油莎豆內(nèi)生真菌分離鑒定及其代謝物活性與促生性能研究

中圖分類(lèi)號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2025）11-0247-08

油莎豆（Cyperus esculentus L.var.sativusBaeck）是一年生的莎草科植物，有較強(qiáng)的抗逆性、產(chǎn)量高、易栽種、耐貧瘠等特點(diǎn)，具有降糖、抗氧化、保肝等多種藥理作用[1-5]。2010 年前，全國(guó)油莎豆種植面積不足 667hm² ，2018年形成規(guī)模種植，增加至 ，目前，我國(guó)油莎豆種植面積已超6 867hm^2[6] 。植物內(nèi)生真菌是指在植物體內(nèi)正常生活且對(duì)宿主植物不引起病癥的微生物，研究表明，具有促生能力的內(nèi)生真菌可通過(guò)產(chǎn)生具有促生活性的代謝物或參與宿主植物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)來(lái)提高宿主植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。自前，促生內(nèi)生真菌作為生物肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域中已有許多研究，相較于傳統(tǒng)的化學(xué)肥料，生物肥料具有改善作物品質(zhì)、提高作物產(chǎn)量、不污染環(huán)境等諸多優(yōu)點(diǎn)，部分內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物還具有藥用價(jià)值，是研究和開(kāi)發(fā)生物肥料和藥用植物的重要綠色資源，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有非常重要的意義。已有許多研究早已發(fā)現(xiàn)，從植物中分離出的內(nèi)生真菌不僅對(duì)宿主有較好的促生效果，且對(duì)非宿主植物的生長(zhǎng)也有較好的促生效果，如對(duì)溫郁金、美人蕉、馬尾松、水稻、黃瓜和蘿卜等經(jīng)濟(jì)作物有促生長(zhǎng)作用[7]。李岷澤等研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌芽生孢子對(duì)番茄生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，可促進(jìn)番茄根系的生長(zhǎng)[8]。同樣，彭靚等從米槁根部篩選得到4株具有較強(qiáng)溶磷、解鉀能力及產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）特性的內(nèi)生真菌，研究結(jié)果表明它們對(duì)米稿幼苗皆有促進(jìn)作用[9]。植物與其內(nèi)生真菌的復(fù)雜關(guān)系造成了內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的多樣性，許多內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物能產(chǎn)生降糖、抗氧化和抗腫瘤等活性物質(zhì)，包括萜類(lèi)、醌類(lèi)和黃酮類(lèi)等[10-12]。肖澤恩等研究發(fā)現(xiàn)，木欖內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中具有抑制 α- 葡萄糖苷酶的活性物質(zhì)[13];石逸冰等從內(nèi)生真菌布雷青霉菌的發(fā)酵液中分離出2個(gè)具有降血糖活性的化合物和2個(gè)具有抗氧化活性的化合物[14]。 Wu 等研究發(fā)現(xiàn)，多枝黃花根內(nèi)生真菌的發(fā)酵液粗提物具有抗氧化活性[15]。這些內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生對(duì)制藥工業(yè)具有重要價(jià)值的天然化合物。油莎豆內(nèi)生真菌鮮見(jiàn)報(bào)道[16]。本研究以分離油莎豆內(nèi)生真菌的研究為切入點(diǎn)，分別篩選具有促生功能、能分泌 α- 葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性代謝產(chǎn)物的內(nèi)生真菌。以分離的油莎豆（中油莎I）內(nèi)生真菌為研究對(duì)象，篩選具有多種促生功能的促生內(nèi)生真菌和代謝物具有生物活性的活性菌株，以期挖掘油莎豆的內(nèi)生真菌資源，豐富生物肥料的菌種資源，為天然藥物的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

