辣椒果實SGR基因的克隆與功能分析

摘" 要：滯綠基因（STAY-GREEN，SGR）基因是一個調(diào)控植物葉綠素降解的關(guān)鍵基因，在調(diào)控植物衰老方面發(fā)揮著重要作用，。為研究SGR基因在辣椒果實著色過程中的調(diào)控作用，采用同源基因克隆法，利用PCR技術(shù)從辣椒果實cDNA中擴增出CaSGR基因，對其蛋白序列進行生物信息學分析，并構(gòu)建病毒誘導基因沉默（VIGS）載體，初步驗證基因功能。結(jié)果表明：CaSGR基因的ORF為792"bp，編碼263個氨基酸；生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，茄科作物SGR基因相對保守，克隆的CaSGR蛋白與番茄、馬鈴薯的SGR蛋白進化關(guān)系較近；構(gòu)建CaSGR VIGS載體并注射辣椒葉片，成功獲得沉默植株，沉默植株葉片白化，果實顏色改變，CaSGR基因的表達量顯著降低，果實中葉綠素與β-胡蘿卜素含量明顯增高。本研究為深入解析CaSGR基因在辣椒果實著色中的分子調(diào)控機制提供基礎(chǔ)，并為培育高類胡蘿卜素含量的辣椒新品種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：辣椒；CaSGR基因；VIGS技術(shù)；葉綠素；β-胡蘿卜素中圖分類號：S641.3 """""文獻標志碼：A

Cloning and Functional Analysis of the SGR Gene in Capsicum annum Fruits

QIN Yuling， LIU Weixia， CAO Zhenmu， LIU Lin， ZHU Dan， YIN Xiaomin， LIU Ziji^*

Institute of Tropical Crops Genetic Resources， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： STAY-GREEN （SGR） is a key gene that regulates chlorophyll degradation in plants and plays an important role in controlling plant senescence. To investigate the regulatory role of the SGR gene in the fruit coloration process of pepper， the homologous gene cloning method was employed to amplify the CaSGR gene from pepper fruit cDNA using PCR technology in this study. Bioinformatics analysis was conducted on its protein sequence， and a virus-induced gene silencing （VIGS） vector was constructed to preliminarily verify the gene function. The results showed that ORF of CaSGR was 792 bp， encoding 263 amino acids. Bioinformatics analysis revealed that SGR was relatively conserved among Solanaceae crops， and SGR had a closer evolutionary relationship with SGR from tomato and potato. CaSGR VIGS vector was constructed and injected into pepper leaves， successfully obtaining silenced plants. The silenced plants exhibited leaf whitening， fruit color changed， and CaSGR expression levels reduced significantly. Additionally， the chlorophyll and β-carotene content in the fruits of the silenced plants increased markedly. This study would provide a foundation for further elucidating the molecular regulatory mechanisms of CaSGR in pepper fruit coloration and offer theoretical support for breeding new pepper varieties with high carotenoid content.

Keywords： Capsicum annum; CaSGR gene; VIGS technology; chlorophyll; β-carotene

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.004

辣椒（Capsicum spp.）是全球重要的蔬菜和調(diào)味品，近幾年我國辣椒種植面積均穩(wěn)定在210萬hm²左右，產(chǎn)業(yè)規(guī)模居蔬菜首位^[1-3]。辣椒果色是最直觀的外在品質(zhì)性狀和經(jīng)濟性狀，辣椒果實因含有類胡蘿卜素種類不同而呈現(xiàn)不同的顏色，同時辣椒果實著色過程伴隨葉綠素的降解和類胡蘿卜素的合成^[4]。

滯綠基因（Stay-green， （SGR）可延遲植物衰老過程中的葉綠素降解，而導致葉片保持綠色，對植物生物量、品質(zhì)和保鮮有重要影響。SGR基因在高等植物中是以基因家族形式存在，一般有2個或3個同源基因，都參與植物葉綠素降解調(diào)控^[5-6]，目前SGR基因在擬南芥^[7]、番茄^[8]、辣椒^[9]等作物中研究較多。SATO等^[10]在擬南芥中過表達AtSGR1會加速葉片葉綠素的的降解，而呈現(xiàn)葉片黃化；SAKURABA等^[11]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的STAY-GREEN2（SGR2）基因是一個負調(diào)控因子，它在葉片衰老過程中抑制葉綠素降解，可見其與在擬南芥的中同源基因發(fā)揮的功能完全不同；劉宇華^[6]在研究辣椒果實著色中發(fā)現(xiàn)，CaSGR2和CaSGR- LIKE在果實發(fā)育的整個過程中不表達或低表達，葉綠素降解主要是由CaSGR1調(diào)控的；番茄果實中RNA沉默SISGR1或CRISPR/Cas9編輯SISGR1，會使成熟番茄果實呈現(xiàn)棕色，番茄紅素和β-胡蘿卜素含量增加，研究發(fā)現(xiàn)是SISGR1與SIPSY1相互作用，從而調(diào)控番茄果實番茄紅素的積累^[12-14]。

