補(bǔ)腎寧神膏的指紋圖譜建立、含量測(cè)定及體外抗氧化作用的譜效關(guān)系研究

中圖分類號(hào) R84.1;R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號(hào) 1001-0408（05）14-1749-06

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.05.14.10

ABSTRACTOBJECTIVEToestablish thefingerprint of Bushenningshenointment，determinethecontentsof its major constituents，andinvestigateitsinvitroantioxidantactivity.METHODsHighperformanceliquidchromatography（HPLC） fingerprintsof1batchesofBushen nngshen ointment were established.Similarityevaluationand identificationofcommonpeaks weresubsequently performed.Thecontentsof1Ocomponentssuchassalidrosidewere determinedusing thesame HPLCmethod. Using the scavenging rates against 2， 2^′ -azino bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS）and1，1-diphenyl-2- picrylhydrazyl（DPH）adicals，aswellasfericionreducingantioxidantpower（FRAP）asindcators，theanti-oxidantactivityof theointment was evaluated；greyrelationalanalysisandpartialleastsquaresregresion wereconductedusingSMCA14.1software toestablishthespectrum-efectrelationship.RESULTSThefingerprintchromatogramof10batchesof Bushenningshenointment contained 24 common peaks， with similarity valuesallexceeding O.96.Eleven peaks were identified as adenosine（peak1），salidroside（peak4），morroniside（peak6），catechin（peak7），paeoniflorin（peak 1O），spinosin（peak11），ferulic acid （peak 12），isoquercitrin （peak 13），verbascoside（peak 14），paeonol （peak 23），and emodin（peak 24）.Content determination results showed that theaverage contentsof salidroside，morroniside，catechin，paeoniflorin，spinosin，ferulicacid，isoquercitrin，verbascoside，paeonol，andemodinwere0.725，1.962，0.214，3.395，0.124，0107，0.286， 0.019，0.034 and 0.067mg/g ，respectively.The antioxidant potency composite index（APC）for the 10 batches ranged from 85.08% to 96.35% .Spectrum-effect relationshipanalysis indicated that all 24common peaks were positively correlated with the antioxidant capacity. Seventeen peaks had variable importance in projection values gt;1 ，specitically peaks 2，5，6，7，9，10，13- 21，23，and24.CONCLUSIONSThis studysucesfullyestablishedthe HPLC fingerprintandcontentdetermination method for Bushenningshenointment.Thecompoundsrepresented bythe17commonpeakssuch as moronisidemaybetheactivecomponents contributing to its antioxidant effects.

KEYWORDsBushenningshenointment；fingerprint；spectrum-efectrelationship；antioxidantactivity；contentdetermination

補(bǔ)腎寧神膏根據(jù)深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院治未病科徐文華主任醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)方制備而成，該方由熟地黃、山茱萸、酒川芎、鹽女貞子、炒酸棗仁、牡丹皮、首烏藤、茯神、龍齒等16味藥材組成，具有滋陰補(bǔ)腎、養(yǎng)心安神的功效，臨床主要用于治療腎血不足、虛火內(nèi)擾所致的失眠、多夢(mèng)等癥，療效顯著。

補(bǔ)腎寧神膏的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅為薄層鑒別、性狀及常規(guī)檢查。由于復(fù)方制劑主要通過(guò)多組分、多靶點(diǎn)的特性來(lái)協(xié)同實(shí)現(xiàn)整體療效，因此現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以全面反映補(bǔ)腎寧神膏的整體質(zhì)量。該方中酒川芎中的阿魏酸、兒茶素，牡丹皮中的芍藥苷、丹皮酚、異槲皮苷，鹽女貞子中的毛蕊花糖苷、紅景天苷，炒酸棗仁中的斯皮諾素，以及山茱萸與鹽女貞子共有的腺苷等成分，均具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)及調(diào)節(jié)心血管功能等活性-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是失眠的重要病理生理機(jī)制之一，長(zhǎng)期失眠會(huì)導(dǎo)致大腦產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基，而安神助眠的作用機(jī)制常被認(rèn)為與減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)[4-5]。然而，現(xiàn)有的研究多聚焦于單一成分的體外抗氧化活性，缺乏對(duì)復(fù)方制劑整體抗氧化效應(yīng)及其物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)性分析。這可能導(dǎo)致不同批次樣品的質(zhì)量波動(dòng)，從而影響療效的穩(wěn)定性，甚至存在中藥質(zhì)量控制中“成分與藥效割裂”的關(guān)鍵問(wèn)題。