油莎豆（中油莎I）于2023年9月采自廣東省韶關(guān)市瀕江區(qū)試驗(yàn)田。取出整株植株裝于無(wú)菌袋中，在無(wú)菌袋上注明樣品采樣時(shí)間、采樣地點(diǎn)等信息，于韶關(guān)學(xué)院食品學(xué)院進(jìn)行試驗(yàn)。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、金氏培養(yǎng)基、蒙金娜無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基、蒙金娜無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基、蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基、蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基、解鉀培養(yǎng)基、解鉀液體培養(yǎng)基、Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基、CAS培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1 油莎豆內(nèi)生真菌的分離純化 參照劉玉嬌等的方法[17]并稍作改動(dòng)，將采集的油莎豆用自來(lái)水將表面的泥土沖洗干凈、濾紙吸干水分，按常規(guī)無(wú)菌操作對(duì)油莎豆進(jìn)行表面消毒處理： 75% 乙醇浸泡2min ，無(wú)菌水沖洗5次， 2% 次氯酸鈉溶液浸泡1min ，無(wú)菌水沖洗5次，采用無(wú)菌濾紙吸干水分，在無(wú)菌操作條件下將油莎豆剪切成1/2大小。將上述處理過(guò)的組織塊分別放置于含有抗生素（ 20mg/L 卡那霉素和 20mg/L 氨芐青霉素）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和CAS瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)平板放置3塊組織， 28^°C 恒溫培養(yǎng)2～7d，待切口邊緣長(zhǎng)出菌絲，挑取不同形態(tài)的菌絲或菌落轉(zhuǎn)接至相應(yīng)的新鮮培養(yǎng)基中，采用菌絲頂端純化法進(jìn)行純化。消毒可靠性檢驗(yàn)，采用漂洗液檢查法[18] C

1.2.2油莎豆內(nèi)生真菌的鑒定參照Whitelaw等的方法并稍作改動(dòng)[19]。生物學(xué)鑒定：分離純化后的菌株用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物）提取DNA，PCR擴(kuò)增采用引物ITS1-F（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4-R（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴(kuò)增菌株核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列（internaltranscribedspacer，ITS）。將PCR擴(kuò)增純化后的產(chǎn)物委托上海生工測(cè)序部測(cè)序，將測(cè)序得到的堿基序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，將所比對(duì)的相似度結(jié)果結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)行鑒定。

1.2.3油莎豆內(nèi)生真菌促生真菌的篩選產(chǎn)IAA能力篩選：采用Salkowski比色法，觀察其顏色變化，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線 （y=0. 016 4x-0. 007 3） 計(jì)算出該株菌分泌IAA的量[20-22] 。

溶磷能力篩選：將待測(cè)菌株分別接種到有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中，觀察有無(wú)透明圈來(lái)確定有無(wú)溶磷能力和初步判斷其能力大小[23]

解鉀能力測(cè)定：將待測(cè)菌株接種到解鉀培養(yǎng)基中，觀察有無(wú)透明圈來(lái)確定有無(wú)溶磷能力和初步判斷其能力大小，以有無(wú)透明圈來(lái)判斷是否具有解鉀活性[24-25] 。

產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定：采用MAS-CAS檢測(cè)法，以能否在CAS培養(yǎng)基上產(chǎn)生橙黃色變化，篩選具有產(chǎn)鐵載體能力菌株[22]

固氮能力測(cè)定：將待測(cè)菌株接種到Ashby培養(yǎng)基中，以能否3代均能正常生長(zhǎng)判斷是否具有固氮活性[24]1.2.4油莎豆內(nèi)生真菌代謝物降糖活性和抗氧化性分析樣品制備：將分離得到的內(nèi)生真菌在固體培養(yǎng)基中長(zhǎng)滿后，接種到液體培養(yǎng)基中 搖床培養(yǎng) ^7d 。經(jīng)粗濾后 10 000r/min 離心 10min ，得到發(fā)酵液，用乙酸乙酯萃取3次，于 40°C 減壓濃縮至干，得到發(fā)酵液乙酸乙酯提取物。

（1）降糖活性研究：分別取樣品溶液（DMSO溶解的發(fā)酵液乙酸乙酯提取物， 1g/L 與 α- 葡萄糖苷酶溶液和PBS混合， 37^°C 孵育 10min ，然后加人PNPG，37^°C 反應(yīng) 15min ，加人 Na₂CO₃ 終止反應(yīng)，405nm 處測(cè)定吸光度值。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以1.0g/L 阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，反應(yīng)液組成見(jiàn)表1。

用以下公式計(jì)算樣品對(duì) α- 葡萄糖苷酶的抑制率：

式中： D_### 為加樣品溶液反應(yīng)體系的吸光度；D_{#HH^#H#^#H#^#H} 為加樣品溶液不反應(yīng)體系的吸光度; 為不加樣品溶液反應(yīng)體系的吸光度； D_∵□ed÷x+? 為PBS緩沖液反應(yīng)體系的吸光度。

