板栗GRF和GIF基因家族的全基因組鑒定和表達(dá)分析

中圖分類號：S664.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2025）07-1422-2（

摘要：【目的】生長調(diào)控因子（growth-regulating factors，GRFs）和生長調(diào)節(jié)因子互作因子（GRF-interacting factors，GIFs）在植物生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫方面發(fā)揮重要作用。作為中國重要的木本糧食樹種，板栗（Castanea mollisi-ma）在生長發(fā)育過程中受到眾多環(huán)境脅迫的影響。通過研究板栗GRF和GIF基因家族，為解析板栗GRF和GIF基因在板栗組織發(fā)育及響應(yīng)環(huán)境脅迫中的潛在功能提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎蒙镄畔W(xué)方法對板栗GRF和GIF基因家族進(jìn)行系統(tǒng)表征。利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析其在板栗不同組織不同發(fā)育階段和不同環(huán)境脅迫中的表達(dá)譜。結(jié)合RT-qPCR試驗驗證了CmGRFs和CmGIFs在板栗種仁發(fā)育過程中的表達(dá)?！窘Y(jié)果】在板栗基因組中鑒定到10個GRFs和3個GIFs成員，分布在7條染色體上。系統(tǒng)發(fā)育分析將CmGRFs分為4個分支，CmGIFs分為2個分支。同一分支的成員在基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序上高度相似。CmGRFs和CmGIFs啟動子區(qū)域豐富的順式作用元件暗示了其功能的多樣性。共線性分析表明節(jié)段重復(fù)是CmGRF和CmGIF家族擴張的主要驅(qū)動力?；赗NA-seq數(shù)據(jù)，分析了CmGRFs和CmGIFs在5種板栗組織中的不同發(fā)育時期，以及在3種非生物脅迫（干旱、冷凍、熱休克）和栗癭蜂（Drycosmusk kuriphilus）侵染下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，CmGRFs和CmGIFs可能參與板栗種仁和芽的發(fā)育，并與胚珠的育性有關(guān)。CmGRFs和CmGIFs的表達(dá)水平對溫度脅迫和栗癭蜂侵染有顯著響應(yīng)，另外，CmGRFs幾乎不受干旱脅迫的影響。【結(jié)論】研究結(jié)果為進(jìn)一步研究CmGRFs和CmGIFs的功能以及在板栗生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫中的潛在作用提供了參考。

Genome-wide identification and expression analysis of growth-regulating factor （GRF） and GRF-interacting factor （GIF） gene families in Castanea mollissima

WANG Xiangyu'， TIAN Yujuan2，3#，LI Yun4， WANG Dongsheng3，WANG Xuan3， GUO Chunlei2，LIU Jing'， ZHANG Hai' e³ ， ZHANG Jingzheng2，YU Liyang

（TheOffcofetfichebealesitfenedoiagHeb fHorticultualedbilesitfoidbe gineringeettstadbe terforRuralViliztionebeialUesityfiencendologyiangdao6ebina

Abstract： 【Objective】Growth-regulating factors （GRFs） and GRF -interacting factors （GIFs） play important roles in plant growth，development， and response to environmental stresses.As an important woody food resource in East Asia， Chinese chestnut （Castanea mollissima） is affected by numerous en

GRF and GIF gene families were studied to provide a theoretical basis for analyzing the potential functions of GRF and GIF genes in Chinese chestnut development and response to environmental stresses. 【Methods】 The GRF and GIF gene families in Chinese chestnut were systematically characterized using bioinformatics methods， including physicochemical properties，phylogenetic relationships，gene structure，conserved motifs，collinear and evolutionary relationships，chromosome distribution，duplication types，promoter cis-elements，and interactions with transcription factors. The expresson profiles of CmGRFs and CmGIFs in five Chinese chestnut organs （seed kernel， female flowers，male flowers， ovules，and buds），as well as under three abiotic stresses （drought， freezing， heat shock） and infection by Drycomusk kuriphilus were analyzed using RNA-seq data in NCBI database. The expression of CmGRFs and CmGIFs during Chinese chestnut kernel development was validated through RT-qPCR experiments.【Results】A total of 10 CmGRFs and 3 CmGIFs members were identified in the Chinese chestnut genome through bioinformatics methods，and they were shown to be distributed on seven chromosomes.Analysis of the physicochemical properties of these CmGRFs proteins revealed that their lengths ranged from 236 to 602 amino acids， with an aliphatic index ranging from 45.51 to 68.71. The instability indexes of CmGRFs were all above 40，and the grand averages of hydropathicity indices were all less than zero，indicating that allthe CmGRFs belonged to unstable hydrophilic proteins.The isoelectric points of CmGRFs were between 7.74 and 9.41， indicating that the CmGRFs were all alkaline proteins.Subcellular localization prediction showed that 10 CmGRFs were located in the nucleus. Similarly， CmGIFs were shown to be located on three chromosomes in the nucleus and considered to be unstable hydrophilic acidic proteins.Phylogenetic analysis divided the CmGRFs into four branches，and CmGIFs into three branches.Each CmGRF contained 2 to 9 conserved motifs and 2 to 5 introns.All three CmGIFs contain only one conserved motif， three introns，and four exons.Members of CmGRFs located in the same branch had similar gene structures and protein conserved motifs.A total of 270 and 86 cis-acting elements were identified in the promoter regions of CmGRFs and CmGIFs，respectively， mainly related to light response， environmental stresses， growth and development， and plant hormones. The collinear analysis within the Chinese chestnut genome indicated that segmental duplication was the main driving force for the expansion of the CmGRF and CmGIF gene families.The collinear analysis between Chinese chestnut and five other representative species （Arabidopsis thaliana， Quercus， Vitis vinifera，Oryza sativa，and Zea mays） suggested that the GRF and GIF families might have undergone independent duplication events after the differentiation between dicotyledonous and monocotyledonous plants.Transcriptome data analysis showed that CmGRF3 and CmGIF2 were consistently highly expressed in female flowers，while almost not in male flowers （FPKM ^lt;1 ）. Additionally， CmGRF3 and CmGIF2 exhibited extremely similar expression patterns，suggesting that they may work together and may be involved in the differentiation or development of male and female Chinese chestnut flowers. During the development of Chinese chestnut kernels in Yanshanzaofeng and Yanlong， the expression levels of CmGRF1 and CmGRF3 significantly changed，and CmGIF3 continued to be highly expressed， suggesting that they may be related to the development of Chinese chestnut kernels.The rapid changes in the expression levels of CmGRF2，CmGRF3，and CmGIF3 during freezing and heat shock stresses suggest that they may be involved in the response of Chinese chestnuts to these temperature stresses. Under drought stress， CmGRFs in Yanshanzaofeng and Dabanhong were almost not expressed， indicating that they may not be related to the response of Chinese chestnuts to drought stress. The infection of Drycosmusk kuriphilus significantly induced the expression of CmGRF2， CmGRF3， CmGRF7，and Cm