指紋圖譜能在保證質(zhì)量穩(wěn)定性與一致性的同時(shí)，既彌補(bǔ)單一成分的局限性，又能為藥效物質(zhì)的篩選提供數(shù)據(jù)支持。中藥譜效學(xué)能夠系統(tǒng)地分析中藥中多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用，符合中醫(yī)藥“整體觀\"理論?；疑P(guān)聯(lián)度分析和偏最小二乘回歸分析可識(shí)別中藥化學(xué)成分與藥效的相關(guān)性，分析成分對(duì)藥效的綜合貢獻(xiàn)?；诖耍狙芯拷⒘搜a(bǔ)腎寧神膏的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并同法測(cè)定了補(bǔ)腎寧神膏中紅景天苷等10個(gè)成分的含量；采用 ^{2，2′} -聯(lián)氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、鐵離子還原能力（FRAP）法測(cè)定其體外抗氧化活性；通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度分析與偏最小二乘回歸分析篩選其抗氧化活性成分，旨在為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有e2695型HPLC儀（美國(guó)Waters公司），BioTekSynergyHTX型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Agilent公司），MS105型十萬(wàn)分之一電子分析天平、

JS703C型萬(wàn)分之一電子分析天平（美國(guó)MettlerToledo公司），DA型數(shù)控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品腺苷（批號(hào)J08HB173656）、莫諾苷（批號(hào)M14IB209606）、紅景天昔（批號(hào)PO1A9L67130）、兒茶素（批號(hào)O13IY228437）、阿魏酸（批號(hào)G13S11L124423）、芍藥昔（批號(hào)M22HB179898）、大黃素（批號(hào)YY90044）、斯皮諾素（批號(hào)A31IB224722）、異槲皮昔（批號(hào)Y24J11H119521）、毛蕊花糖苷（批號(hào)Z28S11X125952）、丹皮酚（批號(hào)N22H8201956）及維生素E（批號(hào)S13016）、2，4，6-三吡啶基三嗪溶液（TPTZ）（批號(hào)S30632）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于 98% ; ABTS（批號(hào)C15283881）、DPPH（批號(hào)C15568523）過(guò)氧化物酶（批號(hào)C15283881）FeSO4·7HO（批號(hào)MFCD00149719）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（批號(hào)P787575）、FeCl3溶液（批號(hào)MFCD00011005）均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

補(bǔ)腎寧神膏（批號(hào)20240124、20230912、20240116、20240515、20240229、20231113、20240416、20231221、20231227、20240923，編號(hào) S1～S10;1g 相當(dāng)于飲片6.6g）由深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房自制。

2 方法與結(jié)果

2.1補(bǔ)腎寧神膏指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

以xBridge 為色譜柱，以乙腈（A）- .0.2% 磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（ 0～5min ， 5%A?10%A 5～10min ， 10%A?13%A 10～15min ， 13%A?15%A 15～20min ， 15%A 20～25 min， 15%A20%A;25～40min，20%A28%A;40～45 min 28%A30%A;45～50min，30%A50%A;50～55 min， 50%A?65%A ; 55～60min 65%A?95%A;60～70 min 95%A ）；流速為 0.6mL/min ;柱溫為 30^°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)為 230nm ;進(jìn)樣量為 10μL 。

