基于轉(zhuǎn)錄組分析小白菜對強(qiáng)光條件的響應(yīng)

摘" 要：小白菜是原產(chǎn)我國的重要蔬菜作物，也是海南人民喜愛的葉菜之一。海南夏季的高溫和強(qiáng)光在很大程度上影響了小白菜的正常生長發(fā)育，降低了其產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，對小白菜在非生物脅迫下生長的研究多集中在耐熱性方面，關(guān)于小白菜對強(qiáng)光脅迫的應(yīng)答研究較少。為探究小白菜響應(yīng)強(qiáng)光的分子調(diào)控機(jī)制，本研究以不結(jié)球小白菜品種矮腳黃作為研究對象，比較分析在正常光照[300 μmol/（m²·s）]和強(qiáng)光[1500 μmol/（m²·s）]下小白菜葉片生理指標(biāo)、光合特性及響應(yīng)基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：（1）強(qiáng)光下小白菜干重顯著增加，根冠比在0～10"d逐漸增加，第15天與第10天相比顯著下降；（2）強(qiáng)光下小白菜的葉綠素含量在后期顯著下降，凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度在第5天顯著升高，之后逐漸降低，胞間CO₂濃度基本不變；（3）利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共得到2324個(gè)差異表達(dá)基因，通過GO、KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)14個(gè)與光合作用及光保護(hù)機(jī)制相關(guān)的DEGs，6個(gè)抗氧化酶活性相關(guān)的DEGs，從中篩選出8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，證明轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果具有可靠性；（4）強(qiáng)光會(huì)對小白菜抗氧化酶活性造成一定程度的影響，在0～5 d時(shí)誘導(dǎo)SOD、POD、CAT活性上升，5～15 d時(shí)SOD、POD活性逐漸下降，CAT活性呈上升趨勢。綜上所述，在強(qiáng)光條件下，小白菜通過迅速響應(yīng)光合作用相關(guān)的基因如HY5、ELIP2、CLH2等，并調(diào)控植物抗氧化酶活性相關(guān)基因如PER71、SODCP、CAT2等，緩解強(qiáng)光對其生長的抑制，增強(qiáng)抗氧化酶活性，進(jìn)而提高幼苗對強(qiáng)光的適應(yīng)能力。

關(guān)鍵詞：小白菜；強(qiáng)光處理；生理響應(yīng)；轉(zhuǎn)錄組分析；基因挖掘中圖分類號：S634.3 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Transcriptome-based Analysis of Bok Choy （Brassica campestris ssp. chinensis） Response to High Light Conditions

ZHAO Ying， ZHANG Chang， WANG Xu^*

School of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： Bok choy （Brassica campestris ssp. chinensis） is an important vegetable crop native to China and is also one of the leafy vegetables favored by people in Hainan. The high temperature and intense sunlight in Hainan’s summer greatly affect the normal growth and development of bok choy， reducing its yield and quality. At present， research on the growth of bok choy under abiotic stress is mostly focused on heat tolerance， while study on the response of bok choy to strong light stress is relatively scarce. To investigate the molecular regulatory mechanisms of bok choy in response to strong light， this study used the variety ‘Aijiao Huang’ as the research object. We compared and analyzed the physiological indicators， photosynthetic characteristics， and expression levels of response genes in the leaves of bok choy under normal light [300 μmol/（m²·s）] and strong light [1500 μmol/（m²·s）]. Under strong light， dry weight of bok choy significantly increased， and the R/S ratio gradually increased from day 0 to day 10， followed by a significant decrease on day 15. The chlorophyll content significantly decreased in the later stages. Pn， Tr， and Gs significantly increased on day 5 under strong light， and then gradually decreased， while Ci remained relatively stable. Using RNA-seq technology for transcriptome sequencing， a total of 2324 differentially expressed genes （DEGs） were identified. GO and KEGG enrichment analyses revealed 14 DEGs related to photosynthesis and photoprotection mechanisms， and 6 DEGs associated with antioxidant enzyme activity. 8 DEGs were selected for qRT-PCR validation， which were consistent with the transcriptome sequencing results， confirming the reliability of the transcriptome analysis. Strong light had a certain impact on the antioxidant enzyme activity of bok choy. During days 0?5， the activity of SOD， POD， and CAT was induced to increase， while from days 5?15， the activity of SOD and POD gradually decreased， and CAT showed an upward trend. In summary， bok choy may rapidly respond to photosynthesis-related mechanisms and regulate antioxidant enzyme activity under strong light conditions， thereby alleviating the inhibitory effects of strong light on growth and enhancing the seedlings adaptability to strong light.