GIF1，indicating that they may be related to the response of Chinese chestnuts to D kuriphilus infection.Furthermore， the expression levels ofall CmGRFs and CmGIFs in Chinese chestnut kernels at 60， 70， 80， 90，and 100 days after flowering were validated by RT-qPCR experiments，and the results were consistent with RNA-seq data.In addition， the transcription factor families predicted to have the most interaction with the promoter regions of CmGRFs and CmGIFs includedB，of，H，2H2， TCP， indicating that they may play an important role in regulating the expression of CmGRFs and Cm 1 GIFs.【Conclusion】A total of 10 CmGRFs and 3 CmGIFs were identified and systematically analyzed in the Chinese chestnut genome. Some CmGRFs and CmGIFs showed significant changes in expression levels during diferent developmental stages offive Chinesechestnutorgans （seed kernel，female flowers，male flowers，ovules，buds），as wellas under three abiotic stresses （freezing，heat shock）and infection by D .kuriphilus.RT-qPCR was used to validate the expression levels of CmGRFs and CmGIFs at five developmental stages of Chinese chestnut kernels.This study provides a reference for further investigating the functions of CmGRFs and CmGIFs ，and their potential rolesin Chinese chestnut growth， development， and response to environmental stress.

Key Words： Castanea mollissima; Growth-regulating factors （GRFs）; GRF-interacting factors （GIFs）; Growth and development; Environmental stress; Gene expression

板栗（Castaneamollissima）是殼斗科（Fagace-ae）栗屬（Castanea）樹種，是中國重要的木本糧食樹種，也是中國五大優(yōu)勢經(jīng)濟(jì)林樹種之一。板栗在東亞地區(qū)廣泛分布，并已成為北半球重要的食物來源，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值[2]。板栗堅果不僅營養(yǎng)豐富，而且具有獨特的風(fēng)味和藥用價值3。板栗生長發(fā)育過程中需要應(yīng)對各種環(huán)境脅迫，如極端溫度、干旱、鹽脅迫以及病蟲害4。開展板栗發(fā)育和環(huán)境脅迫相關(guān)基因家族的鑒定和全面表征對使用分子手段進(jìn)行優(yōu)質(zhì)抗逆板栗新品種培育具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，可以結(jié)合到DNA的特定序列上，通過與RNA聚合酶或其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄速率。在植物中，轉(zhuǎn)錄因子扮演著關(guān)鍵的調(diào)控角色，其功能涵蓋了植物生長發(fā)育的各個方面，包括對外界逆境脅迫的響應(yīng)。大量轉(zhuǎn)錄因子，如WRKY、MYBNACbHLH[和bZIP[]，在植物生長發(fā)育及應(yīng)對環(huán)境脅迫中的關(guān)鍵作用已經(jīng)被廣泛證實和報道。

生長調(diào)控因子（growth-regulatingfactors，GRFs）作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子基因家族，在植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[12]。GRF蛋白的N端區(qū)域包含兩個保守的基序，Gln-X3-Leu-X2-Gln（QLQ）和 Trp-Arg-Cys（WRC）[13]。 QLQ 對GRF和其他蛋白的相互作用至關(guān)重要，WRC含有核定位信號和DNA結(jié)合基序[1415]。此外，有些GRF轉(zhuǎn)錄因子的C端區(qū)域還含有TQL、GGPL和FFD共3個保守結(jié)構(gòu)域[15-17]。GRF轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛存在于各種植物中，并且可能在不同植物種類之間具有一定的功能差異性，這為進(jìn)一步研究其在植物生物學(xué)中的功能提供了重要線索[18-19]。自從水稻（Oryza sati-va）OsGRF1作為第一個成員被鑒定出在赤霉素（gibberellicacid，GA）誘導(dǎo)的莖伸長中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)大量GRFs參與植物的生長發(fā)育調(diào)控[20-21]。AtGRF4是擬南芥（Arabidop-sisthaliana）葉細(xì)胞增殖、子葉胚胎發(fā)育和莖尖分生組織發(fā)育所必需的[22]。AtGRF7可以抑制滲透脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來防止植物在脅迫條件下的生長受影響[。OsGRF6通過生長素（auxin，IAA）途徑調(diào)控花序構(gòu)型，通過GA途徑調(diào)控水稻植株高度[23-24]。生長調(diào)節(jié)因子互作因子（GRF-interactingfactors，GIFs）是GRF的轉(zhuǎn)錄共激活因子，其在植物發(fā)育中起重要作用，特別是在增強GRF蛋白的活性方面[25]。GIF蛋白屬于SSXT基因超家族，發(fā)揮植物轉(zhuǎn)錄共激活因子的作用[2]。GIF蛋白包含一個SNH（SYTN末端同源性）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與GRF的QLQ結(jié)構(gòu)域的相互作用形成功能性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。在這類復(fù)合物中，GIF將SWI/SNF（Switchde-fective/sucrosenon-fermentable）染色質(zhì)重塑復(fù)合物招募到其靶基因，通過被GRF轉(zhuǎn)錄激活或抑制來調(diào)控植物的生長發(fā)育和再生效率[27-28]。GRFs和GIFs轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫中協(xié)同發(fā)揮作用已經(jīng)被廣泛報道[29-30]。小麥中的GRF4和GIF1蛋白結(jié)合生成嵌合體可以顯著提高小麥和水稻的再生效率[31]。在柑橘（Citrusreticulata）和草莓（Fragariaananassa）中的研究表明，不同組合的GRF-GIF嵌合物均能在不同程度上提高愈傷組織的芽再生效率，顯著增強再生能力[3。與野生型相比，ZmGRF11-ZmGIF2和ZmGRF2-ZmGIF3的過表達(dá)加速了玉米（Zeamays）花序莖的生長[32]。橡膠（Heveabrasiliensis）中過表達(dá)HbGRF4-GIF1后可以顯著提高細(xì)胞的再生效率[33]。西瓜（Citrulluslana-tus）CIGRF4-GIF1還被用于構(gòu)建高效再生體系，并與CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合實現(xiàn)了基因編輯[34]。然而，GRF和GIF基因家族作為調(diào)控植物生長發(fā)育和環(huán)境脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，尚未在板栗基因組中被鑒定，其生物學(xué)功能和作用機制也尚未被報道。

