.4潛在治療中藥的預(yù)測

將以上7個(gè)基因與CoremineMedical數(shù)據(jù)庫映射，以 Plt;0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選獲得具有潛在治療作用的中藥：丹參、黃芪、姜黃、大黃、人參、苦參、白芍、三七等多味中藥（見表3）。參考全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材進(jìn)行功效歸類頻次統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，清熱解毒藥的頻次最高，其次為補(bǔ)益藥、活血藥、利水藥及化痰藥。詳見表4。

3討論

SCM是一種由膿毒癥引起的可逆性雙側(cè)心臟功能障礙，在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。SCM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)失調(diào)、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、鈣調(diào)節(jié)紊亂、自主神經(jīng)調(diào)節(jié)失調(diào)和內(nèi)皮功能障礙。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫篩選得到滿足條件的芯片數(shù)據(jù)集GSE79962，共納入11例正常組織及20例膿毒癥心肌組織。分析得到DEGs共237個(gè)，其中包括77個(gè)上調(diào)差異基因和160個(gè)下調(diào)基因。將DEGs進(jìn)行GO分析，DEGs主要富集ECM結(jié)構(gòu)成分、炎癥反應(yīng)調(diào)控、活性氧、脂質(zhì)代謝等。KEGG富集分析中，TGF- ?{β 、糖尿病并發(fā)癥中AGERAGE、HIF-1等信號通路可能導(dǎo)致了膿毒癥心肌病的發(fā)生發(fā)展。研究表明，TGF- ?β 及TGF-β/Smad信號通路可通過影響免疫細(xì)胞及炎性因子參與調(diào)節(jié)膿毒癥炎癥反應(yīng)，故抑制TGF-β，/Smads通路可能改善膿毒癥導(dǎo)致的多器官功能障礙[3。此外，動(dòng)物模型證實(shí)，敲除TβR-I、TβR-I或Smad2/3可抑制成纖維細(xì)胞的活性，減少ECM相關(guān)基因的表達(dá)，減輕心肌纖維化，并改善心肌細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[4]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，AGEs/RAGE在高糖環(huán)境下，RAGE與AGEs的結(jié)合增多或活性增強(qiáng)，通過引起炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激致使血管內(nèi)皮損傷或心肌損傷[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)，AGEs和結(jié)締組織生長因子（CTGF）水平與心肌纖維化呈正相關(guān)[6]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia induciblefactor-1α，HIF-1α）可通過激發(fā)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制促進(jìn)HO-1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡作用[78]。此外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，SCM組大鼠心肌組織中HO-1mRNA、HIF-1αmRNA及其蛋白和炎性因子 TNF-α IL-8表達(dá)均明顯升高，表明炎性因子在膿毒癥過程中可通過升高內(nèi)源性HIF-1α、HO-1發(fā)揮抗炎、心肌保護(hù)作用[9]。

通過Cytoscape分析，獲得了7個(gè)關(guān)鍵基因，分別是STAT3、MYC、SMAD3、JUNB、SERPINE1、PIK3R1、CEBPD。其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）激活后發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，參與細(xì)胞的增殖、調(diào)亡及炎癥反應(yīng)等調(diào)控環(huán)節(jié)[10]。STAT3作為膿毒癥細(xì)胞內(nèi)主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，可通過調(diào)控miR-223的表達(dá)來減輕膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)[\"]。此外，STAT3通過誘導(dǎo)內(nèi)源性心肌保護(hù)因子清除自由基和穩(wěn)定生物膜，發(fā)揮保護(hù)心臟的作用[12]。SERPINE1作為纖溶酶原激活物抑制劑，已被證實(shí)可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡及纖維化，加劇心臟重塑，由此推測靶向抑制SPRPINE1分泌可能對防治SCM具有重要意義[13]。C-MyC作為原癌家族基因，可參與心肌的增殖、分化及調(diào)節(jié)心臟特殊基因的轉(zhuǎn)錄。研究表示，TGF-β/Smad3過表達(dá)能夠加快心肌組織纖維化改變，加快心臟膠原及細(xì)胞外基質(zhì)形成，減少蛋白酶合成，增加心肌肥大，導(dǎo)致心臟重塑，惡化病情[1415]。本研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵核心基因大多與炎癥、凋亡相關(guān)，由此可見，炎癥、缺氧應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等在SCM的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。

