DNMT1對慢性心力衰竭模型大鼠心肌纖維化的 影響

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.14.009

The Effect DNMT1on Myocardial Fibrosis in Ratswith Chronic Heart Failure Models CHENGNa，HANJing，SHANZimei

， ，， CorrespondingAuthorSHAN Zimei，E-mail：1641597337 @ qq.com

AbstractObjective：ToexploretheefectDNAmethyltransferase1（DN1onmyocardialfibrosisinratswithchronicheartfailure （CHF）modelsandismolecularmechanismMethods：The SDratswererandomlydividedintoShamoperation（Sham）group，CHFgroup， si-NCgroupandsi-DNMT1group.ExceptfortheShamgroup，theCHFmodelswerereplicatedthroughabdominalaorticcoarctation.The abdominalaortatheratsintheShamgroupwasisolatedbutnotligatedAftertheoperationthesi-NCgroupandthesi-DN1group wereinjectedwithngativecontroentivirusandDsiNArecombinantentivirusthroughmyocarduminjectionrespectielye leftentricularjefracti），fttriculareate（，fttriculastolameterdl ventricularend-systolicdiameterLVESD）ratsineachgroupweredeterminedbyDopplerulrasoundTehistopathologicalchanges myocardialtissesratsineachgroupwereobservedbyhematoxylin-eosin（HE）staining.Masonstainingwasusedtooservethe myocardialtissefibrosis.Theexpressionsmoothmuscleactin（-SMA）inmyocardialtissuesratsweredetectedby immunuoresecsainnexpresoeflndliadalisssrtseeeeti fluorescencequantativepolymerasechainreaction（qRT-PCR）andWestemBlotResults：ComparedwiththeShamgroupthereltive expression levels DNMT1mRNA andprotein in themyocardial tissue CHF group wereupregulated Plt;0.05） ，LVEFandLVFS decreased Plt;0.05） ，LVEDDand LVESDincreased Plt;0.05） ，andthearrangement myocardial cellswasdisordered，with necrosisor degeneration.The blue-stained fibrous tissuewas significantly more abundant，CVF increased Plt;0.05） ，the expression α -SMA labeled withred fluorescence increased Plt;0.05） ，and the relative expressions CollagenIand Collagen Il mRNA and protein significantly upregulated Plt;0.05） .Compared with the CHF group，the LVEF and LVFS rats in the si-DNMT1 group increased Plt;0.05） ，LVEDD andLVESDdecreased Plt;0.05） ，myocardial cellinjury improved，blue-stained fibrous tissuewasreduced，CVFdecreased Plt;0.05） ，and theexpression a -SMAlabeledwithred fluorescencedecreased Plt;0.05） .Therelative expressions Collagen Iand Collagen IlI mRNA andprotein both down-regulated Plt;0.05） .Conclusion：The expression DNMT1 increasedinthemyocardial tissue CHFmodelrats.IibitonDNexpressionculdimproemyocardialfibrosisandexertsomeprotectiveefetoncardacfuntio. Keywordschronicheartfailure;myocardialtissue;DNAmethytransferase1;myocardialfibrosis;rats;experimentalstudy

慢性心力衰竭（chronicheartfailure，CHF）是一種復(fù)雜的臨床綜合征，由各種心血管疾病導(dǎo)致的心臟收縮或舒張功能障礙，包括缺血性心臟病、高血壓、心肌病等，心泵功能障礙引起心排血量減少，組織和器官灌注不足或靜脈系統(tǒng)充血，伴有心室重塑，導(dǎo)致衰竭心臟進(jìn)行性惡化[1。隨著不良生活方式和心血管疾病病人生存期延長，導(dǎo)致風(fēng)險因素增加，CHF患病率逐年升高，全球每年因其死亡的病人約720萬例[2-3]。因長期治療和病情反復(fù)產(chǎn)生巨額的醫(yī)療費(fèi)用，使得CHF成為日益嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題。