2.1.2 供試品溶液的制備

取補(bǔ)腎寧神膏樣品 0.5g ，置于干燥錐形瓶中，加入甲醇 20mL ，超聲 30min ，冷卻，用甲醇補(bǔ)足失重，經(jīng)0.22μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱定紅景天昔、莫諾苷、兒茶素、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、異槲皮苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚、大黃素、腺昔對(duì)照品適量，分別置于 10mL 容量瓶中，加甲醇定容，制得各單一對(duì)照品貯備液。取上述各單一對(duì)照品貯備液適量，置于 5mL 容量瓶中，加甲醇定容，得上述各成分質(zhì)量濃度分別為73.080、164.552、40.868、97.120、21.456、16.856、31.616、24.160、8.442、16.884、27.456μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

取\"2.1.2\"項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按\"2.1.1\"項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。以紅景天昔為參照峰，得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 0.34%（n=6） ，相對(duì)峰面積的RSD均小于 2.56%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.2\"項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置 0.2、4、8、12、24h 時(shí)按“2.1.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以紅景天昔為參照峰，得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 0.40%（n=6） ，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.92%（n=6） ，表明樣品溶液在室溫下放置 24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（編號(hào)S1）適量，按\"2.1.2\"項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.1.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以紅景天昔為參照峰，得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 0.18%（n=6） ，相對(duì)峰面積的RSD均小于 2.62% L n=6 ），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 HPLC指紋圖譜的生成

取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào) ，按“2.1.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)10批樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析。以S1為參照?qǐng)D譜（相似度最高），設(shè)置時(shí)間窗寬度為 0.1min ，采用均值法，經(jīng)多點(diǎn)校正后，得到HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜R。結(jié)果顯示，10批樣品共有24個(gè)共有峰。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.8 相似度評(píng)價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)10批樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批樣品與對(duì)照指紋圖譜R的相似度為 0.961～ 0.995，表明樣品的整體質(zhì)量差異較小。

2.1.9 共有峰的指認(rèn)

取“2.1.3\"項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按\"2.1.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，經(jīng)與對(duì)照指紋圖譜R比對(duì)，共指認(rèn)出11個(gè)成分，分別為腺苷（峰1）紅景天苷（峰4）、莫諾苷（峰6）、兒茶素（峰7）芍藥苷（峰10）斯皮諾素（峰11）阿魏酸（峰12）異槲皮苷（峰13）、毛蕊花糖苷（峰14）、丹皮酚（峰23）及大黃素（峰24）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2混合對(duì)照品溶液和對(duì)照指紋圖譜R的HPLC圖

1：腺苷；4：紅景天苷;6：莫諾苷；7：兒茶素；10：芍藥苷；11：斯皮諾素；12：阿魏酸；13：異槲皮苷；14：毛蕊花糖苷；23：丹皮酚；24：大黃素。

2.2補(bǔ)腎寧神膏中多指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件色譜條件同\"2.1.1\"項(xiàng)。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱定紅景天苷、莫諾苷、兒茶素、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、異槲皮苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚、大黃素對(duì)照品適量，按\"2.1.3\"項(xiàng)下方法制備各單一對(duì)照品貯備液。取上述各單一對(duì)照品貯備液適量，置于 5mL 容量瓶中，加甲醇定容，得上述各成分質(zhì)量濃度分別為73.080、164.552、40.868、194.240、21.456、16.856、31.616、3.624，8.442，16.884μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備制備方法同\"2.1.2\"項(xiàng)。

2.2.4線性關(guān)系考察

取“2.2.2\"項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋，得到各成分的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述各成分的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液及“2.2.2\"項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各成分質(zhì)量濃度 （x） 為橫坐標(biāo)、峰面積 （y） 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1紅景天苷等10個(gè)成分的回歸方程與線性范圍