（2）抗氧化活性研究：分別取樣品溶液（DMSO溶解的發(fā)酵液乙酸乙酯提取物， 1g/L ）、DPPH ? 溶液及無(wú)水乙醇，混勻， 25°C 室溫反應(yīng) 30min 后，以1g/L 維生素C為陽(yáng)性對(duì)照置全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中517nm 處測(cè)量其吸光度，反應(yīng)液組成見(jiàn)表2。

每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)孔，并做3次重復(fù)試驗(yàn)，取其平均值。樣品對(duì)DPPH ? 的清除率根據(jù)以下公式計(jì)算：

清除率 。

式中： D_### 為加樣品溶液反應(yīng)體系的吸光度；D_#H#H## 為加樣品溶液不反應(yīng)體系的吸光度; D_BH?H?X?HH 為不加樣品溶液反應(yīng)體系的吸光度; D_∵□ed? 為無(wú)水乙醇的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1油莎豆內(nèi)生真菌的分離

由圖1可知，從油莎豆中共分離出16株內(nèi)生真菌，分離數(shù)量較少。油莎豆表面殺菌采用的是毒性較弱的次氯酸鈉溶液，殺菌時(shí)間較長(zhǎng)可能會(huì)殺死部分內(nèi)生真菌，其次采用普通培養(yǎng)基分離，目前的技術(shù)很難模擬出植物體本身，不能完全分離出油莎豆中所有內(nèi)生真菌。

2.2油莎豆內(nèi)生真菌的鑒定

由表3可知，通過(guò)對(duì)分離得到的16株油莎豆內(nèi)生真菌測(cè)序，將測(cè)序得到的堿基序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。10株分別鑒定為鐮刀菌屬、鐮刀菌屬、鐮刀菌屬、鐮刀菌屬、鐮刀菌屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、曲霉屬、曲霉屬和籃狀菌屬；6株分別鑒定為腐皮鐮孢、尖孢鐮刀菌、云芝栓孔菌（變色栓菌）、奧朗蒂亞庫(kù)斯塔拉諾菌、尖孢鐮刀菌和新月彎孢霉。利用MEGA6.1序列分析軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2）。

2.3油莎豆內(nèi)生促生真菌篩選

2.3.1產(chǎn)IAA能力菌株篩選Salkowski比色法是通過(guò)氧化反應(yīng)顯色定性分析和比色反應(yīng)定量分析菌株產(chǎn)IAA的能力。由圖3可知，定性結(jié)果為粉色的深淺代表其產(chǎn)IAA能力的強(qiáng)弱，篩選出3株內(nèi)生真菌具有產(chǎn)IAA功能，分別為菌株YSD-C5、YSD-P2、YSD-P5，結(jié)果表明其具有不同強(qiáng)度的產(chǎn)IAA能力。由表4可知，菌株YSD-P5產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)，達(dá)39.10mg/L ，菌株YSD-P2產(chǎn)IAA 能力其次，達(dá)7.09mg/L ，菌株YSD－C5產(chǎn)IAA 能力最差，為5.83mg/L ，與定性結(jié)果一致。

2.3.2溶磷能力菌株篩選由圖4可知，篩選出6株內(nèi)生真菌具有溶解有機(jī)磷功能，其具有明顯的溶磷透明圈，分別為YSD-P10（1.48）、YSD-P9、YSD-P8、YSD-P5、YSD-P4、YSD-C5。由圖5可

知，篩選出3株內(nèi)生真菌具有溶解無(wú)機(jī)磷功能，有明顯的溶磷透明圈，分別為YSD-P8、YSD-P10、YSD-P9。通過(guò)比較溶磷圈的大小初步判斷其溶磷能力強(qiáng)弱（表5）可知，菌株YSD-P8溶解有機(jī)磷的能力最強(qiáng)，菌株YSD-C5溶解有機(jī)磷的能力最弱；菌株YSD-P8溶解無(wú)機(jī)磷的能力最強(qiáng)，溶解有機(jī)磷的能力也最強(qiáng)。結(jié)果表明，菌株YSD-P8是較強(qiáng)的溶磷內(nèi)生真菌。

2.3.3解鉀能力菌株篩選由圖6可知，菌株YSD-P9和YSD-P10在解鉀培養(yǎng)基上能產(chǎn)生透明圈，表明其具有解鉀能力。通過(guò)比較透明圈的大小，初步判斷其解鉀效能，結(jié)果表明菌株YSD-P9解鉀能力（ r=25.0mm ） gt; 菌株YSD-P1O 解鉀能力 r=20.5mm ）。