Keywords： bok choy; strong light; physiological response; transcriptome analysis; gene mining

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.007

光照是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子之一，對植物生長發(fā)育起關(guān)鍵調(diào)控作用^[1]，但光照強(qiáng)度過高會(huì)引發(fā)光氧化脅迫，誘導(dǎo)光合電子傳遞鏈過度還原，造成葉綠體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）爆發(fā)性累積，影響植物正常的生長發(fā)育進(jìn)程，最終導(dǎo)致產(chǎn)量或品質(zhì)降低^[2]，如強(qiáng)光下栽培大豆植株變矮，提前衰老^[3]；芍藥^[4]和葡萄^[5]等植物的根莖葉中有機(jī)物累積能力變差、葉片生物量減少。葉綠體（chloroplast）是綠色植物光合作用的基本功能單位，也是植物激素與活性氧生物合成的重要場所，參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、抗逆應(yīng)答、寄主－病原互作等^[6-7]。研究證明GLKs基因是調(diào)控植物葉綠體發(fā)育及其機(jī)能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子^[8]，過表達(dá)GLKs基因可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的葉片等光合組織更綠，甚至還能使非光合組織（如根）形成具有功能的葉綠體^[9]。此外，強(qiáng)光還會(huì)導(dǎo)致光系統(tǒng)元件的損傷，其中對PSII的損傷往往更為顯著，葉綠素和類胡蘿卜素吸收的過量光能會(huì)破壞PSⅡ反應(yīng)中心的完整性。捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白是分布在PSI和PSⅡ上的類囊體膜蛋白，其分為Lhca（light-h-a--r--v-e-sting chlorophyll a/b binding proteins of ph-oto-s-ystem I）和Lhcb（light-harvesting chlor-ophyll a/b binding proteins of photosystemⅡ）兩個(gè)蛋白亞族，分別由Lhca和Lhcb兩個(gè)多基因家族編碼，通過與葉綠素、類胡蘿卜素和葉黃素等色素分子結(jié)合，在光能吸收、能量分布，以及維持類囊體結(jié)構(gòu)等方面發(fā)揮作用^[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，敲除或下調(diào)Lhcb基因，都會(huì)影響植株光合速率和葉綠素含量，從而出現(xiàn)淺綠色或泛白的葉色表型以及生長延遲的現(xiàn)象^[11-13]。由此可見，強(qiáng)光不僅會(huì)對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生顯著影響，還會(huì)在分子層面引發(fā)一系列復(fù)雜的生理和生化變化。這些變化包括葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的損傷、光合電子傳遞鏈的紊亂、活性氧的過度積累以及相關(guān)基因表達(dá)的改變。這些分子機(jī)制的研究為理解植物在強(qiáng)光脅迫下的適應(yīng)性反應(yīng)提供了重要的理論基礎(chǔ)，并為培育耐強(qiáng)光脅迫的作物品種提供了潛在的靶點(diǎn)。

海南省位于中國的最南端，屬于海洋性熱帶季風(fēng)氣候，年平均溫度在22～26"℃之間；每年夏秋季節(jié)，高溫強(qiáng)光照會(huì)導(dǎo)致海南島葉菜類蔬菜生產(chǎn)困難，必須從島外調(diào)運(yùn)。小白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）是十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種，又稱不結(jié)球白菜、青菜、油菜等，性喜冷涼，是原產(chǎn)我國的重要蔬菜作物。小白菜是海南人民喜愛的葉菜之一，海南夏季的高溫和強(qiáng)光在很大程度上影響了小白菜的正常生長發(fā)育，降低了其產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前，對小白菜在非生物脅迫下生長的研究多集中在耐熱性方面，關(guān)于小白菜對強(qiáng)光脅迫的應(yīng)答研究較少。本研究以海南地區(qū)種植較廣泛的小白菜品種矮腳黃為研究對象，利用LED作光源，測定小白菜生物量、葉片光合指標(biāo)和抗氧化酶活性，用RNA-seq進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選差異表達(dá)基因并進(jìn)行功能注釋分析，在轉(zhuǎn)錄組水平上分析強(qiáng)光下小白菜相關(guān)響應(yīng)基因進(jìn)行初步探究，以期探究小白菜適應(yīng)強(qiáng)光的分子機(jī)制，為小白菜夏季栽培和育種提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1 "材料