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.3\"項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按“2.2.1\"項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，紅景天苷等10個(gè)成分峰面積的RSD均小于 1.93%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3\"項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24h時(shí)按“2.2.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，紅景天苷等10個(gè)成分峰面積的RSD均小于 2.72%（n=6） ，表明樣品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（編號(hào)S1）適量，按\"2.2.3\"項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。結(jié)果顯示，紅景天昔等10個(gè)成分含量的RSD均小于 2.44%（n=6） ，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（編號(hào)S1）約 1.00g ，共6份，分別加入與各成分含量相當(dāng)?shù)膯我粚?duì)照品溶液（芍藥苷、莫諾苷、紅景天苷、異槲皮苷、兒茶素、斯皮諾素、阿魏酸、丹皮酚、毛蕊花糖昔、大黃素質(zhì)量濃度分別為3.198、1.863，0.704，0.270，0.204，0.120，0.103，0.032，0.019， （200.060mg/mL ），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，紅景天昔等10個(gè)成分的平均加樣回收率為 98.57%～101.50% ，RSD均小于 1.98%（n=6） ，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.9 含量測(cè)定

取10批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含量，每批樣品測(cè)定2次，取平均值。結(jié)果見(jiàn)表2。

表210批樣品中紅景天苷等10個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果 （n=2，mg/g）

2.3補(bǔ)腎寧神膏的體外抗氧化活性測(cè)定

2.3.1ABTS自由基清除率測(cè)定

精密稱取維生素 E12.50mg ，加 60% 乙醇超聲溶解并定容至 10mL （濃度為 5.0mmol/L ），再用 60% 乙醇稀釋，得到濃度分別為 0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0，mmol/L 的維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液。取過(guò)氧化氫和雙蒸水 （1：39 ，V/V混勻，得溶液A。取PBS、ABTS和溶液A （152：10：8 ，V/V/V混勻，得溶液B。取過(guò)氧化物酶和PBS （1：9，V/V） 混勻，得溶液C。取\"2.2.3\"項(xiàng)下供試品溶液[用 60% 甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為 （25±0.5）mg/mL]10μL 溶液B170μL 和溶液 C20μL ，混勻，移至96微孔板中，作為實(shí)驗(yàn)組。取不同濃度的維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液 10μL 至96微孔板中，加入溶液 B170μL 和溶液 C20μL ，混勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線組。上述溶液均室溫避光靜置 6min 后，采用酶標(biāo)儀于 414nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。每組設(shè)置3個(gè)平行孔。以維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo) （x） 、吸光度為縱坐標(biāo) （y） 得到回歸方程為 y=-1.692 3x+1.902 8（r= 0.9996）。按公式計(jì)算ABTS自由基清除率：ABTS自由基清除率 ：樣本的平均吸光度值；b：標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距； a ：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率 ;f; 樣本加入檢測(cè)體系之前的稀釋倍數(shù)； m ：質(zhì)量； V; 樣本加入體積）。結(jié)果顯示，10批樣品均具有清除ABTS自由基的能力，其中S2樣品清除能力最強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表310批樣品的抗氧化測(cè)定結(jié)果 τ（n=3，mmol/g）

2.3.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

精密稱取維生素 E31.29mg ，加 60% 乙醇超聲溶解并定容至 10mL （濃度為 12.5mmol/L ），再用無(wú)水乙醇稀釋，得到濃度分別為 0.025，0.050，0.0625，0.075，0.0875. 0.100mmol/L 的維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取DPPH0.10mg，置于棕色瓶中，加無(wú)水乙醇 1mL ，超聲溶解，再加無(wú)水乙醇 11mL ，超聲，得DPPH工作液。取“2.2.3\"項(xiàng)下供試品溶液，用 80% 甲醇稀釋，得到質(zhì)量濃度為 25mg/mL 的待測(cè)液。取待測(cè)液 80μL 、無(wú)水乙醇 100μL ，混合，作為對(duì)照組。取待測(cè)液 80μL 、DPPH工作液 100μL ，混勻，作為樣品組。取不同濃度的維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液80μL DPPH工作液 100μL ，混合，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線組。上述溶液均室溫避光靜置 10min 后，采用酶標(biāo)儀于 525nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。每組設(shè)置3個(gè)平行孔。以維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo) （x） 、吸光度為縱坐標(biāo) （y） 得到回歸方程為 y=0.0046x-0.0124（r=0.9942） 。按公式計(jì)算 DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=1×（204號(hào) 樣本的平均吸光度值;b：標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距； a ：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率； m ：質(zhì)量；V：樣本加人體積）。結(jié)果顯示，10批樣品均具有清除DPPH自由基的能力，其中S9樣品清除能力最強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.3 FRAP的測(cè)定