對于尚未建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系的植物來說，利用病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）方法驗證基因功能，是較高效、便捷的手段^[15]。ZHOU等^[16]建立了高效的辣椒VIGS體系，在多個品種實現(xiàn)高達100%的沉默效率；ZHANG等^[17]通過構(gòu)建與辣椒花青素合成相關(guān)的TRV2-MYB載體，發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子抑制辣椒花青素的合成；利用VIGS沉默辣椒素合成的基因（Comt、pAmt、Kas），辣椒果實中辣椒素含量明顯降低^[18]；申龍斌等^[19]研究發(fā)現(xiàn)，在海南黃燈籠辣椒沉默凱氏帶膜蛋白CASP，沉默植株中基因的表達量顯著下降，可見VIGS技術(shù)在辣椒基因功能研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本課題組前期在辣椒果實不同著色時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)SGR基因差異表達顯著，本研究從辣椒果實中克隆CaSGR基因，利用生物信息學軟件分析CaSGR基因亞細胞定位及進化關(guān)系等，構(gòu)建VIGS載體，分析沉默植株的基因表達以及葉綠素、β-胡蘿卜素的含量，以期為研究CaSGR在辣椒果實著色中的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)。

1 "材料與方法

1.1" 材料

提取RNA的實驗材料來自于自主選育的辣椒高代自交系17SCa2m，種植于海南省儋州試驗場五隊（19°33.66′N，109°31.63′E），采取成熟辣椒果實，去除胎座和種子，立即放入液氮中，?80"℃冰箱保存。

1.2" 方法

1.2.1" 辣椒果實RNA提取及cDNA合成 "根據(jù)天根多糖多酚RNA提取試劑盒（DP441）說明書提取辣椒果實RNA，使用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AE311）反轉(zhuǎn)錄cDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，使用NanoDrop檢測RNA濃度。

1.2.2" 辣椒果實CaSGR基因克隆" 利用Primer 5.0軟件設(shè)計CaSGR-F和CaSGR-R的引物（表1），以上述得到的cDNA為模板，PCR擴增目的片段。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 5 μL、2 mmol/L dNTPs 5 μL、25 mmol/L MgSO₄ 3 μL、引物1.5 μL、TOYOBO KOD-Plus-Neo酶1 μL、cDNA 2 μL、ddH₂O 32.5"μL。PCR擴增程序為：94"℃ 2 min；98"℃ 10 s，58"℃ 30 s，72"℃ 30 s，循環(huán)30次；72"℃ 10 min；4"℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將膠回收PCR產(chǎn)物、連接pEASY-T1 Cloning Kit載體和轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，菌落PCR篩選陽性克隆送至生工生物工程（（上海））股份有限公司進行測序。

1.2.3" SGR基因生物信息學分析" 通過NCBI數(shù)據(jù)庫的ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/）工具找出基因的開放閱讀框ORF和翻譯出的蛋白序列；在NCBI數(shù)據(jù)庫Blastp并下載擬南芥和茄科作物的SGR蛋白序列，使用MEGA 7 軟件采用neighbour joining（NJ）系統(tǒng)發(fā)育方法分析進化關(guān)系^[20]，并用ITOL（https：//itol.embl.de/）在線軟件美化；使用ProtParam（https：//web.expasy. org/protparam/）和Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）^[21]在線軟件預(yù)測分子量、等電點和亞細胞定位；使用DNAMAN軟件對SGR蛋白序列進行多重比對分析。

1.2.4" VIGS載體的構(gòu)建 "利用SGN VIGS（https：// vigs.solgenomics.net/）在線軟件設(shè)計CaSGR VIGS片段，根據(jù)片段設(shè)計引物（表1），用以上述1.2.2中的陽性質(zhì)粒為模板PCR擴增VIGS片段，經(jīng)測序驗證后，與酶切后的TRV2連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，。經(jīng)雙酶切驗證后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到GV3101感受態(tài)細胞，PCR檢測成功的菌液用于VIGS注射實驗。