供試小白菜品種為矮腳黃（購自南京市蔬菜種子公司）。選取飽滿且均勻一致的種子直接播于聚氨酯泡沫小方塊（2 cm×2 cm×2 cm）中，置于塑料育苗盤中，25"℃黑暗條件下進(jìn)行催芽，2"d后種子露白及時(shí)見光，光照強(qiáng)度為300"μmol/（m²·s），光周期為12 h光照/12 h黑暗，溫度為25"℃/18"℃，濕度為（70±5）%。兩葉一心時(shí)，將小苗分組移至栽培架進(jìn)行不同光強(qiáng)下的水培種植：正常光處理的光照強(qiáng)度為300"μmol/（m²·s）（CK），強(qiáng)光處理的光照強(qiáng)度為1500 μmol/（m²·s）（HL），其他條件保持一致。

1.2" 方法

1.2.1" 植株生物量的測定" 每隔5"d各取5株幼苗，洗凈晾干后將地上部和地下部放于信封袋，置于烘箱，105"℃殺青30 min，75"℃烘干至恒重后分別測定地上部和地下部干重。根冠比=地下部分干重/地上部分干重。

1.2.2" 葉綠素含量的測定" 用SPAD-502型葉綠素儀測定小白菜葉片葉綠素相對含量（SPAD）。選取植株從上向下數(shù)第3～4片成熟度與測量方位一致、健康完整葉片的3個(gè)不同部位進(jìn)行葉綠素指標(biāo)測定。每個(gè)品種設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.3" 光合參數(shù)測定" 采用美國Li-Cor公司的Li-6400便攜式光合儀，在晴天上午9：00—11：30測定植株從上向下數(shù)第3～4片完全展開葉的凈光合速率（P_n）、氣孔導(dǎo)度（G_s）、細(xì)胞間隙CO₂濃度（C_i）和蒸騰速率（T_r）。測定時(shí)葉室內(nèi)溫度為（25±1）℃，光量子通量密度與處理光強(qiáng)保持一致。

1.2.4" 抗氧化酶活性測定" 取光照處理0、5、10、15 d后的幼苗葉片用于抗氧化酶活性的測定。將葉片剪碎裝入離心管，經(jīng)液氮速凍后于?80"℃冰箱保存。過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法^[14]測定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法^[15]測定，過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度法^[16]測定。

1.2.5" 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建和測序" 選取光照5 d后生長一致的小白菜各3株，取同一葉位的葉片洗凈，迅速吸干水分并投入液氮速凍，委托廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組測序。利用RNA提取試劑盒提取小白菜葉片總RNA，樣品總RNA用瓊脂糖凝膠電泳分析完整性及是否存在DNA污染；采用NanoDrop微量分光光度計(jì)測量核酸濃度，再使用Agilent 2100檢測RNA完整性；RNA質(zhì)檢合格構(gòu)建cDNA文庫，庫檢合格后，利用Illumina Novaseq X Plus進(jìn)行高通量測序。

1.2.6" 差異表達(dá)基因的篩選" 采用fastp軟件對fastq格式的raw reads進(jìn)行處理^[17]，去除低質(zhì)量reads后獲得clean reads，使用HISAT2軟件將雙端測序得到的序列比對到參考基因組^[18]，根據(jù)HISAT2的比對結(jié)果，利用Stringtie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本^[19]，并用RSEM計(jì)算每個(gè)樣本中所有基因的表達(dá)量。基因差異表達(dá)分析的輸入數(shù)據(jù)為基因表達(dá)水平分析中得到的read counts數(shù)據(jù)，使用edgeR軟件分析，對read counts進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（normalization）；根據(jù)模型進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)概率（p value）的計(jì)算；最后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，得到FDR值（錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率）?；诓町惙治鼋Y(jié)果，篩選FDRlt;0.05且|log₂（FC）|gt;1的基因?yàn)轱@著差異基因（DEG）。

1.2.7" 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證 "選取8個(gè)關(guān)鍵差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT- PCR）驗(yàn)證，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)定量引物，引物序列見表1，使用翌圣生物科技（上海）股份有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒對測序公司返樣RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR程序?yàn)椋?5"℃預(yù)變性5"min；95"℃變性10 s，55"℃退火15 s，60"℃延伸30"s，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)?em>GAPDH，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，使用2^?ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件分析小白菜生理指標(biāo)數(shù)據(jù)，采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan法對各處理差異顯著性進(jìn)行分析，用不同小寫字母表示差異顯著水平（Plt;0.05），并用Graphpad Prism 8軟件作圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 強(qiáng)光對小白菜生物量的影響

由表2可以看出，正常光[300 μmol/（m²·s）]和強(qiáng)光[1500 μmol/（m²·s）]處理下，小白菜干重在第5天和第10天均顯著增加；處理15 d時(shí)，正常光照下小白菜干重比0、5 d顯著增加，與10 d相比差異不顯著而強(qiáng)光處理的干重則顯著增加，且與正常光相比差異顯著，說明強(qiáng)光下小白菜生物量增長速度更快。