DNA甲基化是哺乳動物的一種表觀遺傳修飾，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。DNA甲基化改變參與心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，DNA發(fā)生甲基化后，引起相關(guān)蛋白質(zhì)無法正確識別DNA，DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方式發(fā)生改變，導(dǎo)致反向基因轉(zhuǎn)錄沉默，無法發(fā)揮相應(yīng)的生理功能，影響心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[45]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNAmethyltransferase1，DNMT1）是DNA復(fù)制過程中負(fù)責(zé)維持DNA甲基化模式的酶，相關(guān)研究表明，下調(diào)DNMT1可抑制心肌成纖維細(xì)胞的過度增殖，可能發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用[。但關(guān)于DNMT1對CHF的影響及其是否在體內(nèi)參與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展尚未明確。本研究通過構(gòu)建CHF大鼠模型檢測DNMT1表達(dá)變化，探討靶向下調(diào)DNMT1對CHF大鼠心肌纖維化的影響及其可能的作用機(jī)制，以期為預(yù)防或治療CHF后心肌纖維化提供新思路。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康雄性SD大鼠38只， 8～10 周齡，體質(zhì)量 150～180g ，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)動物房內(nèi)，溫度（ 22±2）^°C ，相對濕度 50±10% ，光照/黑暗各12h循環(huán)，通風(fēng)良好。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水?dāng)z食，提供充足飼料源。本研究動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)（編號：IACUC20181020-01）。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與材料

陰性對照慢病毒和DNMT1SiRNA重組慢病毒購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司；基因引物交由上海生工生物科技有限公司合成；組織RNA提取試劑盒（Trizol法）購自上?；钌锟萍加邢薰?；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和基因熒光定量檢測試劑盒購自日本Takara公司;RIPA裂解液和蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（進(jìn)口原裝）和電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液購自上海碧云天生物研究所；馬松（Masson）染色試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）購自上海優(yōu)利科生命科學(xué)有限公司；TritonX-100購自美國Sigma-Aldrich公司，兔源 α -平滑肌肌動蛋白（ α-SMA ）多克隆抗體購自美國Boster公司，兔源膠原蛋白I型（CollagenI）、膠原蛋白Ⅲ型（CollagenⅢ）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體、AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔均購自英國Abcam公司。

1.3方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)造模

參照文獻(xiàn)[7]方法建立CHF模型，將30只大鼠術(shù)前禁食8h，采用戊巴比妥鈉麻醉后，腹部備皮、消毒，沿腹正中切口，分層打開腹腔，在左腎動脈上方鈍性分離腹主動脈，將8號注射針頭平行置于動脈外壁，在距腹主動脈、腎靜脈交匯處以上約 3cm 處腹主動脈旁，用4號手術(shù)絲線將二者一起扎緊后，迅速拔出針頭，縫合關(guān)腹。假手術(shù)組（Sham組）將4號絲線置于腹主動脈相同位置但不結(jié)扎；術(shù)后，大鼠腹腔注射青霉素預(yù)防感染，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理

30只大鼠造模過程中6只大鼠死亡，將造模成功的24只大鼠隨機(jī)分為CHF組、si-NC組、si-DNMT1組，每組8只；剩余8只大鼠作為Sham組。造模后次日，si-NC組、si-DNMT1組分別用微量注射器將陰性對照慢病毒、DNMT1SiRNA重組慢病毒進(jìn)行心肌內(nèi)注射，每次注射 5μL ，每周1次，持續(xù)8周；Sham組和CHF組注射等量生理鹽水。

1.3.3實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）

取心肌組織，Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說明書操作，采用分光光度計測定RNA純度和濃度。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，按照熒光定量檢測試劑盒說明書配置 25μL 體系，在7500Real-TimePCR系統(tǒng)上，設(shè)置條件為95 °C 30s;95 ^°C 、5s; 60^°C 、30s;共40次循環(huán)。所得數(shù)據(jù)以 2^-ΔΔα 法計算，以GAPDH作為內(nèi)參基因，分析各個待測樣本內(nèi)目的基因mRNA相對表達(dá)量。各基因引物序列：GAPDH正向引物 5^′ -TGGAAGGACTCATGACCACA- 3^′ ，反向引物 5^′ -GAGGCAGGGATGATGTTCTG- 3^′ ;CollagenI正向引物 5^′- CTGGCTCTCCTGGTACCCCT- 3^′ ，反向引物 5^′ -GGACCACGTTCACCACTTGCT- 3^′ ; CollagenII正向引物 5^′ -AAGGGCAGGGAACAACTGAT- 3^′ ，反向引物 5^′ -GGTGAAGCAGGGTGAGAAGA- 3^′。