筆者在本研究中通過分析板栗的基因組，成功鑒定了GRF和GIF基因家族成員，并進(jìn)行系統(tǒng)分析，包括系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序、共線性和進(jìn)化關(guān)系、染色體分布、復(fù)制類型，預(yù)測其啟動子順式元件以及與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。此外，還結(jié)合RNA-Seq數(shù)據(jù)和RT-qPCR實驗，分析這些基因在不同組織的不同發(fā)育階段中的表達(dá)模式，以及對冷凍、熱休克、干旱脅迫和栗癭蜂（Drycosmusk ku-riphilus）侵染的響應(yīng)，以期為進(jìn)一步研究CmGRF和CmGIF的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 板栗GRFs和GIFs成員鑒定

從栗屬基因組數(shù)據(jù)庫（CastaneaGenomeDatabase：http：//castaneadb.net/#/）下載板栗基因組數(shù)據(jù)，包括基因組文件（核苷酸序列）、蛋白質(zhì)文件（氨基酸序列）、基因結(jié)構(gòu)注釋文件（GeneralFeatureFormatVersion3，GFF3file）。從Pfam數(shù)據(jù)庫中下載QLQ（PF08880）、WRC（PF08879）和SNH（PF05030）的隱馬爾可夫模型（HiddenMarkovModel，HMM）。利用HMMER3.0軟件對板栗蛋白文件進(jìn)行搜索，同時含有QLQ和WRC結(jié)構(gòu)域的蛋白序列被認(rèn)為是GRF蛋白的候選成員，含有SNH結(jié)構(gòu)域的蛋白序列被認(rèn)為是GIF蛋白的候選成員。此外，利用已報道的擬南芥中的GRFs和GIFs的蛋白序列作為參考序列對板栗所有蛋白序列進(jìn)行blast檢索[3s]。以上結(jié)果全部上傳至NCBI-CDD進(jìn)一步篩選，以確保GRF成員均含有QLQ和WRC兩個結(jié)構(gòu)域，GIF成員含有SNH結(jié)構(gòu)域?；谧罱K確定的CmGRFs和 CmGIFs 在染色體上的相對位置被分別命名為CmGRF1＼～CmGRF10和CmGIF1＼～CmGIF3。CmGRFs和CmGIFs蛋白序列上傳至Expasy（https：//www.expasy.org/）獲取CmGRFs和CmGIFs蛋白的理化性質(zhì)數(shù)據(jù)。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

擬南芥GRFs和GIFs蛋白序列下載自TAIR網(wǎng)站（http：//www.arabidopsis.org）。水稻GRFs和GIFs蛋白序列下載自MSU-RGAP網(wǎng)站（http：//rice.uga.edu/index.shtml）。其他物種的蛋白序列來自Phytozome v13（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）。利用MEGA7.0軟件分別對GRFs和GIFs蛋白序列進(jìn)行多序列比對，采用最大似然法來構(gòu)建GRFs和GIFs的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域

CmGRFs和CmGIFs的蛋白序列被上傳至NC-BI-CDD以獲取含有保守結(jié)構(gòu)域的hitdata文件。CmGRFs和CmGIFs的蛋白序列被上傳至MEME（https：//meme-suite.org/meme/）以獲取保守基序信息。CmGRFs和 CmGIFs 的基因結(jié)構(gòu)信息（外顯子-內(nèi)含子）來源于板栗基因組的結(jié)構(gòu)注釋文件（GeneralFeatureFormatVersion3，GFF3file）。

1.4 啟動子順式作用原件

提取CmGRFs和CmGIFs基因起始密碼子上游2000bp的序列，并利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測其中的順式作用元件，對結(jié)果進(jìn)行匯總整理，以確定順式作用元件的種類、數(shù)量及位置，并利用TB-tools軟件進(jìn)行可視化分析[3。

1.5染色體分布和共線性

CmGRFs和CmGIFs的染色體分布信息從板栗基因組的結(jié)構(gòu)注釋文件（GFF3file）獲取，之后利用TBtools進(jìn)行可視化分析。使用MultipleCollineari-tyScantoolkit（MCScanX）來分析板栗基因組內(nèi)部的共線性，以及板栗基因組與擬南芥、櫟樹（Quercusrobur）、葡萄（Vitisvinifera）、水稻和玉米的共線性，并且通過板栗基因組內(nèi)部的共線性分析獲取CmGRFs和CmGIFs的復(fù)制類型[7]。

1.6 表達(dá)譜分析和熱圖繪制

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）

中收集了公開可用的5種板栗組織的不同發(fā)育時期，以及在3種非生物脅迫（干旱、冷凍、熱休克）和栗癭蜂（Drycosmuskkuriphilus）侵染下的RNA-seq數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)來源于9個項目，項目號分別為：PRJNA512447、PRJNA731244、PRJNA791965、PRJ-NA818064、PRJNA862256、PRJNA883560、PRJ-NA885276、PRJNA957852、PRJNA1166987[4，38- 41]。使用Sratoolkit3.0將RNA-seq文件從SRA格式轉(zhuǎn)換為Fastq格式[42]。使用 Tophat2將這些Fastq文件映射到參考基因組以確定表達(dá)模式，參考基因組為來自Castanea基因組數(shù)據(jù)庫（http：//castaneadb.net/#/）的N11- 1^[43] 。使用TBtools 中的\"scale method\"對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，并基于對數(shù)轉(zhuǎn)換[log（FP-KM+1）]值生成表示基因表達(dá)水平的熱圖[。