植物的根冠比能夠反映植物地下部分與地上部分的生物量累積情況，正常光下小白菜的根冠比呈現(xiàn)先增加后逐漸降低的趨勢，第5天時(shí)最大，在第10天時(shí)顯著下降；強(qiáng)光處理下小白菜的根冠比在0～10"d逐漸增加，第15天顯著下降。與對照相比，強(qiáng)光處理下第5天的根冠比顯著低于正常光，在第10天時(shí)顯著高于正常光，這一結(jié)果表明，在0～5"d時(shí)強(qiáng)光處理下植株的生物量積累更多集中在地上部分，而5～10 d，則更多集中在地下部分。這是因?yàn)橹参锸軓?qiáng)光影響前期可能將更多的資源分配到地上部分以提高光合作用能力，造成根冠比的下降；一段時(shí)間后植物需要增強(qiáng)水分吸收以應(yīng)對蒸騰加劇，根系的生長可能會(huì)被刺激，從而導(dǎo)致根冠比上升。

2.2 "強(qiáng)光對小白菜光合指標(biāo)的影響

葉綠素含量的高低可作為植物耐強(qiáng)光能力的重要指標(biāo)。由表3可知，正常光下小白菜SPAD值基本穩(wěn)定；在強(qiáng)光處理下，小白菜SPAD值呈顯著下降趨勢，第10天下降達(dá)顯著水平。正常光照下，小白菜在不同時(shí)間下的P_n、G_s和T_r變化不大；而強(qiáng)光下，小白菜的P_n、G_s和T_r均在第5天時(shí)顯著升高，呈現(xiàn)先升高后逐漸降低的趨勢，說明處理5"d小白菜會(huì)受到一定程度的強(qiáng)光抑制。與對照相比，強(qiáng)光處理后小白菜葉片的C_i變化差異不顯著，而P_n和G_s的變化規(guī)律基本一致，說明強(qiáng)光下小白菜葉片的P_n變化主要受氣孔影響，與葉肉細(xì)胞的光合能力無關(guān)。

2.3" 小白菜轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量分析

取正常光和強(qiáng)光處理組樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，將原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到干凈序列（clean reads）。如表4所示，整體測序數(shù)據(jù)質(zhì)量各樣本clean reads所占比例在99.5%以上，堿基質(zhì)量超過Q30的比例均在93%以上，GC含量均在47.5%左右?結(jié)果表明測序質(zhì)量合格，可用于后續(xù)分析?

2.4 "差異表達(dá)基因鑒定及富集分析

依據(jù)FPKM法進(jìn)行樣品間差異分析，由圖1可知，結(jié)果共得到了2324個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），與正常光照處理相比，強(qiáng)光處理組表達(dá)下調(diào)的DEGs有1376個(gè)，表達(dá)上調(diào)的DEGs有948個(gè)，下調(diào)的基因數(shù)明顯高于上調(diào)的基因數(shù)。

2.5" GO功能富集分析

通過GO功能富集分析，將差異表達(dá)基因分為生物學(xué)過程（biological process）、細(xì)胞組成（cellular component）、分子功能（molecular function）三大類。如圖2所示，生物學(xué)過程方面，強(qiáng)光下小白菜DEGs主要富集在防御反應(yīng)、細(xì)胞對光刺激、光強(qiáng)度的響應(yīng)，以及活性氧、茉莉酸、葉綠素代謝過程，其中防御反應(yīng)富集到的基因數(shù)量最多，其次是活性氧代謝（包括過氧化氫相關(guān)代謝途徑），說明小白菜在強(qiáng)光條件下可能啟動(dòng)了防御機(jī)制以應(yīng)對潛在的光損傷，在強(qiáng)光條件下會(huì)觸發(fā)多種光保護(hù)機(jī)制；細(xì)胞組成方面，DEGs富集在細(xì)胞壁、葉綠體、光合膜和光氧化物酶體上，細(xì)胞壁和葉綠體富集到的差異基因數(shù)量較多，說明植物通過調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵細(xì)胞器的功能和結(jié)構(gòu)，來增強(qiáng)光保護(hù)機(jī)制、優(yōu)化光合作用效率以及提高抗氧化能力，從而適應(yīng)并減輕強(qiáng)光可能引起的損傷；分子功能方面，在DNA結(jié)合、抗氧化活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等方面的差異表達(dá)基因數(shù)量較多，其中差異基因富集最多的是DNA結(jié)合，說明在響應(yīng)環(huán)境壓力時(shí)，DNA結(jié)合功能的富集可能與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)，這些基因在小白菜的強(qiáng)光脅迫響應(yīng)中可能具有重要的調(diào)控作用，涉及基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控和多種生理過程的適應(yīng)性變化。