1.3.4蛋白免疫印跡法（WesternBlot）測定

使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取心肌組織的總蛋白，冰上裂解 30min，4^°C 條件下，以12000r/min離心 10min ，吸取上清，BCA法測定上清液中蛋白濃度。高溫煮樣，使蛋白變性，取等量蛋白上樣至凝膠孔內(nèi)，采用 10% 十二烷基硫酸鈉-聚內(nèi)烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，并電轉(zhuǎn)至PVDF膜。TBST洗膜，置于 5% 脫脂奶粉中孵育1h，TBST洗膜，將轉(zhuǎn)印膜與稀釋后的一抗 （1：1000） 共同置于 4^°C 下孵育過夜。次日，TBST洗膜，再將膜與稀釋后的二抗（1：5000）共同置于室溫下孵育1h，再次洗膜，將適量ECL顯色液滴于膜上，曝光，凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶，ImageJ軟件分析各蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計算各個待測樣本內(nèi)目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.5心功能相關(guān)指標(biāo)檢測

慢病毒注射結(jié)束后，采用多普勒超聲測定大鼠心功能，包括左室射血分?jǐn)?shù)（leftventricularejectionfractions，LVEF）、左室短軸縮短率（leftventricularfractionalshortening，LVFS）、左室舒張末期內(nèi)徑（leftventricularenddiastolicdiameter，LVEDD）左室收縮末期內(nèi)徑（leftventricular end systolic diameter，LVESD），各指標(biāo)連續(xù)檢測3個心動周期，結(jié)果取平均值。

1.3.6 組織形態(tài)學(xué)染色

分離大鼠心肌組織， 4% 多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，制成 4μm 厚度的心肌組織切片。切片經(jīng)二甲苯浸泡脫蠟、各級乙醇脫水后，蒸餾水清洗，分別進(jìn)行HE染色和Masson染色。結(jié)束后，常規(guī)脫水、透明，中性樹脂封固，通過光學(xué)顯微鏡觀察心肌形態(tài)學(xué)變化和心肌纖維化情況，使用ImageJ軟件對藍(lán)色的膠原沉積區(qū)域進(jìn)行量化，計算膠原容積分?jǐn)?shù)（collagenvolumefraction，CVF），CVF 膠原藍(lán)染面積/組織總面積 ×100% 。

1.3.7 免疫熒光染色

取制備的大鼠心肌組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，0.01mol⊥ 檸檬酸鈉修復(fù)抗原， 3% 過氧化氫孵育10min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌， 0.1% TritonX-100透化 15min，5% 牛血清白封閉 60min 。在切片上滴加稀釋后的兔源 α -SMA多克隆抗體 （1：200） ，置于搖床上4^°C 孵育過夜。次日，去除一抗液，PBS洗滌，滴加AlexaFluor488標(biāo)記的二抗 （1：500 ，避光環(huán)境下室溫孵育 1h 。DAPI染核 10min ，PBS洗滌后，抗熒光淬滅封片液封固，在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光標(biāo)記的α -SMA表達(dá)，使用ImageJ軟件對熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPadPrism8.0.1軟件繪圖。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差 表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著差異法（LSD）-t檢驗(yàn)。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 CHF模型大鼠心肌組織DNMT1的表達(dá)變化

qRT-PCR和WesternBlot檢測結(jié)果顯示，與Sham組比較，CHF組大鼠心肌組織DNMT1mRNA和蛋白相對表達(dá)量均顯著上調(diào)（ Plt;0.05 ）。詳見圖1、圖2。

圖1兩組心肌組織DNMT1mRNA表達(dá)比較（與Sham組比較， ）

圖2兩組心肌組織DNMT1蛋白表達(dá)比較（A為DNMT1蛋白表達(dá)條帶圖；B為DNMT1蛋白表達(dá)柱狀圖。與Sham組比較， ）

2.2 DNMT1對CHF模型大鼠心功能的影響

與Sham組比較，CHF組大鼠LVEF和LVFS降低（ Plt;0.05 ，LVEDD和LVESD增加（ Plt;0.05 ）；與CHF組比較，Si-DNMT1組大鼠LVEF和LVFS升高（ Plt; 0.05），LVEDD和LVESD減小 ?～0.05 ）。詳見表1。