2.3.4產(chǎn)鐵載體能力菌株篩選由圖7可知，菌株YSD-P4、YSD-P5、YSD-P8、YSD-P9 和YSD-P10在CAS培養(yǎng)基上產(chǎn)生了橙黃色圈，表明其具有產(chǎn)鐵載體功能。

2.3.5 固氮能力菌株篩選由圖8可知，菌株YSD-P4、YSD-P5、YSD-P8、YSD -P9、YSD-P10、YSD-C5、YSD-C6在無(wú)氮培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)3次均能生長(zhǎng)，表明這7株內(nèi)生真菌具有固氮功能，但其生長(zhǎng)狀況較差，說(shuō)明固氮能力較弱。

2.4油莎豆內(nèi)生真菌代謝物的降糖活性和抗氧化性

2.4.1油莎豆內(nèi)生真菌代謝物的降糖活性16 株油莎豆內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物的 α- 葡萄糖昔酶抑制活性初篩結(jié)果（圖9）表明，它們均具有不同程度的 α- 葡萄糖苷酶抑制活性。菌株YSD-P3和YSD-P4的發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì) α- 葡萄糖苷酶活性抑制率達(dá)到 80% 以上。進(jìn)一步測(cè)定其半數(shù)抑制率（ IC₅₀ ），結(jié)果表明，菌株YSD-P3和YSD-P4半數(shù)抑制率分別為 862.4，745.8mg/L ，活性弱于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖（ IC₅₀=458.1mg/L 。

2.4.2油莎豆內(nèi)生真菌代謝物的抗氧化性16株油莎豆內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物的抗氧化活性初篩結(jié)果（圖10）表明，它們均具有不同程度的抗氧化活性。菌株 YSD-P3、YSD-P6、YSD-C1 YSD-C2對(duì)DPPH ? 的清除率超過(guò) 80% ，顯示了較強(qiáng)的抗氧化活性。進(jìn)一步測(cè)定其半數(shù)清除率（ IC₅₀ ），結(jié)果表明，菌株 YSD-P3，YSD-P6，YSD- C1和YSD-C2的半數(shù)清除率分別為 737.8、770.7 、665.8，642.7mg/L ，活性弱于陽(yáng)性對(duì)照維生素C1 IC₅₀=152.2mg/L? 。

3討論

本研究分離出16株油莎豆內(nèi)生真菌，Oyedara等從油莎豆中分離得到釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）和熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）[16]本研究結(jié)果與之不同。這是因?yàn)檠芯康钠贩N不同，存在較大的地域差距，且其殺菌條件強(qiáng)度較高，所以?xún)?nèi)生真菌的分離數(shù)量和種類(lèi)會(huì)存在較大差異。

IAA是通過(guò)促進(jìn)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，以起到促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的植物激素。北柴胡色氨酸途徑產(chǎn)IAA的量最高為 76.16mg/L ，杜仲內(nèi)生真菌產(chǎn)IAA的量最高為 38mg/L ，刺葉高山櫟內(nèi)生真菌色氨酸途徑產(chǎn)IAA 的量最高為12.67 mg/L[26-28]本研究篩選的內(nèi)生真菌色氨酸途徑產(chǎn)IAA的量最高達(dá) 39.10mg/L ，處于相對(duì)較高的水平。

溶磷菌株通過(guò)溶解土壤中的難溶性或不溶性磷，從而改善土壤中的磷營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。彭靚等從米槁根部?jī)?nèi)生真菌中篩選出16株溶解無(wú)機(jī)磷菌株[9]，朱靜等從千年桐內(nèi)生真菌中篩選出4株溶解無(wú)機(jī)磷菌株[29]，本研究篩選出6株能較好溶解有機(jī)磷的菌株和3株溶解無(wú)機(jī)磷的菌株。

解鉀菌株研究較多的為硅酸鹽細(xì)菌，通過(guò)將土壤中硅酸鹽類(lèi)轉(zhuǎn)化為速效鉀后直接利用。本研究分離的解鉀內(nèi)生真菌較少，且其能力較弱，可以通過(guò)誘變等技術(shù)手段獲得正向突變菌株，以得到具有較強(qiáng)解鉀能力的菌株。

