三七總皂苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及抗焦亡機制研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.14.007

EfectsofPanaxNotoginsengSaponinsonMyocardiallschemia-reperfusionInjuryinRatsandtheMechanismofAnti-pyroptosis ZHAOWeikun1，UTongtong'，UXiangwe，QNYang1，LUFengxia1，Yuting2，HUANGYul，OQ，UHuaxin，Ue

1.TheFirst AfaesiafuindaUveitunag，ina;uiicavsit99 Guangxi， China

Corresponding AuthorQINYang，E-mail：1258778506@qq.com;LYU Xiangwei，E-mail：lvxiangwei910 @ 163.com

AbstractObjective：ToobservetheefectofPanaxnotoginsengsaponins（PNS）onmyocardialischemia-repefusion（I）injuryand exploreitsmechanismrelatedtotheregulationofcardiomyocytepyroptosis.Methods：EighteenadultmaleSDratsweredividedintosham group，IR groupandPSgroupbyrandomnumbertablemethod，with6ratsineach group.Themodelwaspreparedbyligatigtheleft anteriordescendingcoronaryarteryAD）ofratswithischemiafor30minutesandreperfusionfor2hours.Theatsinthesamgroupand the IR groupwere intraperitoneally injectedwith normal saline（ 10mL/kg） ，while those in the PNS groupwere intraperitoneally injected with （20 PNS（50mg/kg） 30 minutes before modeling.The degree of myocardial injury was observed by hematoxylin-eosin（HE） staining.The expresionofcsteineaspartatespecicprotease-1Caspase1）asdetectedyimmunoistochemistryeexpresiosofCaspse1 andgasdermin D（GSDMD）proteincontentsinmyocardialtisseweredetectedbyWesternBlotResuts：Comparedwiththeshamgroup， thedegree ofmyocardialinjuryintheIRgroupwasaggravated，andtheproteinexpressionsofaspase-1andGDinceased Plt; 0.05）.ComparedwiththeIRgroup，thedegreeofmyocardialinjuryinthePNSgroupwasaleviatedandtheproteinexpressionsof Caspase-1 and GSDMD decreased（ ?∠1.5^′ .Conclusion：Panax notoginseng saponins could alleviate myocardial iR injury in rats，and its mechanism might relate to the inhibition of cardiomyocyte pyroptosis.

Keywordsmyocardialiscemiareperfusioninjuypanaxotogisengsapons;pyptosis;csteineaspasticaidspeificote1 （Caspase-1） ; gasdermin D（GSDMD）; rats; experimental study

急性心肌梗死（acutemyocardial infarction，AMI）發(fā)生時，早期治療可恢復缺血心肌的血液供應，降低死亡風險；持續(xù)的缺血狀態(tài)導致心肌細胞出現(xiàn)不可逆性損害。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術可快速恢復中斷的血流，是挽救存活心肌的有效方法。然而，恢復血流可能增加心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusioninjury，MiRl）引起的其他并發(fā)癥和心肌細胞死亡的風險。MIRI促進心肌組織釋放大量的炎癥細胞和氧自由基，細胞離子穩(wěn)態(tài)失衡，引起心肌細胞死亡，最終導致一系列結構和功能障礙[1]。細胞焦亡是一種作用機制和形態(tài)學上特殊的細胞死亡形式，認為是依賴炎性半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteine aspastic acid-specific protease-1，Caspase-1）水解消化道皮膚素D（gasderminD，GSDMD）的一種單核細胞死亡，進而募集較多炎性因子，并伴有炎癥級聯(lián)反應[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡在MIRI中顯著增加，是心肌細胞死亡的重要途徑[4]。三七總皂苷（panaxnotoginsengsaponins，PNS）是中藥材三七的主要提取物，具有多種藥理活性，包括抗炎、抗氧化、清除自由基等，可改善心肌細胞損傷[5]。相關研究顯示，PNS通過抑制氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡等改善MIRI，發(fā)揮心臟保護作用[。然而，國內外關于PNS與心肌細胞焦亡和MIRI關系的相關研究報道較少。本研究旨在探討PNS對大鼠MIRI的可能保護作用機制。

1材料與方法

1.1 實驗動物

選取18只無特定病原體（SPF）級SpragueDawley（SD）雄性大鼠，體質量 200～2309 。所有實驗過程均經(jīng)桂林醫(yī)科大學動物倫理委員會批準（編號：GLMC201903060）。大鼠飼養(yǎng)在12h光照/黑暗循環(huán)交替下，溫度 20～25^°C ，濕度 50%～60% ，通風較好，安靜無噪聲，予以合適的潔凈水及標準動物飼料，術前12h禁食，不禁水。大鼠在麻醉狀態(tài)下進行有創(chuàng)操作，減輕大鼠的疼痛。

1.2 實驗試劑

抗體GSDMD、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、Caspase-1購自上海Abcam公司；二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量分析試劑盒購自Beyotime公司（Changsha，China）。