表1各組大鼠LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD比較（x士s）

注：CHF組與Sham組比較， ① Plt;0.05 ;si-DNMT1組與CHF組比較， ② Plt;0.05 。

2.3 DNMT1對CHF模型大鼠心肌組織病理學(xué)變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠心肌呈束狀分 布，心肌細(xì)胞排列有序，形態(tài)正常；CHF組大鼠心肌細(xì) 胞排列紊亂，出現(xiàn)壞死、變性，心肌間質(zhì)疏松；與CHF 組比較，si-DNMT1組大鼠心肌細(xì)胞排列較規(guī)則，si-NC 組心肌損傷現(xiàn)象未明顯改善。詳見圖3。

圖3各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化（HE染色， ×100 ）

2.4DNMT1對CHF模型大鼠心肌組織纖維化的影響Masson染色分析結(jié)果顯示，與Sham組比較，CHF組大鼠心肌組織內(nèi)藍(lán)染纖維組織較多，CVF增加（ Plt;0.05 ；與CHF組比較，si-DNMT1組大鼠心肌組織內(nèi)藍(lán)染纖維組織明顯較少，CVF減少（ rlt;0.05 。詳見圖4、圖5。

圖4各組大鼠心肌組織纖維化情況（Masson染色， ×100 ）

圖5各組大鼠心肌組織CVF比較（CHF組與Sham組比較， ?Plt;0.05 ；si-DNMT1組與CHF組比較，# Plt;0.05 ）

2.5 DNMT1對CHF模型大鼠心肌組織 α -SMA表達(dá)的影響

免疫熒光染色結(jié)果觀察顯示，Sham組大鼠心肌組織內(nèi)紅色熒光標(biāo)記 α -SMA表達(dá)較少，CHF組大鼠心肌組織內(nèi)紅色熒光標(biāo)記 α -SMA表達(dá)增多（ Plt;0.05） ：與CHF組比較，si-DNMT1組大鼠心肌組織內(nèi)紅色熒光標(biāo)記 α -SMA表達(dá)減少（ Plt;0.05 。詳見圖6、圖7。

圖6各組大鼠心肌組織 α -SMA表達(dá)變化（免疫熒光染色， ×100 ）

圖7各組大鼠心肌組織 α -SMA表達(dá)比較（CHF組與Sham組比較， ?Plt;0.05 ：si-DNMT1組與CHF組比較，# Plt;0.05 ）

2.6DNMT1對CHF模型大鼠心肌組織CollagenI、CollagenⅢ表達(dá)的影響

qRT-PCR和WesternBlot檢測結(jié)果顯示，與Sham組比較，CHF組心肌組織CollagenI、CollagenIIImRNA和蛋白相對表達(dá)量均上調(diào)（ ?lt;0.05 ）；與CHF組比較，si-DNMT1組心肌組織CollagenI、CollagenIImRNA和蛋白相對表達(dá)量均下調(diào)（ Plt;0.05 ）。詳見圖8～ 圖10。

圖8各組大鼠心肌組織CollagenI、CollagenIImRNA表達(dá)比較

（A為CollagenImRNA變化;B為Collagen IImRNA變化。CHF組與Sham組比較， ?Plt;0.05 ：Si-DNMT1組與CHF組比較，# Plt;0.05 ）

圖9各組大鼠心肌組織CollagenI蛋白表達(dá)比較（A為CollagenI蛋白表達(dá)條帶圖；B為CollagenI蛋白變化。CHF組與Sham組比較， si-DNMT1組與CHF組比較，# Plt;0.05 ）

圖10各組大鼠心肌組織CollagenⅢ蛋白表達(dá)比較（A為CollagenⅢ蛋白表達(dá)條帶圖；B為Collagen I蛋白變化。CHF組與Sham組比較， ；si-DNMT1組與CHF組比較，# Plt;0.05 ）