1.2.5" 注射辣椒幼苗" 待辣椒幼苗生長至3～4片真葉期，分別挑取TRV2-CaPDS、TRV2-CaSGR、TRV2和TRV1已轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101的單克隆，在含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中28"℃震蕩培養(yǎng)24"h，4000 r/min離心20 min，收集菌體。用添加乙酰丁香酮的MES緩沖液重懸浮2次，調(diào)整TRV1的OD₆₀₀為0.4，TRV2-CaPDS、TRV2-CaSGR和TRV2的OD₆₀₀為0.2，將TRV2-CaPDS、TRV2-CaSGR和TRV2和分別與TRV1等量混合，28"℃黑暗放置3～4 h。用2 mL的注射器將菌液注入到辣椒子葉和真葉中，于16"℃，16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)3"d。移到23"℃ 16"h光照，、20"℃ 8"h黑暗的環(huán)境下培養(yǎng)，直至出現(xiàn)白化表型和目標表型。

1.2.6 "CaSGR基因表達分析" 注射120 d后，采取紅熟期的辣椒，去除果柄、胎座和種子，利用試劑盒提取辣椒果實RNA，通過Primer 5.0軟件設(shè)計CaSGR基因的qRT-PCR特異性引物（表1）。qRT-PCR反應(yīng)體系（20"μL）為：SYBR 10"μL，cDNA模板1 μL，正反向引物各0.8 μL，ddH₂O 7.4 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95"℃ 1"min；95"℃ 10"s，55"℃ 30"s，72"℃ 15"s，40個循環(huán)。每個樣品3次重復，以actin作為內(nèi)參基因，采用2^–??Ct的方法分析目標基因的表達情況，利用Excel軟件作圖，利用SPSS軟件作顯著性分析。

1.2.7" 葉綠素與β-胡蘿卜素的測定" 以未注射辣椒為對照（CK），對照植株和沉默植株在23"℃ 16"h光照，、20"℃ 8"h黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約120"d左右，采取辣椒果實，取樣方法同1.2.6，采用分光光度法測定葉綠素的含量^[22]；β-胡蘿卜素的含量測定參照QIN等^[23]的方法。

2 "結(jié)果與分析

2.1 "辣椒CaSGR基因的克隆

利用特異引物CaSGR-F/R和高保真酶，以辣椒果實的cDNA為模板進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，得到1條約800 bp的條帶（圖1）。測序后經(jīng)過NCBI的ORF finder工具分析發(fā)現(xiàn)，該基因的ORF為792 bp，編碼263個氨基酸。將該基因在NCBI數(shù)據(jù)庫Blast，發(fā)現(xiàn)與辣椒（EU196733.1、AM746208.2、NM_001324918.1）的SGR基因一致，將其命名為CaSGR。

2.2 "茄科作物SGR基因家族成員的性質(zhì)分析

利用克隆的基因核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索分析，獲得茄科作物中的27個SGR基因，其中辣椒SGR基因3個，番茄SGR基因4個，馬鈴薯SGR基因8個，煙草SGR基因12個，另外在數(shù)據(jù)庫中搜索到擬南芥SGR基因2個。辣椒CaSGR同源基因的序列長度差異明顯，最短的為801"bp，最長的為1281"bp。茄科作物之間的SGR蛋白質(zhì)序列長度和分子量差異不明顯，說明不同種屬間SGR基因相對保守。理論等電點均大于7，表明SGR均是堿性蛋白。亞細胞定位預(yù)測顯示，有5個SGR蛋白定位在葉綠體，12個同時定位在葉綠體、細胞核，4個同時定位在細胞膜、細胞核，7個定位在細胞核（表2）。

2.3" SGR蛋白序列的多序列比對和進化關(guān)系分析

利用DANMAN軟件將克隆的CaSGR基因編碼的蛋白序列與辣椒、番茄的SGR蛋白序列進行多序列比對，結(jié)果結(jié)果表明顯示，蛋白序列相似度為88.94%，與數(shù)據(jù)庫中辣椒SGR蛋白的序列相比，CaSGR在155～157處有3個氨基酸（VLK）缺失（圖2）。

利用MEGA 7軟件將CaSGR蛋白序列與擬南芥、茄科作物的SGR蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，CaSGR蛋白與番茄、馬鈴薯的SGR蛋白進化關(guān)系較近，與煙草和擬南芥的SGR蛋白進化關(guān)系較遠（圖3）。

2.4" CaSGR VIGS載體的構(gòu)建

使用帶有酶切位點的特異性引物擴增CaSGR基因的病毒誘導基因沉默（VIGS）靶片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小一致（圖4）?；厥瞻衅危瑫r雙酶切回收產(chǎn)物和TRV2載體，并將酶切后的片段與TRV2載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定（圖5），并送公司測序，經(jīng)比對和靶片段一致，表明成功構(gòu)建CaSGR VIGS載體。