1.7 CmGRFs和 CmGIFs 與轉(zhuǎn)錄因子互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

使用Plant Transcriptional RegulatoryMap（https：//plantregmap.gao-lab.org/）對可能作用于 CmGRFs 和CmGIFs上游 2000bp 區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測，并使用Cytoscape（v3.9.1）軟件可視化分析轉(zhuǎn)錄因子與 CmGRFs 和 CmGIFs 的相互作用。

1.8RT-qPCR分析

RT-qPCR試驗材料采自河北科技師范學(xué)院板栗種植基地 （N40^°06^′，E119^°22^′） 長勢一致、生長健壯的5年生燕山早豐板栗，砧木為燕紫。分別在花后60、70、80、90和100d采集燕山早豐板栗的堅果，每個時間點采集堅果后，立即用枝剪和手術(shù)刀去除刺苞和種皮，確保去除過程中種仁未受損傷。之后迅速將樣品放入已經(jīng)標(biāo)記的 50mL 離心管中，并迅速置于液氮中直至無氣泡產(chǎn)生，確保樣品已被完全冷凍。最后將樣品存儲于 -80^°C 超低溫冰箱中，用于后續(xù)對 CmGRFs 和 CmGIFs 的RT-qPCR實驗。使用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441，天根生化科技北京有限公司，北京）提取板栗種仁總RNA。使用PrimeScript第一鏈cDNA合成試劑盒（TaKaRa，日本）反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。根據(jù)CmGRFs和 CmGIFs 的基因序列，使用PrimerPremier5設(shè)計特異引物，以18S為內(nèi)參基因（表1）。使用TBGreenPremixExTaq（TaKaRa）試劑盒在ABI7500qRT-PCR（AppliedBiosystems，USA）上進(jìn)行qRT-PCR實驗。采用 2^-ΔΔcT 方法計算CmGRFs和CmGIFs的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CmGRFs和CmGIFs的鑒定和理化性質(zhì)

在板栗基因組中共鑒定到10個GRFs基因，10個CmGRFs基因不均勻地分布在5、8、9、10、11和12號染色體上。CmGRFs基因編碼236個到602個氨基酸，分子質(zhì)量介于 25.78～64.97ku 。CmGRFs蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均在40以上，并且親水性指數(shù)均小于0，表明CmGRFs屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白。CmGRFs的等電點在7.74（CmGRF8）到9.41（CmGRF10）之間，表明CmGRFs均為堿性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，10個CmGRFs蛋白均定位于細(xì)胞核（表2）。3個 CmGRFs 基因分別位于4、5和10條染色體上。在板栗基因組中共鑒定到3個GIFs基因。CmGIFs蛋白的長度和分子質(zhì)量分別介于216到223個氨基酸， 23.44～24.55ku 。CmGIFs蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)和親水性指數(shù)分別介于 60.84～80.47 和 |-1.159～-0.647 ，這說明CmGIFs是不穩(wěn)定的親水性蛋白。CmGIF2和CmGIF3蛋白等電點為5.93，CmGIF1蛋白的等電點為6.1，這表明CmGIFs是酸性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，3個CmGIFs蛋白定位于細(xì)胞核（表2）。

2.2 CmGRFs和CmGIFs的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于系統(tǒng)發(fā)育樹，來自板栗（10）、擬南芥（9）、水稻（12）、毛果楊（Populustrichocarpa）（19）和葡萄（8）的共58個GRF蛋白被分為4個分支（Group1＼～Group4）（圖1-A）。在Group3（CmGRF2、CmGRF6、CmGRF7）和Group4（CmGRF3、CmGRF8、CmGRF9）中分別有3個CmGRFs蛋白。Group1（CmGRF4和CmGRF5）和Group2（CmGRF1和CmGRF10）分支分別包括2個CmGRF成員。Group1僅包含雙子葉植物的GRF成員，其余3個分支均包含雙子葉和單子葉植物的GRF蛋白，表明GRF蛋白可能在雙子葉和單子葉植物分化后形成了新的進(jìn)化分支。

基于系統(tǒng)發(fā)育樹，來自板栗（3）、擬南芥（3）、番茄（Solanumlycopersicum）（4）、馬鈴薯（Solanumtu-berosum）（4）、毛果楊（4）、美洲黑楊（Populusdeltoi-des）（6）、紅皮柳（Salix sinopurpurea）（4）、大豆（Gly-cinemax）（8）、水稻（3）和玉米（3）的共42個GIF蛋白被分為3個分支，I分支含有2個CmGIF成員（CmGIF1和CmGIF3），II分支僅含有CmGIF2。I分支中只含有擬南芥（AtGIF2和AtGIF3）、美洲黑楊（PdGIF2和PdGIF3）和大豆（GmGIF4），沒有CmGIF成員（圖1-B）。

2.3CmGRFs和 CmGIFs 的基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的保守基序

每個CmGRF包含2～9個蛋白保守基序，并且位于同一分支中的CmGRF成員具有相似的基序組成（圖2-A）。例如，一些基序則僅分布在特定亞家族中，如基序10僅存在于Group4分支的CmGRFs成員?；?、7、8、9僅存在于Group1分支。此外，所有CmGRFs都包含基序1和基序2（圖2-A）?？傮w來說，基序組成特征支持 CmGRFs 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。3個CmGIF蛋白均只包含一個基序（圖2-C）。

與基序組成類似，同一分支中的 CmGRFs 成員具有相似的基因結(jié)構(gòu)（圖2-B）。CmGRFs基因結(jié)構(gòu)顯示，板栗GRF家族成員基因包含2～5個內(nèi)含子，相應(yīng)的包含3＼～6個外顯子。CmGRF6含有6個外顯子，CmGRF10含有3個外顯子，其他 CmGRF 成員均含有4個外顯子，同一分支中的外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量幾乎相同。此外，3個CmGIFs均只含有3個內(nèi)含子和4個外顯子（圖2-D）。

2.4CmGRFs和 CmGIFs 的順式作用元件及互作轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