3討論

CHF已成為21世紀(jì)危害人類健康的主要疾病之一，其特點(diǎn)是發(fā)病率高、死亡率高[8。目前，臨床對CHF的治療策略取得了一定進(jìn)展，主要采用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑、β受體阻滯劑和鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑等藥物進(jìn)行治療，但在應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，這些藥物導(dǎo)致部分病人出現(xiàn)其他組織功能損害，且病人對藥物的耐受情況不同，治療效果不理想[9-10]。因此，有必要對CHF發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，以優(yōu)化該疾病的治療策略。本研究采用腹主動脈縮窄術(shù)復(fù)制CHF大鼠模型，檢測到大鼠LVEF和LVFS降低，LVEDD和LVESD增加；組織病理學(xué)染色結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)壞死、變性，心肌間質(zhì)疏松等病變現(xiàn)象，上述結(jié)果表明成功建立CHF模型。

心肌纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)積累沉積為特征的基本過程，其可導(dǎo)致各種心臟病的收縮功能障礙，認(rèn)為是CHF的重要因素[11]。心肌纖維化與CHF高度相關(guān)，且已成為CHF的治療靶點(diǎn)。 α -SMA是肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，可結(jié)合到肌動蛋白應(yīng)力纖維中并產(chǎn)生收縮力，在誘導(dǎo)組織纖維化時其表達(dá)增加[12]。組織纖維化的發(fā)生與膠原蛋白的沉積有關(guān)，是用于評估纖維化程度的關(guān)鍵指標(biāo)，CollagenI和CollagenⅢ是參與心肌纖維化的主要膠原蛋白[13]。本研究結(jié)果顯示，CHF大鼠心肌組織經(jīng)Masson染色后顯示為藍(lán)染纖維組織較多，CVF增加，心肌組織 α -SMA熒光染色強(qiáng)度增加，CollagenI、CollagenImRNA和蛋白相對表達(dá)量均上調(diào)，提示CHF大鼠心肌組織發(fā)生纖維化。

相關(guān)研究表明，DNA甲基化在多個器官系統(tǒng)的纖維化發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，異常的DNA甲基化有助于纖維化的發(fā)生和發(fā)展[14-16]。DNMT1作為DNA甲基化的關(guān)鍵基因，其編碼的蛋白具有多種調(diào)控功能，目前已揭示DNMT1在多種組織纖維化中的表達(dá)水平及其作用。Barcena-Varela等[17]在人和小鼠肝臟纖維化區(qū)域中檢測到DNMT1表達(dá)升高，并利用G9a/DNMT1的雙重抑制劑CM272處理后可抑制肝纖維化，減輕肝臟損傷，且這種治療方法幾乎無毒性反應(yīng)。Wei等[18]研究顯示，在特發(fā)性肺纖維化病人和博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化組織中DNMT1和DNMT3a表達(dá)異常升高，靶向抑制DNMT可發(fā)揮抗肺纖維化活性，對肺組織有保護(hù)作用。Xu等[19研究表明，心肌成纖維細(xì)胞DNMT1高表達(dá)下調(diào)了miR-152-3p表達(dá)水平，導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞的增殖，并活化成肌成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)心肌纖維化，提示抑制DNMT1可能減緩心肌纖維化的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，CHF大鼠心肌組織DNMT1mRNA和蛋白相對表達(dá)量均上調(diào)，由此推測，DNMT1異常表達(dá)可能與CHF大鼠的心肌纖維化有關(guān)；并通過DNMT1siRNA重組慢病毒靶向抑制其表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，CHF大鼠不僅表現(xiàn)出LVEF和LVFS增加，LVEDD和LVESD減小，心肌細(xì)胞損傷改善，心肌組織表現(xiàn)為藍(lán)染纖維組織較少、CVF減少、 α -SMA熒光染色強(qiáng)度減小、CollagenI和Collagen Ⅲ mRNA與蛋白相對表達(dá)量下調(diào)。上述結(jié)果均說明，靶向抑制DNMT1可改善CHF大鼠心功能，抑制心肌組織纖維化。

綜上所述，CHF模型大鼠心肌組織DNMT1呈高表達(dá)，靶向抑制其表達(dá)可改善CHF大鼠心功能，減輕心肌細(xì)胞損傷，降低 α -SMA、CollagenI和CollagenIⅢI表達(dá)水平，從而抑制心肌組織纖維化，可為CHF的靶向治療提供新思路和奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。今后將進(jìn)一步探討DNMT1對心肌纖維過程中信號通路的調(diào)控作用，為臨床合理應(yīng)用提供參考。

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（收稿日期：2024-01-19）