1.3實驗分組

隨機將SD大鼠分為假手術組、IR組和PNS組，各6只。予以 1% 戊巴比妥鈉（ 40mg/kg 對大鼠進行腹腔麻醉，麻醉后固定在動物手術臺，氣管插管后，使用小型動物呼吸機進行通氣。之后在胸骨左緣第4肋間實施開胸手術，打開心包，充分暴露心臟。假手術組大鼠開胸后僅在左前降支（LAD）下穿6/0尼龍線在活結中，使結扎末端外露；IR組距離LAD根部 4mm 處結扎 ，松開結扎線，再恢復血流灌注 2h 。PNS組SD大鼠于造模前 0.5h 予腹腔注射PNS 50mg/kg^[7] ；假手術組和IR組大鼠腹腔注射生理鹽水 10mL/kg 。

1.4心肌組織病理學變化

再灌注結束后立即將解剖出來的心臟以生理鹽水清洗血液，將心臟在 4% 多聚甲醛溶液中浸泡，石蠟包埋，制成 5μm 厚的石蠟薄片，在二甲苯I中浸泡脫蠟，梯度乙醇水化，用蒸餾水洗滌，之后進行蘇木精-伊紅（hematoxylinandeosin，HE）染色。染色結束后予以樹脂進行封片，并在光學顯微鏡（200倍）下，觀察心肌病理學改變。為定量評估心肌損傷，由2名實驗方案不知情的獨立觀察者對切片進行損傷評分8，形態(tài)學標準：0分為無損傷；1分（輕度）為間質水腫和局灶性壞死；2分（中度）伴有廣泛的心肌細胞腫脹和壞死；3分（嚴重）伴有收縮帶、毛細血管壓迫性壞死和炎性細胞浸潤;4分（危重度）指彌漫性壞死伴收縮帶、中性粒細胞浸潤和出血。

1.5免疫組化檢測細胞焦亡Caspase-1蛋白表達

按試劑盒說明書操作進行，石蠟切片經(jīng)二甲苯及梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水化，修復抗原，將玻片置于內源性過氧化物酶阻斷劑中孵育 10min ，血清封閉，室溫孵育 20min ，一抗（Caspase-1）孵育， 4^°C 冰箱中保存過夜；二抗孵育 15min ，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯示液顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，吹干后封片。使用光學顯微鏡觀察每個標本，并隨機選取的樣品予以200倍放大。

1.6蛋白免疫印跡法（WesternBlot）檢測細胞焦亡相關蛋白的表達

取 100mg 剪成碎片的心肌組織置于生理鹽水中清洗，在含有 1% 苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA緩沖液中充分勻漿 30min ，裂解后轉移到 1.5mL 的離心管中，以 12000r/min ， 4^°C 離心 10min ，將收集的上清液煮沸 5min ，使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度，蛋白質在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上運行，并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。之后將PVDF膜與一抗（Caspase-1、DSDMD、GAPDH）室溫孵育過夜，之后經(jīng)辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫下孵育2h，通過化學發(fā)光系統(tǒng)檢測蛋白。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用GraphPadPrism6.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)士標準差 表示，3組間比較采用單因素方差分析。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1PNS對大鼠心肌病理結構的影響

假手術組大鼠心肌細胞排列規(guī)則，心肌組織纖維整齊，無纖維結構異常；與假手術組比較，IR組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞核散亂無序，心肌組織肌纖維紊亂甚至斷裂、肌絲溶解等病理變化，心肌損傷分數(shù)增加（ Plt;0.05） ；與IR組比較，PNS組心肌細胞排列較為完整，壞死心肌細胞減少，心肌組織纖維排列較整齊、形態(tài)較完整，心肌損傷分數(shù)降低（ Plt;0.05 ，心肌損傷得到明顯改善。詳見圖1、圖2。

圖13組心肌組織病理學改變（HE染色， ×200 一

圖23組心肌損傷分數(shù)比較（IR組與假手術組比較， 與IR組比較， #Plt;0.05 ）

2.2PNS對大鼠心肌細胞焦亡相關蛋白表達的影響

免疫組化驗證Caspase-1的表達水平，Caspase-1蛋白心肌細胞質黃色或棕黃色為陽性細胞表達。與假手術組比較，IR組Caspase-1蛋白表達增加；與IR組比較，PNS組Caspase-1蛋白表達減少（ Plt;0.05 。詳見圖3、圖4。

圖33組心肌細胞焦亡蛋白Caspase-1光鏡圖（免疫組化， ×200 一

圖43組心肌組織Caspase-1定量分析變化（IR組與假手術組比較， ：與IR組比較， #Plt;0.05 ）

與假手術組比較，IR組焦亡相關蛋白Caspase-1、GSDMD增高；與IR組比較，PNS組焦亡相關蛋白Caspase-1、GSDMD降低（ Plt;0.05， 。PNS可一定程度抑制MIRI導致的心肌細胞焦亡。詳見圖 5～ 圖7。