啟動子區(qū)域中的順式作用元件對基因的轉(zhuǎn)錄和功能表達(dá)至關(guān)重要[44]。分析所有CmGRFs和Cm-GIFs起始密碼子上游2000bp的序列，以研究其順式作用元件。CmGRFs啟動子區(qū)域中鑒定到的順式作用元件主要分為4類：與光響應(yīng)有關(guān)，與環(huán)境脅迫有關(guān)，與發(fā)育有關(guān)，與植物激素有關(guān)（圖3-A）。光響應(yīng)元件主要包括Box-4、G-Box、GT1-motif、TCT-motif、MRE、AE-box。鑒定到大量與生長發(fā)育密切相關(guān)的激素相關(guān)的作用元件，如ABRE與脫落酸有關(guān)；AuxRR-core響應(yīng)生長素;CGTCA-motif和TGACG-motif參與MeJA反應(yīng);GARE-motif、P-box和TATC-box與赤霉素反應(yīng)有關(guān)；TCA-element和TGA-ele-ment分別為水楊酸響應(yīng)元件、生長素反應(yīng)元件。此外，一些參與防御和應(yīng)激反應(yīng)元件，如ARE（與抗氧反應(yīng)有關(guān)）、LTR（與冷脅迫有關(guān)）、MBS（與干旱有關(guān)）、MBSI（與類黃酮形成有關(guān)）也大量存在于CmGRFs的啟動子區(qū)域中。其中CmGRF1啟動子區(qū)域中存在最多的順式作用元件，而CmGRF8啟動子區(qū)域含有最少的順式作用元件。這些結(jié)果表明CmGRFs在板栗生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫方面發(fā)揮重要作用，這與后續(xù)RNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。類似的，也預(yù)測CmGIFs的啟動子區(qū)域的順式作用元件（圖3-B）。CmGIFs的順式作用元件也主要分為4類，分別是與光響應(yīng)有關(guān)，與環(huán)境脅迫有關(guān)，與發(fā)育有關(guān)，與植物激素有關(guān)。在 CmGRFs 和CmGIFs的啟動子區(qū)域中鑒定到相似種類的順式作用元件，表明其可能與相似的順式作用元件存在相互作用。

對可能作用于CmGRFs和CmGIFs上游2000 bp區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測（圖4），共有126個轉(zhuǎn)錄因子可能作用于CmGRFs，屬于34個轉(zhuǎn)錄因子家族（圖4-A）。在這些轉(zhuǎn)錄因子家族中，數(shù)量最多的家族是MYB（19），隨后是NAC（11），C2H2（10），Dof（9）和ERF（9）；數(shù)量最少的家族只有1個成員，如ARF、GRAS、HD-ZIP、SRS、Trihelix和WOX。此外，CmGRF1啟動子區(qū)域可以被37個轉(zhuǎn)錄因子識別，其次是CmGRF7（35）、CmGRF6（30）和CmGRF9（29）。類似的，共預(yù)測到有199個轉(zhuǎn)錄因子可能作用于 CmGIFs ，屬于22個轉(zhuǎn)錄因子家族（圖4-B）。數(shù)量最多的家族是MYB（9），其次是Dof/bHLH（9）和C2H2（7）；數(shù)量最少的家族只有一個成員，如GRAS、HD-ZIP、NAC、WRKY和bZIP。預(yù)測到CmGIF1和CmGIF2與28個轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用，而14個轉(zhuǎn)錄因子可以作用于CmGIF3?？傮w而言，作用于CmGRFs和CmGIFs最多的5個基因家族分別是MYB、Dof、bHLH、C2H2和TCP，表明其可能在調(diào)節(jié)CmGRFs和CmGIFs的表達(dá)中發(fā)揮重要作用。

2.5 CmGRFs和 CmGIFs 的染色體分布和共線性分析

可視化分析CmGRFs和CmGIFs在染色體中的分布（圖5-A）， CmGRFs 位于6條染色體上，其中Chr10含有最多的CmGRFs（CmGRF4、CmGRF5、CmGRF6、CmGRF7和CmGRF8），另外5個CmGRFs分別位于Chr5（CmGRF1）、Chr8（CmGRF2）、Chr9（CmGRF3）、Chr11（CmGRF9）和Chr12（CmGRF10）上。3個 CmGIFs 均勻分布在3條染色體上，Cm-GIF1位于Chr10，CmGIF2位于 Chr4 ，CmGIF3位于Chr5上（圖5-A）。這些結(jié)果表明 CmGRFs 和Cm-GIFs分布在板栗的不同染色體上，并且分布在每條染色體上的基因數(shù)量不同。

板栗基因組內(nèi)的共線性分析發(fā)現(xiàn)兩個CmGRF基因?qū)Γ–mGRF2/CmGRF6、CmGRF1/CmGRF10）分別在 Chr8/Chr10 和Chr5/Chr12上形成兩個節(jié)段重復(fù)。1個CmGIF基因?qū)Γ–mGIF1/CmGIF3）在Chr5和Chr10上形成一個節(jié)段重復(fù)（圖5-B）。將板栗基因組與代表性雙子葉植物（擬南芥、葡萄）、單子葉植物（水稻、玉米）以及同科植物（櫟樹）成員之間的共線性關(guān)系進(jìn)行分析（圖5-C）。對于 CmGRFs ，板栗與5個物種（擬南芥、櫟樹、葡萄、水稻、玉米）之間的基因?qū)?shù)量分別為8、4、9、5和1，這表明CmGRFs與葡萄和擬南芥的親緣關(guān)系更為密切。板栗與本研究中的雙子葉植物之間具有更多的共線同源基因?qū)?，這表明 CmGRFs 可能在雙子葉植物中發(fā)生過額外的復(fù)制事件。此外，一些 CmGRFs 與其他物種的基因形成兩個直系同源基因?qū)Γ?CmGRF2 與擬南芥中的AT2G36400、AT3G52910，以及水稻中的 Os03g5I970 和 Os03g47140 。這些結(jié)果表明，在進(jìn)化過程中CmGRF2在擬南芥和水稻中的直系同源基因保留有更多的拷貝數(shù)。對于 CmGIFs ，板栗與擬南芥、櫟樹和葡萄之間的基因?qū)?shù)量分別為2、2、6，與水稻和玉米之間無共線基因?qū)?。這一結(jié)果可能表明，在雙子葉植物與單子葉植物分化后， GIF 基因家族可能經(jīng)歷了獨立的復(fù)制事件。