2.6" KEGG代謝途徑富集分析

對差異基因進(jìn)行KEGG代謝途徑富集分析，如圖3所示，其主要參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號通路－植物、光合作用－天線蛋白、淀粉和蔗糖代謝等與植物響應(yīng)強(qiáng)光和光保護(hù)相關(guān)的通路上，其次是二萜類、類黃酮等與植物響應(yīng)非生物脅迫均密切相關(guān)的次生代謝物的合成途徑。其中富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上的基因數(shù)量最多，富集基因數(shù)量占第二位的是MAPK信號通路－植物。植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)植物對強(qiáng)光脅迫的反應(yīng)中起著核心作用。強(qiáng)光條件下，植物體內(nèi)的激素水平會(huì)發(fā)生顯著變化，這些激素通過調(diào)節(jié)光合器官的生長、葉片的形態(tài)變化以及光合效率，幫助植物適應(yīng)強(qiáng)光環(huán)境，減輕強(qiáng)光對植物造成的光損傷。與此同時(shí)，MAPK信號通路能夠快速響應(yīng)外部刺激，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)防御機(jī)制。在強(qiáng)光條件下，MAPK信號通路可以調(diào)節(jié)與抗氧化反應(yīng)、光合作用和細(xì)胞生長相關(guān)的基因，通過調(diào)控活性氧的水平和抗氧化酶的表達(dá)，增強(qiáng)植物的適應(yīng)能力，幫助植物抵御強(qiáng)光引起的氧化損傷。

2.7 "與光合作用和抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)分析

綠色植物葉綠體由光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）構(gòu)成，強(qiáng)光會(huì)導(dǎo)致植物光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）能量分配比例失衡，觸發(fā)植物多種光保護(hù)機(jī)制^[20]。由圖4可以看出，小白菜在強(qiáng)光下，光合作用－天線蛋白途徑中葉綠體活動(dòng)相關(guān)基因捕光復(fù)合物葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因LHCB1.3、LHCB4.2、光系統(tǒng)II P680反應(yīng)中心D1蛋白基因psbA、外亞基PSBO2、葡萄糖激酶基因GLK1的表達(dá)量均下調(diào)，由此推測，強(qiáng)光可能造成小白菜中部分捕光復(fù)合物數(shù)量減少，致使葉綠體的捕光能力下降。與此同時(shí)，參與葉綠素降解的NYC1、CLH2以及光保護(hù)系統(tǒng)相關(guān)基因ELIP2的表達(dá)量上調(diào)，推測強(qiáng)光會(huì)對植物體內(nèi)造成一定程度的光氧化損傷，通過調(diào)節(jié)這些基因幫助植物適應(yīng)強(qiáng)光環(huán)境。強(qiáng)光脅迫會(huì)造成植物體內(nèi)的活性氧過度積累，對光系統(tǒng)Ⅱ造成損傷并引起光抑制，而保護(hù)酶會(huì)清除葉綠體產(chǎn)生的過量活性氧（ROS），植物還會(huì)通過合成類胡蘿卜素等光保護(hù)物質(zhì)來保護(hù)細(xì)胞免受光損傷?？寡趸嚓P(guān)基因中超氧化物歧化酶基因SODCP、SODCC，過氧化物酶基因PER71、PER12以及過氧化氫酶相關(guān)基因CAT2、CAT3的表達(dá)量均呈顯著上調(diào)趨勢，說明小白菜可能通過在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)相關(guān)抗氧化酶基因表達(dá)來調(diào)控抗氧化酶活性，從而提高其清除自由基的能力。類胡蘿卜素合成與降解相關(guān)基因CYP97C1、Z-ISO、ZEP在強(qiáng)光下的表達(dá)量顯著上調(diào)，推測可能通過這些基因促進(jìn)類胡蘿卜素的合成，從而增強(qiáng)植物的光保護(hù)能力。與植物光信號傳導(dǎo)密切相關(guān)的PIF4在強(qiáng)光下表達(dá)量顯著下調(diào)，而HY5顯著上調(diào)，說明小白菜可通過在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)而適應(yīng)光照強(qiáng)度的變化。此外，脫落酸是植物響應(yīng)逆境脅迫的重要信號分子^[21]，隨著強(qiáng)光照時(shí)間的延長，脫落酸受體基因PYL8的表達(dá)量呈下調(diào)趨勢，其表達(dá)量的下調(diào)可能表明植物在強(qiáng)光條件下對脫落酸信號的響應(yīng)減弱，通過下調(diào)PYL8的表達(dá)增強(qiáng)植物對光脅迫的耐受性。