鐵載體是可以螯合土壤中游離鐵的低分子量化合物，鐵元素對(duì)植物葉綠素的合成和有氧呼吸非常重要，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起促進(jìn)作用。劉娟娟等分離出10株具有產(chǎn)鐵載體的內(nèi)生真菌24，劉軍等從檀香中分離得到4株可產(chǎn)鐵載體的內(nèi)生真菌[30]，本研究從油莎豆中分離得到5株可產(chǎn)鐵載體的內(nèi)生真菌，分離數(shù)量相對(duì)較多。

內(nèi)生真菌的固氮作用可為宿主植物提供氮元素，促進(jìn)植物對(duì)氮的吸收利用。本研究分離得到7株固氮能力較弱的油莎豆內(nèi)生真菌，劉娟娟等從蘋(píng)果中分離出26株可在無(wú)氮培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的內(nèi)生真菌[24]，表明植物內(nèi)生真菌是固氮真菌研究開(kāi)發(fā)的重要微生物資源。

阿卡波糖作為從微生物中獲得的降糖藥，對(duì)α- 葡萄糖苷酶的抑制效果非常好，能夠延緩餐后身體吸收血糖，對(duì)糖尿病具有很好的調(diào)節(jié)作用。肖澤恩等研究發(fā)現(xiàn)，木欖內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中具有抑制 α- 葡萄糖苷酶的活性物質(zhì)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)分離的11個(gè)化合物中，化合物1被首次發(fā)現(xiàn)具有抑制 α -葡萄糖苷酶的作用[13」；周培鳳等從臭常山內(nèi)生真菌G-（JK）-2的發(fā)酵液中分離出13個(gè)化合物，其中，有2個(gè)化合物具有中等程度的 α- 葡萄糖苷酶抑制作用[31]。本研究從油莎豆中分離得到2株發(fā)酵液乙酸乙酯提取物具有較強(qiáng) α- 葡萄糖昔酶抑制作用的內(nèi)生真菌，有待進(jìn)一步分離出單體化合物，明確其抑制機(jī)理

抗氧化是指抑制自由基產(chǎn)生或減少存在的過(guò)程，自由基具有強(qiáng)氧化性，對(duì)身體具有破壞作用，損害身體健康?？寡趸饔每山档妥杂苫鶎?duì)身體的危害，從而達(dá)到預(yù)防炎癥和抗衰老的效果，可以通過(guò)食用具有清除自由基的抗氧化藥物調(diào)節(jié)機(jī)體中的自由基。本研究從油莎豆中分離得到4株發(fā)酵液乙酸乙酯提取物具有較強(qiáng)DPPH·清除率的內(nèi)生真菌。程庭峰等從麻花芃的內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)生真菌Gs-6發(fā)酵液具有3種黃酮成分，進(jìn)一步研究表明該菌株具有較強(qiáng)的抗氧化作用[32]；Monika等從天門(mén)冬根中分離得到35株內(nèi)生真菌，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中存在抗氧化活性，表明內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物是抗氧化藥物研究的重要方向[33]。

本研究首次從油莎豆篩選出具有促生活性的內(nèi)生真菌，分析了發(fā)酵液粗提物的降糖活性和抗氧化活性，豐富了油莎豆內(nèi)生真菌的研究。以上菌株可作為生物肥料開(kāi)發(fā)的材料，有待進(jìn)一步分離具有藥用活性菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物、多樣性研究及生物防治探索等，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展中具有廣闊的前景。

4結(jié)論

從油莎豆中分離出16株內(nèi)生真菌，鑒定為4屬5種。對(duì)促生能力篩選發(fā)現(xiàn)，3株具有不同程度的產(chǎn)IAA能力，6株具有溶解有機(jī)磷能力，3株具有溶解無(wú)機(jī)磷能力，2株具有解鉀能力，5株具有產(chǎn)鐵載體能力，4株具有固氮能力，其中3株具有4種促生能力，分別為菌株YSD-P5、YSD-P9、YSD-P10，表明內(nèi)生促生真菌是研究微生物菌劑的微生物資源。活性研究結(jié)果表明，有2株內(nèi)生真菌的 α- 葡萄糖苷酶抑制率大于 80% ，有4株內(nèi)生真菌的DPPH·清除率大于 80% ，表明油莎豆內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物具有抗氧化和降糖等豐富的生物活性，可進(jìn)一步研究其他活性，并對(duì)活性跟蹤下的代謝產(chǎn)物分離，為尋找新穎的活性化合物提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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