2.5" VIGS沉默植株獲得及基因表達分析

采用葉片注射法將TRV2-CaSGR與TRV1等比例混合，注射到辣椒葉片中，22"d左右葉片出現(xiàn)較為明顯的白化現(xiàn)象。注射120"d后觀察植株表型，注射TRV2-CaPDS的植株白化依然明顯，大部分葉片呈白化特征，辣椒果實也有變化，比對照和注射TRV2-CaSGR的顏色略淺（圖6）。

為檢測基因的沉默效率，取沉默植株的辣椒果實，利用qRT-PCR分析CaSGR基因的表達量。結(jié)果顯示（圖7），3組實驗組辣椒果實中CaSGR基因的表達量顯著低于對照組，說明成功沉默該基因。

2.6 "葉綠素與β-胡蘿卜素的測定

測定對照和3個沉默辣椒植株的果實葉綠素與β-胡蘿卜素含量，結(jié)果顯示（表3），3個沉默辣椒植株的果實葉綠素與β-胡蘿卜素含量顯著高于對照相，葉綠素含量分別是對照的2.35、4.92、2.07倍，β-胡蘿卜素含量分別是對照的2.60、3.21、3.22倍。

3" 討論

本研究通過克隆辣椒CaSGR基因，構(gòu)建VIGS載體，并測定沉默株系中與辣椒果實著色相關(guān)的葉綠素和β-胡蘿卜素含量，為深入研究該基因在辣椒果實著色過程中的作用提供有力支撐。

本研究成功獲得了長度為792"bp、編碼263個氨基酸的基因片段，與數(shù)據(jù)庫中辣椒SGR蛋白序列相比，CaSGR在第155～157位置存在3個氨基酸缺失，這一差異并未對辣椒果實的葉綠素降解產(chǎn)生影響。但在他人研究中指出編碼區(qū)單堿基的突變可引起SGR基因功能的缺失^[6]，如LIU等^[9]在辣椒滯綠突變體中發(fā)現(xiàn)CaSGR1編碼區(qū)第342位核苷酸由G突變成A，導致第114位氨基酸轉(zhuǎn)化成終止密碼子，翻譯提前終止；EFRATI等^[24]研究葉綠素滯綠基因cl時發(fā)現(xiàn)，第340位核苷酸處堿基T突變成C，氨基酸由Trp變?yōu)锳rg；在番茄^[8]、豌豆^[25]等滯綠突變體中也均發(fā)現(xiàn)有堿基突變，從而導致氨基酸的改變。

CaSGR VIGS載體的成功構(gòu)建為研究該基因的功能提供了關(guān)鍵技術(shù)手段，。本研究通過葉片注射法實現(xiàn)了CaSGR基因的沉默，沉默植株葉片出現(xiàn)明顯白化現(xiàn)象，果實顏色也發(fā)生變化，同時基因表達量顯著降低，證明了CaSGR基因在辣椒果實著色過程中發(fā)揮著重要作用。而沉默植株果實中葉綠素與β-胡蘿卜素含量的顯著增加，這與前人在研究SGR基因沉默后陽性植株的表型不太一致。如楊亮等^[14]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯番茄SlSGR1基因，陽性植株的番茄果實葉綠素、β-胡蘿卜素和番茄紅素含量顯著提高；HU等^[12]干擾沉默番茄的SlSGR1，沉默植株葉片和果實的葉綠素降解變低；ZHOU等^[26]通過RNA干擾MsSGR獲得沉默紫花苜蓿株系，沉默株系中苜蓿仍呈現(xiàn)綠色。但與SAKURABA等^[11]研究擬南芥中的STAY- GREEN2（SGR2）基因功能是一致，該研究發(fā)現(xiàn)是一個負調(diào)控因子，在葉片衰老過程中抑制葉綠素降解，本研究中的CaSGR基因可能與擬南芥SGR2基因是同一類型，也有可能是3個氨基酸的缺失導致的沉默植株中葉綠素降解延緩。

本研究明確了CaSGR基因與辣椒果實葉綠素和β-胡蘿卜素含量的關(guān)聯(lián)，但具體的分子調(diào)控機制尚不清楚，有待進一步探索。未來可利用酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)篩選與CaSGR蛋白相互作用的蛋白，構(gòu)建其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時，還可以為分析該基因的啟動子序列是否與葉綠素降解和類胡蘿卜素合成過程中結(jié)構(gòu)基因有相互作用奠定基礎(chǔ)。摸清CaSGR在辣椒果實著色過程中的調(diào)控作用，將有助于培育高類胡蘿卜素含量的辣椒新品種，提升辣椒的營養(yǎng)價值和商品價值。

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