2.8" 差異基因的熒光定量分析

為了驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選擇了8個(gè)基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。如圖5所示，

RNA-Seq數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基因的表達(dá)趨勢

基本一致，其中，參與葉綠素、類胡蘿卜素合成與降解的相關(guān)基因CYP97C1、ZEP、NYC1、Z-ISO在強(qiáng)光照5"d后的相對表達(dá)量增加，光合作用相關(guān)基因LHCA6、LHCA5、LHAB1.3和psbA在強(qiáng)光照5"d后的相對表達(dá)量降低。qRT-PCR分析結(jié)果與測序結(jié)果吻合，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果準(zhǔn)確。

2.9" 不同光強(qiáng)對小白菜葉片抗氧化酶活性的影響

由表5可知，與正常光相比，在強(qiáng)光照0～5 d時(shí)，SOD和POD活性顯著增加，CAT活性差異不顯著，但在強(qiáng)光照10～15"d時(shí)顯著增加。說明植物在強(qiáng)光初期脅迫下，通過增強(qiáng)SOD和POD活性，積極應(yīng)對光合過程中產(chǎn)生的活性氧（ROS），以防止氧化損傷，而在面對長期光強(qiáng)脅迫時(shí)，CAT的作用逐漸顯現(xiàn)，三者共同作用提升植物在強(qiáng)光下的適應(yīng)能力。

3" 討論

本研究對小白菜在強(qiáng)光條件下的生理和分子響應(yīng)進(jìn)行了全面分析。通過對比小白菜的生長表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)光處理對小白菜的生長發(fā)育具有顯著影響。丁娟娟等^[22]發(fā)現(xiàn)，隨著光照的增強(qiáng)，不結(jié)球小白菜的生物量呈增加趨勢。本研究中，強(qiáng)光處理下矮腳黃小白菜的干重顯著增加，這與丁娟娟等的研究結(jié)果基本一致。LEI等^[23]發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著光強(qiáng)提高，光合產(chǎn)物增多，地上部生長受促進(jìn)，導(dǎo)致根冠比降低。本研究中，強(qiáng)光處理5"d時(shí)，小白菜的根冠比與對照相比顯著降低。吳瓊^[24]發(fā)現(xiàn)，香果樹幼苗的根冠比隨光照強(qiáng)度的增加顯著增加，這與本研究中小白菜在強(qiáng)光處理10～15"d根冠比顯著增加的結(jié)果一致。推測這可能是因?yàn)橹参锸軓?qiáng)光影響前期可能將更多的資源分配到地上部分以提高光合作用能力，造成根冠比下降；一段時(shí)間后植物需要增強(qiáng)水分吸收以應(yīng)對蒸騰加劇，根系的生長可能會(huì)被刺激，從而導(dǎo)致根冠比上升。研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光會(huì)造成植物葉片的葉綠素含量降低，一定程度上抑制葉綠體的發(fā)育^[25]。在本研究中，強(qiáng)光處理導(dǎo)致小白菜的相對葉綠素含量顯著下降，小白菜在強(qiáng)光處理第5～15天時(shí)，光合參數(shù)P_n、T_r、G_s均顯著增加，表現(xiàn)出更高的光合效率，這與LIU等^[26]的研究結(jié)果一致，推測可能與葉綠體類囊體基粒數(shù)目增加有關(guān)。