2.6 CmGRFs和 CmGIFs 在板栗不同組織中的表達(dá)

分析CmGRFs和 CmGIFs 在不同組織中的表達(dá)譜，包括胚珠（可育胚珠和敗育胚珠的3個發(fā)育時期）、雄花（一次花和二次花）、雌花（一次花和二次花）、種仁（兩個品種的5個發(fā)育時期）、芽（3個發(fā)育時期）（圖6。CmGRF1在可育胚珠中的表達(dá)水平顯著高于敗育胚珠，表明其可能與胚珠的育性有關(guān)（圖6-A）[40]。CmGRF3在雌花中持續(xù)高表達(dá)（FP-KMgt;20 ，而在雄花中幾乎不表達(dá)（FPKM lt;1 圖6-B），暗示了 CmGRF3 可能與雌雄花分化或發(fā)育有關(guān)[45]。這表明其可能與板栗種仁發(fā)育關(guān)系密切[41]。

A.CmGRFs和CmGIFs在可育（Fertile）胚珠和敗育（abortive）胚珠3個發(fā)育階段的表達(dá)（7月15日、7月20日和7月25日）;B.CmGRFs和CmGIFs在雄花和雌花中的表達(dá)（FFF：雌花一次花，SFF：雌花二次花，F(xiàn)FM：雄花一次花，SFM：雄花二次花）;C.CmGRFs和CmGIFs 在燕山早豐（YSZF）和燕龍（YL）板栗種仁5個發(fā)育階段的表達(dá)（花后60、70、80、90、100d）;D.CmGRFs和CmGIFs在芽（Buds）3個發(fā)育階段的表達(dá)（花后 20、25、30d） 。

有趣的是，CmGRF2在花芽發(fā)育的早期階段（花后20d表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平（ FPKMgt;60） ，然后在花芽發(fā)育的后期階段（花后 30d） 顯著下調(diào)（FP-KMlt;10） （圖6-D）?？傮w而言， CmGRFs 在板栗的不同組織或同一組織的不同發(fā)育階段中表現(xiàn)出不同的表達(dá)水平。類似的， CmGIF2 在可育胚珠中的表達(dá)顯著高于敗育胚珠（圖6-A）[40]， CmGIF3 在板栗的雌花和雄花中持續(xù)高表達(dá)（圖6-B）[45]。CmGIF3在燕山早豐和燕龍種仁的5個發(fā)育時期中持續(xù)高表達(dá)，而CmGIF1在種仁中表達(dá)水平較低（FPKM lt;5 ）（圖6-C），這暗示了在板栗種仁發(fā)育中的功能差異[4]。CmGIF3在花發(fā)育的早期階段（花后20d）到中期階段（花后25d）的表達(dá)水平逐漸升高，然后在花芽發(fā)育的后期階段（花后30d）表達(dá)緩慢下調(diào)（FP-KMlt;10） （圖6-D）?？傮w來看， CmGRFs 和CmGIFs的表達(dá)存在組織特異性，表明了其可能參與板栗不同組織的生物學(xué)過程。

2.7 CmGRFs和 CmGIFs 在不同脅迫下的表達(dá)

分析 CmGRFs 和CmGIFs在冷凍、熱休克、干旱脅迫，以及在栗癭蜂侵染下的表達(dá)譜，以探討其在板栗應(yīng)對環(huán)境脅迫中的潛在功能（圖7）。結(jié)果表明，CmGRF3的表達(dá)水平在熱休克處理4h后顯著上調(diào)，CmGRF2在冷凍脅迫下的表達(dá)持續(xù)升高，而CmGRF4在冷凍和熱休克處理下均幾乎不表達(dá)（FP-KMlt;2 ）[4]。其余CmGRFs的表達(dá)水平在冷凍和熱休克脅迫下均顯著下調(diào)（圖7-A）4。在不同程度干旱脅迫下，燕山早豐和大板紅板栗中的CmGRFs表達(dá)幾乎無差異（FPKM lt;2 （圖7-B）。栗癭蜂是影響板栗生產(chǎn)的主要害蟲之一，幼蟲會危害芽和葉片，導(dǎo)致形成各種蟲癭[38]。與對照相比，CmGRF2在栗癭蜂形成蟲癭的初期階段（4月7日）表達(dá)水平較高，隨后顯著下調(diào)（圖7-C）[3]。此外，在栗癭蜂形成蟲癭的初期階段，10個CmGRFs在Hongli（HL：易受栗癭蜂侵染）中的表達(dá)明顯高于Shuhe_Wuyingli（SW：對栗癭蜂侵染有部分抗性）的表達(dá)（圖7-D）[39]。值得注意的是，CmGRF2、CmGRF3和CmGRF7在栗癭蜂侵染的葉片中的表達(dá)顯著高于在蟲癭中的表達(dá)（圖7-E）。

CmGIFs的表達(dá)在上述幾種環(huán)境脅迫下表現(xiàn)出不同的趨勢。例如，CmGIF3在冷凍脅迫下的表達(dá)顯著上調(diào)，而在熱休克處理4h到12h內(nèi)，表達(dá)水平先上升后下降（圖7-A）。CmGIF3在燕山早豐和大板紅板栗的表達(dá)隨著干旱脅迫的持續(xù)而顯著上調(diào)（圖7-B）。與對照相比， CmGIFI 在栗癭蜂侵染初期階段（4月7日）形成蟲癭中的表達(dá)顯著上調(diào)（圖7-C）[38]。此外，在栗癭蜂形成蟲癭的初期階段，CmGIFI在Hongli（HL：易受栗癭蜂侵染）中的表達(dá)顯著高于Shuhe_Wuyingli（SW：對栗癭蜂侵染有部分抗性）（圖7-D）[3]。另外，CmGIF1在蟲癭中的表達(dá)水平顯著高于在栗癭蜂侵染的葉片中（圖7-E）。