精密稱取 FeSO₄?7H₂O27.80mg ，加雙蒸水溶解并定容至 10mL （濃度為 100mmol/L ），再用雙蒸水稀釋，得到濃度分別為 0.3、0.6、0.9、1.2、1.8、2.1、2.5mmol/L 的FeSO₄ ·7HO標(biāo)準(zhǔn)溶液。取PBS、TPTZ溶液和FeCl溶液（10：1：1，V/V/V），混勻，得FRAP工作液。取“2.2.3\"項(xiàng)下供試品溶液，加 0.01mmol/L PBS稀釋，得質(zhì)量濃度為25mg/mL 的待測(cè)液。取待測(cè)液 5μL 、FRAP工作液180μL ，混合，作為樣品組。取不同濃度的 FeSO₄?7H₂O 標(biāo)準(zhǔn)溶液 5μL FRAP工作液 180μL ，混合，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線組。各組溶液分別加入96微孔板中，于 37^°C 孵育5min，采用酶標(biāo)儀于 593nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。每組設(shè)置3個(gè)平行孔。以 FeSO₄?7H₂O 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo) （x） 、吸光度為縱坐標(biāo) （y） 得到回歸方程為 y=0.30304x+ 0.001（ r=0.999 3， ）。按公式計(jì)算FRAP：FRAP 0 ΔA₅₉₃- b）÷a×f÷c_pr（ΔA₅₉₃ ：樣本的平均吸光度值;b：標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距； a ：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；f：樣本加入檢測(cè)體系之前的稀釋倍數(shù)； c_pr ：待測(cè)樣本蛋白濃度）。結(jié)果顯示，10批樣品均具有FRAP，其中S8樣品的抗氧化能力最強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.4抗氧化活性綜合指數(shù)分析

因不同體外抗氧化模型體系反映不同的抗氧化機(jī)制，單一的指標(biāo)難以綜合評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力，故本研究參考文獻(xiàn)[9]，根據(jù)表3中的測(cè)定結(jié)果，以抗氧化活性綜合指數(shù)（antioxidant potency composite index，APC）評(píng)估補(bǔ)腎寧神膏的抗氧化能力，計(jì)算公式為： APC= 該方法測(cè)定值/該方法測(cè)定最大值 ×100% ，平均綜合指數(shù) （ABTS-APC+DPPH-APC+FRAP-APC）/3，以平均綜合指數(shù) gt;70% 表示抗氧化能力較強(qiáng)[]。結(jié)果（表4）顯示，10批樣品的平均綜合指數(shù)為 85.08%～96.35% ，表明10批樣品均具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2.4 譜效關(guān)系研究

2.4.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析

將10批補(bǔ)腎寧神膏的APC作為母序列，24個(gè)共有峰峰面積作為子序列，采用初值化變換法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用SPSSpro軟件進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。結(jié)果（表5）顯示，24個(gè)共有峰與APC的關(guān)聯(lián)度均不小于0.661，表明共有峰與APC存在關(guān)聯(lián)性，補(bǔ)腎寧神膏通過(guò)多成分共同發(fā)揮抗氧化作用。

2.4.2 偏最小二乘回歸分析

以10批補(bǔ)腎寧神膏的APC為因變量，24個(gè)共有峰峰面積為自變量，采用SIMCA14.1軟件進(jìn)行偏最小二乘回歸分析。標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)的正負(fù)分別表示各共有峰與抗氧化活性呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。以變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值 gt;1 表明該共有峰對(duì)補(bǔ)腎寧神膏抗氧化活性有顯著貢獻(xiàn)[。圖3A結(jié)果顯示，10批補(bǔ)腎寧神膏的24個(gè)共有峰與APC的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)均大于0，均呈正相關(guān)。圖3B結(jié)果顯示，17個(gè)共有峰（峰 2，5～7，9，10，13～21，23，24） 的VIP值 gt;1 ，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出其中7個(gè)，分別為莫諾苷（峰6）、兒茶素（峰7）、芍藥苷（峰10）、異槲皮苷（峰13）、毛蕊花糖苷（峰14）、丹皮酚（峰23）及大黃素（峰24）。