對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行GO和KEGG富集分析，差異表達(dá)基因主要富集于光合作用和抗氧化防御機(jī)制相關(guān)途徑，包括光能捕獲、光合電子傳遞鏈以及活性氧清除、抗氧化酶的表達(dá)調(diào)控等。強(qiáng)光會(huì)引起植物葉綠體中活性氧的爆發(fā)，造成細(xì)胞內(nèi)氧化脅迫的產(chǎn)生，損傷葉綠體DNA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄及翻譯紊亂，造成類囊體膜結(jié)構(gòu)被破壞，光系統(tǒng)核心蛋白被降解，嚴(yán)重抑制光合作用^[27]。捕光復(fù)合體Ⅱ（LHCⅡ）是植物光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）中與色素分子結(jié)合的一系列膜蛋白，由LHCB1-LHCB6六種膜蛋白組成，它們由核基因LHCB家族編碼，含有保守的葉綠素a/b結(jié)合結(jié)構(gòu)域^[28]。強(qiáng)光下，擬南芥LHCB1-6呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢^[29]，本研究中，LHCB1.3和LHCB4.2在強(qiáng)光處理5"d后也呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢。推測強(qiáng)光可能導(dǎo)致小白菜中部分捕光復(fù)合物數(shù)量減少，致使葉綠體的捕光能力下降，相關(guān)的光保護(hù)能力也同時(shí)降低。PsbA又稱D1蛋白，是一種高度保守的色素結(jié)合蛋白^[30]，由葉綠體基因組編碼，是光系統(tǒng)Ⅱ核心復(fù)合體的亞基之一^[31]，與其他類囊體膜蛋白質(zhì)相比，D1蛋白更易受到光損傷^[32]。D1蛋白的修復(fù)和替換是植物在強(qiáng)光環(huán)境下生存所依賴的重要機(jī)制^[33]。本研究中，強(qiáng)光處理5 d后PsbA下調(diào)表達(dá)，與黃欣^[34]的研究結(jié)果一致，推測強(qiáng)光對小白菜幼苗光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）造成光損傷，D1蛋白降解速度大于修復(fù)速度。PSBO是光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）中由psbB和psbC基因編碼的核心天線復(fù)合物，與光系統(tǒng)Ⅱ的放氧活性密切相關(guān)。本研究中，PSBO2在強(qiáng)光處理后呈現(xiàn)顯著下調(diào)，推測強(qiáng)光抑制了光系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)蛋白和放氧復(fù)合物核心蛋白的表達(dá)，同時(shí)激活了光損傷保護(hù)機(jī)制。GLKs（GOLDEN 2-LIKEs）是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，靶向調(diào)控光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控葉綠體的發(fā)育、分化并維持其機(jī)能，并參與植物逆境應(yīng)答^[8]。GLKs是植物細(xì)胞核主導(dǎo)葉綠體發(fā)育的正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，主要轉(zhuǎn)錄激活2類PhANGs基因的表達(dá)，一類是編碼葉綠素生物合成的一系列關(guān)鍵酶，另一類是編碼光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ、光電子傳遞復(fù)合體的各類亞基^[35-38]。研究表明，當(dāng)質(zhì)體受損或生物合成減弱時(shí)會(huì)引發(fā)大量PhANGs基因表達(dá)下降^[39]。本研究中GLK1呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，推測強(qiáng)光影響葉綠素生物合成和光合系統(tǒng)復(fù)合體亞基，對光合作用造成影響。PYL是植物激素脫落酸（abscisic，ABA）信號通路的核心組分之一，脫落酸（abscisic，ABA）是重要的植物激素，調(diào)節(jié)植物多個(gè)生長發(fā)育階段和脅迫響應(yīng)^[40]。在保衛(wèi)細(xì)胞中，脫落酸受體PYL與PP2C磷酸酶相互作用，從而釋放活躍的SnRK2激酶，激活SLAC1通道，通過減少保衛(wèi)細(xì)胞的膨脹進(jìn)而影響氣孔關(guān)閉^[41]。PYL8作為ABA受體，其下調(diào)會(huì)導(dǎo)致SnRK2激酶活性降低，解除對PP2C磷酸酶的抑制，進(jìn)而使氣孔的關(guān)閉程度降低^[42]。本研究中，PYL8呈下調(diào)趨勢，而強(qiáng)光處理5 d后G_s顯著升高，推測其可能通過減少氣孔關(guān)閉，維持較高的G_s值。玉米黃質(zhì)環(huán)化酶ZEP位于類胡蘿卜素合成途徑的末端，是一種雙功能單加氧酶，是葉黃素循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶^[43]。Z-ISO（ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶）是類胡蘿卜素合成的限速酶，其上調(diào)可推動(dòng)ζ-胡蘿卜素向鏈孢紅素轉(zhuǎn)化，加速類胡蘿卜素合成^[44]。CYP97C1（β-胡蘿卜素羥化酶）通過羥基化反應(yīng)生成玉米黃質(zhì)和葉黃素，增強(qiáng)光保護(hù)能力^[45]。本研究中，參與類胡蘿卜素合成的ZEP、CYP97C1和Z-ISO在強(qiáng)光處理后均呈上調(diào)趨勢，推測三者協(xié)同作用促進(jìn)玉米黃質(zhì)積累，增強(qiáng)光保護(hù)和抗逆性。NYC1（NON- YELLOW COLORING）基因編碼的是一種類囊體膜定位的短鏈脫氫酶/還原酶（SDR），含有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域^[46]。過表達(dá)NYC1基因會(huì)促進(jìn)葉綠素的降解、加速葉片衰老，并恢復(fù)擬南芥nyc1突變體滯綠的表型，同時(shí)伴隨著ABA和ROS的積累，對光合作用造成抑制^[47-48]。葉綠素酶（chloro-ph-yllase， CLH）催化葉綠素的脫植基反應(yīng)，生成脫植基葉綠素和植醇基。研究表明，葉綠素酶與葉綠素的降解密切相關(guān)，在南瓜葉片和煙草細(xì)胞中過表達(dá)柑橘CLH基因，將會(huì)加速葉片組織的葉綠素降解^[49-50]。本研究中，NYC1和CLH2均上調(diào)表達(dá)，推測二者通過葉綠素降解過程參與強(qiáng)光響應(yīng)機(jī)制。HY5（ELON-G-A-TED HYPOCOTYL5）是bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，作為植物光形態(tài)建成過程中的核心轉(zhuǎn)錄因子，在強(qiáng)光或紫外光環(huán)境下，能夠直接作用于編碼具有光保護(hù)功能的光誘導(dǎo)蛋白2（light induced protein 2，ELIP2）的基因啟動(dòng)子區(qū)域，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制激活該基因的表達(dá)^[51]。PIF4是調(diào)控葉片衰老的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠響應(yīng)光周期、環(huán)境溫度、干旱、營養(yǎng)可利用性以及代謝相關(guān)等非生物脅迫，通過干擾葉綠體穩(wěn)態(tài)維持并誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)葉片衰老^[52]。張婉月^[53]研究發(fā)現(xiàn)，PIF4和HY5能夠參與光控下BR等植物生長主要激素的合成。PIF4作為連接這些激素和光敏色素信號通路的分子樞紐發(fā)揮作用^[54]。本研究結(jié)果表明，強(qiáng)光下PIF4的表達(dá)量降低，推測在強(qiáng)光條件下，光敏色素激活可能會(huì)抑制PIF4的表達(dá)，以減少PIF4介導(dǎo)的生長信號，避免植物因過度生長而導(dǎo)致的生理損傷。HY5和ELIP2表達(dá)量增加，推測強(qiáng)光會(huì)誘導(dǎo)HY5蛋白的積累，從而介導(dǎo)ELIP2響應(yīng)強(qiáng)光的過程，共同作用增強(qiáng)植物對光脅迫的耐受能力。