2.8 CmGRFs和CmGIFs的RT-qPCR分析

通過RT-qPCR實驗驗證CmGRFs和CmGIFs在板栗種仁不同發(fā)育時期的表達(dá)水平（圖8）。從結(jié)果來看，CmGRF1/2/6/7/8的表達(dá)水平隨板栗種仁的發(fā)育而下調(diào)，并在花后100d達(dá)到最小值。CmGRF3/9/10的表達(dá)水平在板栗種仁發(fā)育過程中呈先升高后降低的趨勢。其中，CmGRF3/9在花后70d達(dá)到峰值后開始逐漸下調(diào)，CmGRF10在花后80d達(dá)到峰值。CmGRF4/5在種仁發(fā)育過程的表達(dá)變化相似，都在花后100d達(dá)到峰值。此外，CmGIF2和CmGIF3的表達(dá)水平在種仁發(fā)育過程中逐漸下調(diào)，而CmGIFI的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化?？偟膩碚f，RT-qPCR實驗結(jié)果與RNA-seq分析結(jié)果具有相似的變化趨勢，驗證了RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠度。

3討論

GRF是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長和發(fā)育中起關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞增殖、器官發(fā)生和脅迫反應(yīng)[46-47]。GRF基因家族已在眾多植物中被鑒定和系統(tǒng)表征，如擬南芥[48]、水稻[、大豆[49]和蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）[5o]。GIF充當(dāng)轉(zhuǎn)錄共激活因子，可與GRF形成蛋白復(fù)合物共同發(fā)揮作用調(diào)控植物的生長發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境脅迫[47]。然而，GRF和GIF尚未在板栗中被鑒定和系統(tǒng)表征。

筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，板栗基因組中有10個CmGRFs和3個CmGIFs成員。這些成員符合GRF和GIF基因家族的基本特征，所有 CmGRFs 編碼的蛋白均包含WRC和QLQ結(jié)構(gòu)域，所有 CmGIFs 編碼的蛋白均包含SNH結(jié)構(gòu)域。SNH結(jié)構(gòu)域與QLQ結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成GRF-GIF復(fù)合體，共同作用于下游靶基因，這是CmGRFs和CmGIFs相互作用影響基因表達(dá)的分子基礎(chǔ)[29]。系統(tǒng)發(fā)育分析將10個CmGRFs分成4個分支，所有 CmGRFs 均與雙子葉植物的GRFs基因相距較近，而與水稻GRFs相距較遠(yuǎn)，這體

A.CmGRFs和CmGIFs在不同冷凍 （-15^°C） 和熱休克 45^°C） 脅迫時間的表達(dá)；CK為對照，D5h、D10h和D15h分別為冷凍 （-15^°C）5，10 和15h，G4h、G8h和G12h分別為熱休克 （45^°C）4.8 和 12h ;B.CmGRFs和CmGIFs在干旱脅迫0、10、20、30、40d的大板紅（DBH）和燕山早豐（YSZF）中的表達(dá);C.CmGRFs和CmGIFs在蟲癭（Gail）（由板栗葉片遭受栗癭蜂浸染形成）不同階段（4月7日、4月10日、4月15日、4月26日）的表達(dá);D.CmGRFs和CmGIFs在Hongli（HL：易受栗癭蜂侵染）和Shuhe_Wuyingli（SW：對栗癭蜂侵染有部分抗性）遭受栗癭蜂侵染葉片不同階段（4月7日、4月15日、4月26日）中的表達(dá);E.CmGRFs和CmGIFs在栗癭蜂侵染的葉片（Galedleaves）和誘導(dǎo)形成蟲癭（Insectgalls）的表達(dá)。

現(xiàn)了雙子葉植物中GRFs具有更近的遺傳距離。高度相似的序列和結(jié)構(gòu)往往意味著發(fā)揮相似的功能[5]。Group1分支中的AtGRF9過表達(dá)會限制擬南芥早期發(fā)育葉片中的細(xì)胞增殖[2，而AtGRF7作為多種滲透應(yīng)激反應(yīng)基因的抑制因子發(fā)揮作用，以防止生長抑制[]。CmGRF4/5與AtGRF7/9位于同一分支，并且具有相似的序列信息，這表明CmGRF4/5可能通過增強細(xì)胞活性來促進(jìn)生長發(fā)育。Group2中小寫字母表示各時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的FPKM之間的差異顯著性，大寫字母表示各時期RT-qPCR結(jié)果之間的差異顯著性。

AtGRF4可以抑制擬南芥THALIANA2（KNAT2）啟動子活性[2]，OsGRF1/10在莖尖分生組織、葉原基以及剛出現(xiàn)的葉中有較高表達(dá)，在表皮以及節(jié)間分生組織的維管束周圍有較高表達(dá)[1，OsGRF6是水稻生長和耐冷性之間平衡的重要調(diào)節(jié)因子[53]。因此，位于Group2中的CmGRF1/10可能在幼嫩組織及冷脅迫上發(fā)揮重要作用。Group3中AtGRF1的過表達(dá)導(dǎo)致葉片增大[48]，以及花序莖的延遲抽，OsGRF2在成熟植株的伸長葉片中有較高表達(dá)，OsGRF7主要在葉片、節(jié)間、腋芽和幼嫩的花序中表達(dá)[54。位于Group3中的CmGRF3/8/9可能與花發(fā)育有關(guān)。類似的，系統(tǒng)發(fā)育分析將3個CmGIFs分到3個分支中。OsGIF1在營養(yǎng)和生殖發(fā)育過程中起重要作用[]，AtGRF1和AtGIF1分別充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子和共激活因子，并且是參與調(diào)節(jié)葉片和花瓣生長的復(fù)合物的一部分[4]。因此， CmGIF2 可能在板栗的生殖和營養(yǎng)生長上也發(fā)揮相似功能。