本研究篩選出作用于SCM病關(guān)鍵基因的中藥主要分為清熱類（苦參、黃連、黃芩、黃柏等）補(bǔ)虛類（人參、白術(shù)、當(dāng)歸、黃芪、麥冬等）、活血類（白芍、三七、丹參、郁金、莪術(shù)等）利水滲濕類（茵陳、茯苓、防己、雷公藤等）和化痰類（瓜萎、桑白皮、葶藶子）等，其中尤以清熱解毒類藥物居多，其次為扶正補(bǔ)虛及活血化癖藥物。

SCM病因病機(jī)錯(cuò)綜復(fù)雜，但總屬本虛標(biāo)實(shí)之病，發(fā)病離不開正虛、熱毒、血癡。劉清泉等認(rèn)為膿毒癥的病機(jī)為正虛毒損、絡(luò)脈瘀滯，王今達(dá)等[17觀點(diǎn)與其相一致，認(rèn)為邪毒、血瘀、正虛交互為患，正氣虧虛則是貫穿始終的病理基礎(chǔ)，毒互結(jié)為疾病發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，膿毒癥的臨床治療主要以清熱解毒、活血化瘀為主，兼顧益氣扶正，與本研究預(yù)測所得到的中藥相一致，其中氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）是中藥苦參的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其顯著抑制膿毒癥大鼠心肌組織中TGF-β和Smad2的活性，降低促炎性因子表達(dá)，以減輕心臟組織損傷、改善心功能[18]。人參總皂苷（total ginsenoside，TG）為中藥人參中提取的皂苷類活性物質(zhì)，吳梅秋等[19發(fā)現(xiàn)TG可激活HIF-1α、HO-1基因及蛋白表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，改善SCM大鼠心肌損傷，為SCM的治療提供潛在價(jià)值。此外，研究表明芍藥苷、黃芩苷可通過抑制TGF-β，/Smad通路，減少膠原產(chǎn)生，從而減輕心肌纖維化的發(fā)展[20-21]。此外，邪毒侵襲人體，消耗氣血津液，正氣虧損，腎陽虛不能溫化蒸騰水液，脾陽虛不能運(yùn)化水濕，痰飲內(nèi)停，上凌心肺，毒瘀痰阻于心脈，加重心臟功能衰竭。故治療上亦要重視溫陽利水，祛濕化痰，以期延緩病程。研究發(fā)現(xiàn)，茯苓四逆湯可能通過抑制炎癥反應(yīng)和免疫麻痹顯著減輕老年膿毒癥大鼠心肌損傷22。許梅等23運(yùn)用加味苓桂術(shù)甘湯合血必凈可抑制SCM病人心肌損傷，改善血流動(dòng)力學(xué)及預(yù)后。但目前尚未有研究闡明祛痰化濕類中藥治療SCM的作用機(jī)制，這或可為相關(guān)的藥理研究提供新思路。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)分析共篩選出了7個(gè)可能參與膿毒癥心肌病的發(fā)生和發(fā)展過程且與其預(yù)后密切相關(guān)的基因，這些基因可能通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、細(xì)胞凋亡等信號通路發(fā)揮作用。而化痰祛濕類中藥可為SCM病人的治療提供新方向。本研究雖對后續(xù)研究有一定的參考價(jià)值，但研究結(jié)果缺乏臨床試驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等支撐，因此未來仍需要深人研究以驗(yàn)證所得結(jié)論。

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