在植物細(xì)胞中，抗氧化系統(tǒng)包括抗氧化劑和抗氧化酶類2部分，ROS的清除可通過抗氧化劑

和抗氧化酶的協(xié)同作用共同完成，其中抗氧化分子包括類胡蘿卜素、生育酚、抗壞血酸及谷胱甘肽等，抗氧化酶有SOD、POD、CAT和APX等^[55]。在活性氧代謝中CAT是清除H₂O₂的關(guān)鍵酶，而CAT基因的表達(dá)受到多種因素的影響，如光照、溫度、植物激素等。在煙草研究中，已經(jīng)明確CAT基因的功能，其可以特異性地清除植物體內(nèi)過量的H₂O₂^[56]。在強(qiáng)光脅迫下，番茄幼苗^[57]、葡萄^[58]、小麥^[59]、牡丹^[60]等的抗氧化酶活性都會(huì)隨光照強(qiáng)度的增加而升高。本研究中小白菜在強(qiáng)光照5"d后，與POD相關(guān)的基因（PER71、PER12）、與SOD相關(guān)的基因（SODCP、SODCC）、與CAT相關(guān)的基因（CAT2、CAT3）均呈上調(diào)趨勢，與本研究中抗氧化酶活性變化趨勢基本相同，這與CHEN等^[61]和劉婭惠等^[62]研究結(jié)果一致，推測小白菜受到強(qiáng)光照時(shí)，可能通過提高抗氧化酶活性來抵抗逆境。

4 "結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)光會(huì)對小白菜的各項(xiàng)生理指標(biāo)以及分子機(jī)理造成一定程度的影響，轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因廣泛富集在與植物光合作用以及抗氧化酶活性相關(guān)的通路中，如HY5、LHCB1.3、ELIP2等14個(gè)光合作用以及光保護(hù)相關(guān)基因和PER12、CAT2、SODCP等6個(gè)抗氧化相關(guān)基因。在強(qiáng)光處理下的表達(dá)是其適應(yīng)強(qiáng)光環(huán)境的關(guān)鍵機(jī)制之一，能夠幫助植物調(diào)整光合作用的效率，影響活性氧的代謝，保護(hù)自身免受光脅迫的影響，一定程度上緩解強(qiáng)光對小白菜生長的抑制，增強(qiáng)其抗氧化酶活性，提高幼苗對強(qiáng)光的應(yīng)對能力。

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