圖53組心肌組織Caspase-1、GSDMD蛋白表達條帶圖

3討論

MIRI具有較高的致殘率、致死率，顯著影響AMI病人的臨床療效和長期預后。目前，MIRI可能發(fā)生的機制主要涉及鈣超載、氧化應激、線粒體損傷、炎癥反應和自噬等[9-11]。區(qū)別于心肌細胞死亡的其他形式，細胞焦亡是新發(fā)現(xiàn)的、具有高度的促炎性，由Caspase-1介導激活和GSDMD執(zhí)行的程序性細胞死亡過程。細胞焦亡與MIRI的經(jīng)典機制相互交織[12-16]，激活炎癥小體，活化Caspase-1，引發(fā)細胞焦亡，進而加重MIRI。故抑制心肌細胞焦亡對改善MIRI有重要的臨床意義。

本研究構建MIRI模型，結果顯示，PNS可減輕缺血大鼠病理結構改變及心肌損傷程度減輕；IR組Caspase-1和GSDMD蛋白升高，提示MIRI可能是由于誘導心肌細胞焦亡引起的，應用PNS可顯著降低焦亡蛋白Caspase-1和GSDMD表達，減輕MIRI。

細胞焦亡是一種新型細胞程序性死亡，依賴于活化的Caspase-1，介導執(zhí)行GSDMD使細胞質膜形成孔隙，進而發(fā)生脹大直至細胞膜破裂，釋放大量細胞內容物，其特征表現(xiàn)為Caspase-1活化、細胞膜孔形成及促炎因子的細胞外釋放。其中，Caspase-1對細胞焦亡發(fā)揮著關鍵作用。在細胞模式識別受體的介導下，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3、凋亡相關斑點樣蛋白和Caspase-1前體組成炎性小體，進而引起3個蛋白的結構域暴露，之后結構域緊密結合，激活無活性的Caspase-1，進一步裂解促炎性細胞因子前體轉變?yōu)槌墒祗w，導致炎性生物活性物質釋放至細胞外，從而募集更多的炎性細胞，炎癥反應被放大，啟動下游一系列的炎癥應答，導致疾病的發(fā)生與發(fā)展[17]。相關研究發(fā)現(xiàn)，炎癥小體介導的Caspase-1活性增強，進而誘導細胞焦亡在MIRI中發(fā)揮重要作用1]。敲除Caspase-1可顯著縮小心肌缺血面積，改善MIRI后心室重構，表明Caspase-1可能是減輕MIRI的有效靶點之—[19]。使用Caspase-1抑制劑可預防心肌損傷，減輕再灌注損傷[20]。本研究結果顯示，IR組心肌損傷程度嚴重，Caspase-1蛋白表達增加；應用PNS后，心肌損傷程度減輕，Caspase-1蛋白表達降低。提示PNS可能通過抑制Caspase-1，進而調控焦亡，減輕MIRI。

GSDMD是Gasdermin結構域保守蛋白家族中機制研究明確的蛋白，主要通過依賴Caspase-1的經(jīng)典細胞焦亡途徑，可一定程度反映機體的細胞焦亡過程和炎癥水平[21]。細胞焦亡發(fā)生時，在激活的Caspase-1介導下，GSDMD蛋白被分割成C端和N端結構域，GSDMD-N識別并結合細胞膜上的磷脂類分子后，形成細胞膜表面孔道，進而導致細胞腫脹，質膜裂解，細胞內容物的泄漏及炎性因子的釋放，進而介導細胞焦亡[22]。炎性因子釋放進一步激發(fā)細胞裂解信號途徑，最終引發(fā)細胞死亡；GSDMD可激活由炎癥小體介導的Caspase-1，促使細胞焦亡持續(xù)發(fā)生[23]。相關研究顯示，心肌細胞中GSDMD缺失使心肌梗死面積顯著縮小，GSDMD基因缺失阻斷了MIRI誘導的心肌細胞焦亡[24]。本研究結果顯示，IR組焦亡蛋白GSDMD含量增高；應用PNS后，可降低焦亡蛋白GSDMD的表達。

綜上所述，心肌細胞死亡是MIRI的終末事件，涉及的相關分子機制復雜。細胞焦亡是一種高度促炎的細胞死亡形式，主要是由Caspase-1、GSDMD兩個關鍵蛋白參與，與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究結果提示，心肌細胞焦亡與MIRI密切相關，PNS對MIRI具有明顯的保護作用，其機制可能與下調心肌細胞焦亡蛋白Caspase-1、GSDMD表達，減少心肌細胞焦亡有關。本研究存在一定的局限性：未檢測白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等炎性因子；針對PNS以何種路徑介導抑制心肌細胞焦亡的機制尚未明確，有待深入研究，以期為MIRI的臨床預防和治療提供可能的新思路。

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