圖3共有峰與APC的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)及VIP值

3討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

酒川芎中的阿魏酸和兒茶素具有抗氧化、改善心腦血管功能等作用；牡丹皮中的芍藥苷、丹皮酚和異槲皮昔具有較強(qiáng)的清除自由基活性，可調(diào)節(jié)心血管功能[；毛蕊花糖苷是鹽女貞子的活性成分之一，具有神經(jīng)保護(hù)作用[14]；炒酸棗仁中的斯皮諾素具有安神作用[];腺苷是山茱萸及鹽女貞子的共有成分，具有抗氧化、安神的作用；鹽女貞子、山茱萸、首烏藤分別含有的紅景天苷、莫諾苷和大黃素成分，均具有抗氧化功效[3.15-16]。因熟地黃中的主要成分易受炮制影響，茯神及龍齒的分析難度大[8]，故未對(duì)熟地黃、茯神和龍齒的有效成分進(jìn)行分析。此外，由于腺昔在色譜圖中的峰形相對(duì)較差，故也未對(duì)其進(jìn)行定量分析。綜上，本研究選擇紅景天苷、莫諾苷、兒茶素、芍藥苷、斯皮諾素、阿魏酸、異槲皮昔、毛蕊花糖昔、丹皮酚及大黃素作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.2樣品前處理及色譜條件的選擇

本研究分別對(duì)不同提取溶劑（甲醇、 85% 甲醇、 50% 甲醇）不同提取時(shí)間 （20，45，60min 進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇為提取溶劑時(shí)，各色譜峰的峰面積大、峰形好。對(duì)補(bǔ)腎寧神膏進(jìn)行 200～400nm 全波長(zhǎng)掃描的結(jié)果顯示，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為 230nm 時(shí)，色譜峰數(shù)目最多，能夠全面反映該制劑的指紋圖譜特征。對(duì)不同流動(dòng)相體系（乙腈-水、乙腈 .0.1% 磷酸溶液、乙腈 .0.2% 磷酸溶液、甲醇-水、甲醇 .0.2% 磷酸溶液）的考察結(jié)果顯示，以乙腈 .0.2% 磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)的分離效果最佳，色譜峰峰形良好。

3.3指紋圖譜、含量測(cè)定及譜效關(guān)系分析

本研究共有24個(gè)共有峰，指認(rèn)出11個(gè)共有峰，且相似度 gt;0.96 。結(jié)合含量測(cè)定結(jié)果可知，10批樣品中的紅景天昔、異槲皮昔、丹皮酚含量差異顯著，其原因可能為藥材原料存在差異（如產(chǎn)地、采收季節(jié)等）。已有研究表明，不同產(chǎn)地女貞子可能存在品質(zhì)差異，其質(zhì)量標(biāo)志物紅景天苷的含量亦呈明顯的地域性波動(dòng)[9；異槲皮昔易光解，在貯存過(guò)程中易發(fā)生降解[20；丹皮酚在干燥及貯存過(guò)程中易揮發(fā)[21]。譜效關(guān)系研究結(jié)果顯示，24個(gè)共有峰與APC均呈正相關(guān)，有17個(gè)共有峰（峰 2.5～7.9.10 13～21、23、24）的VIP值 gt;1 ，表明這17個(gè)共有峰代表的化合物可能是補(bǔ)腎寧神膏發(fā)揮抗氧化作用的藥效成分。

綜上所述，本研究成功建立了補(bǔ)腎寧神膏的HPLC指紋圖譜及含量測(cè)定方法；莫諾昔等17個(gè)共有峰代表的化合物可能是其發(fā)揮抗氧化作用的藥效成分。

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