基因復(fù)制不僅有助于基因家族的擴張，還對基因的功能分化以及植物對環(huán)境變化的適應(yīng)具有重要的意義[56-58]。串聯(lián)重復(fù)和節(jié)段重復(fù)被認(rèn)為是基因家族擴張的主要復(fù)制模式[59]。由于全基因組加倍（whole-genomeduplication，WGD）在植物基因組中普遍存在，并且WGD后通常伴隨著大量染色體重排，這導(dǎo)致了節(jié)段重復(fù)的頻繁發(fā)生[。復(fù)制類型分析發(fā)現(xiàn)10個CmGRFs中的4個，以及3個CmGIFs中的2個是通過節(jié)段復(fù)制形成的，這表明節(jié)段復(fù)制是CmGRF和CmGIF家族的主要驅(qū)動力。啟動子區(qū)域的順式作用元件通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用在調(diào)控植物基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用[。在預(yù)測到的CmGRFs和CmGIFs的啟動子區(qū)域順式作用元件中，ARE最豐富，其次是G-box和ABRE。此外，一些重復(fù)基因的順式作用元件的數(shù)量和類型存在差異。例如，CmGRF1啟動子區(qū)域存在3個溫度脅迫響應(yīng)（LTR），而其節(jié)段復(fù)制基因CmGRF10僅有1個； CmGRFlO 的啟動子區(qū)域有1個干旱響應(yīng)元件（MBS），而其節(jié)段復(fù)制基因CmGRF1則沒有。這表明節(jié)段復(fù)制基因啟動子區(qū)域的順式作用元件并不一致，可能導(dǎo)致了在不同發(fā)育階段和不同環(huán)境脅迫下基因表達(dá)的特異性調(diào)控。在CmGRFs和CmGIFs的啟動子區(qū)域還預(yù)測到大量其他順式作用元件，主要涉及生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)以及激素響應(yīng)，如Box-4、G-boX、ARE、LTR、ABRE元件等。這些結(jié)果暗示了

CmGRFs和 CmGIFs 在板栗生長發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)方面的多樣化功能。筆者在本研究中預(yù)測到可能作用于上述順式作用元件的126個轉(zhuǎn)錄因子，涉及34個轉(zhuǎn)錄因子家族，數(shù)量最多的5個轉(zhuǎn)錄因子家族是MYB、Dof、bHLH、C2H2和TCP。MYB是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長發(fā)育與響應(yīng)環(huán)境脅迫中扮演重要角色[61-62]。擬南芥中的At-MYB96被干旱脅迫顯著誘導(dǎo)，而過表達(dá)該基因可以顯著提高擬南芥的耐旱性[3]。蘋果中的MdMYB23在冷脅迫下顯著誘導(dǎo)，其過表達(dá)增強了轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織和擬南芥植物的耐寒性[4]。其余預(yù)測到的轉(zhuǎn)錄因子家族，如Dof、bHLH、C2H2和TCP，也被廣泛報道參與調(diào)控植物的生長發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)[65-68]。然而，就本研究結(jié)果而言，預(yù)測到的轉(zhuǎn)錄因子是否作用于順式作用元件，以及是否調(diào)控CmGRFs和CmGIFs的表達(dá)來影響板栗的生長發(fā)育和對環(huán)境脅迫的響應(yīng)，仍需進(jìn)一步研究。

大量研究報道了GRFs和GIFs通常在發(fā)生細(xì)胞增殖的生長區(qū)域中高表達(dá)，如發(fā)芽的種子、愈傷組織和芽[17，69-71]。CmGRFs和CmGIFs在板栗各組織中具有不同的表達(dá)模式，這些組織特異性的表達(dá)模式表明CmGRFs和CmGIFs可能參與組織特異性發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。一些 CmGRFs 成員在組織發(fā)育早期表現(xiàn)出比發(fā)育后期更高的表達(dá)水平，如CmGRF2在花芽發(fā)育的早期表達(dá)水平顯著高于花發(fā)育晚期。實際上，GRF基因在活躍生長組織中的表達(dá)水平顯著高于成熟組織，并且GRF轉(zhuǎn)錄水平隨著植物衰老而降低[72-73]。AtGRF的表達(dá)水平隨著擬南芥的生長發(fā)育而降低[2。水稻中的GRF基因在芽和未成熟葉片中具有較高的表達(dá)水平[73]。CmGRF3在板栗雌花中高表達(dá)，而在雄花中幾乎不表達(dá)（FPKM ^lt;1 ），暗示了其可能與雌雄花分化或發(fā)育有關(guān)。大量研究報道了GRF和GIF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對花器官發(fā)育的重要作用[74-75]。水稻中OsGRF6的反義抑制或OsmiR396d（靶向OsGRF6轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）的超表達(dá)會導(dǎo)致花器官發(fā)育畸形[7。擬南芥gifl/2/3三突變體植株的花器官嚴(yán)重發(fā)育不良，表現(xiàn)為雌蕊分裂、胚囊缺失和花藥發(fā)育不全[35]。GRF和GIF在植物響應(yīng)環(huán)境脅迫中同樣發(fā)揮重要作用[72，77]。擬南芥中敲除AtGRF7顯著增強了植株的耐鹽和抗旱性[78]。本研究中CmGRFs在兩個板栗品種干旱脅迫中表達(dá)水平幾乎無變化，而CmGIF3則在兩種板栗干旱脅迫下均顯著上調(diào)表達(dá)，這暗示了 CmGIF3 可能未通過與 CmGRFs 協(xié)同響應(yīng)干旱脅迫。模式植物的研究中已經(jīng)證明了一些GRF和GIF在響應(yīng)環(huán)境脅迫中的作用。例如，在滲透脅迫下，AtGRF7蛋白可以與脫水反應(yīng)元件結(jié)合形成特定蛋白以減少損傷[78]。水稻 OsGRF4，OsGRF6 和Os-GRF8參與調(diào)控氮同化過程，可以增強水稻對缺氮條件下的適應(yīng)性以保持產(chǎn)量]。在玉米中過表達(dá)Zm-rGRF1則顯著提高了葉片對紫外線抑制生長的抵抗能力[8]。筆者在本研究中使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)充分表征了CmGRFs和CmGIFs在5種板栗組織中的不同發(fā)育時期以及4種環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式，為后續(xù)研究板栗GRF和GIF基因的生物學(xué)功能提供了參考。

4結(jié)論

筆者在本研究中首次對板栗中的GRF和GIF轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了全基因組鑒定和系統(tǒng)表征。同時，利用RNA-seq數(shù)據(jù)和RT-qPCR技術(shù)分析了其在不同板栗組織以及不同環(huán)境脅迫下的表達(dá)譜，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究CmGRF和CmGIF家族基因的生物學(xué)功能提供理論參考。

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